先天性巨結(jié)腸腸壁神經(jīng)組織免疫組織化學(xué)分析與檢驗(yàn)學(xué)研究

孫 瀾 鄒 偉 劉曉華

（1 遼寧省遼陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 遼陽 111000；2 遼寧省瓦房店市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 瓦房店 116300）

先天性巨結(jié)腸（Hirsch sprung's disease，HD）是小兒外科的常見病，其病理特征是病變腸段黏膜下層及肌層間的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，神經(jīng)纖維的廣泛增生，但在新生兒、嬰幼兒術(shù)后標(biāo)本由于其神經(jīng)節(jié)細(xì)胞本身發(fā)育往往不夠成熟，在病理上易于與其他組織細(xì)胞相混淆。為此我們采用一組單抗及多抗試劑，對腸壁神經(jīng)組織進(jìn)行免疫酶標(biāo)組織化學(xué)染色，以期能夠找到一種特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高的診斷方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇本院2016年1月至2017年10月所保存的HD病理蠟塊資料中隨機(jī)選擇20例，分別對其近端有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段和遠(yuǎn)端無節(jié)細(xì)胞段進(jìn)行研究。正常對照組標(biāo)本取自3年病理尸檢資料中相應(yīng)腸壁組織學(xué)無異常改變者12例。第一抗體神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）抗體，S-100蛋白抗體均為DAKO公司產(chǎn)品。ABC免疫酶標(biāo)試劑盒購自華美生物工程公司上海分公司。

1.2 方法：采用ABC法進(jìn)行免疫過氧化物酶法染色。切取4 μm厚度石蠟切片經(jīng)37 ℃烘片1 h，二甲苯脫蠟，經(jīng)過梯度灑清至蒸餾水洗，為阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用0.3%H2O2甲醇液室溫下作用20 min，再經(jīng)0.05%trypsin消化后加上2%正常馬血清以降低背景的非特異性染色，傾去血清后加入第一抗體于濕盒內(nèi)孵育1 h，經(jīng)PBS洗3次后加入第二抗體（橋抗：biotin-抗兔或抗鼠IgG），室溫下作用30 min后滴加入ABC試劑，最后DAB顯色，甲基綠復(fù)染，中性樹膠封片。

2 結(jié) 果

2.1 NSE染色：正常對照組12例及HD病例20例神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布正常段腸壁的黏膜下層和肌層間神經(jīng)叢中均見有細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NSE染色陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，其細(xì)胞核周圍的雪旺氏細(xì)胞為陰性染色，20例HD病例遠(yuǎn)端無節(jié)細(xì)胞段腸壁內(nèi)不見NSE染色陽性的細(xì)胞，僅見神經(jīng)纖維周圍平滑肌細(xì)胞輕微的非特異性染色。

2.2 S-100蛋白染色：12例正常對照組及20例IID病例節(jié)細(xì)胞分布正常段腸壁神經(jīng)叢中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈陰性染色，而周圍的雪旺氏細(xì)胞為S-100蛋白陽性染色；在20例HD病變腸壁的神經(jīng)叢中只見致密深染的神經(jīng)纖維而無胞質(zhì)淡染的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存在。

3 討 論

神經(jīng)元特異性烯醇酶（Neuron Specific Enolase，NSE）來源于神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維，是一種糖酵介酶，用標(biāo)記的抗NSE抗體于標(biāo)本中的NSE結(jié)合，可清晰地顯示腸黏膜下的神經(jīng)組織[l-2]，如先天性巨結(jié)腸患兒在NSE免疫組化標(biāo)記以后，可表現(xiàn)為無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存在，而神經(jīng)纖維大量增生[3-4]。S-100蛋白存在在神經(jīng)元軸突的外圍細(xì)胞—雪旺氏細(xì)胞內(nèi)，同樣用免疫組化的方法，可將標(biāo)本中的S-100蛋白進(jìn)行標(biāo)記，在切片上清晰顯示。在正常腸壁組織S-100蛋白染色可顯示圍繞神經(jīng)節(jié)-圈的衛(wèi)星細(xì)胞，中間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不被染色而呈“空洞”，在先天性巨結(jié)腸“空洞”結(jié)構(gòu)不存在，而顯示大量增生的神經(jīng)纖維[5-6]。因此采用免疫組化的方法一一多克隆抗體與神經(jīng)組織特異結(jié)合，對于常規(guī)染色難于確定的患兒，具有很大的幫助[7-8]。本組12例正常對照組兒童標(biāo)本神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)對NSE呈明顯陽性反應(yīng)，ABC作為顯示劑結(jié)果為紅色，并清楚地顯示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)及分布，與不著色的結(jié)締組織細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞徑渭分明。對S-100蛋白12例正常對照組標(biāo)本中的雪旺氏細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，在位于神經(jīng)節(jié)周圍的鞘細(xì)胞著色時(shí)，與陰性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形成明顯對照。本組20例先天性巨結(jié)腸兒童狹窄段標(biāo)本對NSE呈陰性反應(yīng)，可明顯確認(rèn)沒有神經(jīng)元存在，S-100蛋白也不顯示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存在，并可顯示增生、雜亂無章的神經(jīng)纖維叢，這些神經(jīng)纖維延伸至固有膜[9]。

上述研究結(jié)果表明，NSE免疫組化法大大提高了病理醫(yī)師對本病黏膜下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的鑒別能力，在很少幾張切片就能顯示結(jié)果，不需傳統(tǒng)大量連續(xù)切片。S-100蛋白因能顯示雪旺氏細(xì)胞，明顯襯托出陰性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，二者結(jié)合起來，就不會把雪旺氏細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與結(jié)締組織混淆起來，為診斷本病提供可靠的科學(xué)依據(jù)[10]。