河西走廊玉米種子攜帶病原菌真菌的研究

鄭天翔曹 禮

(1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000)

河西走廊作為全國(guó)最大的雜交玉米種子生產(chǎn)基地，主要集中于武威、張掖、酒泉三大農(nóng)業(yè)灌溉區(qū)，2013年以來，制種面積每年穩(wěn)定在10萬hm2左右，占全國(guó)制種面積的39.3%，制種產(chǎn)量5.8億kg，占全國(guó)制種量的42.6%[1]，河西走廊玉米種子質(zhì)量對(duì)全國(guó)玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。然而，隨雜交玉米種子生產(chǎn)基地土地連作突出、抗病性差的親本組合大面積單一種植、追求高密度與高水肥的耕作制度改革、氣候變暖而生育期提前和病原越冬基數(shù)增多[2]等因素為玉米苗期、穗部病害、葉部病害等的發(fā)生創(chuàng)造了條件。據(jù)調(diào)查，河西走廊玉米苗枯病在一般地塊發(fā)病率在10%左右，發(fā)病重的地塊40%～60%[3]，穗腐病病株率62.5%～82.2%[4]，葉部病害大斑病病株率39.3%～97.06%、小斑病病株率26.12%～96.57%、彎孢菌葉斑病病株率12.9%～93.22%[5]。致使種子帶菌率上升，種子病原菌結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起種子變色腐爛，種子的發(fā)芽率低、發(fā)芽勢(shì)弱，種子帶菌成為影響河西走廊玉米種子質(zhì)量的制約因素。

各國(guó)對(duì)種子帶菌檢驗(yàn)采用方法不同，國(guó)外早期針對(duì)真菌采用“孵化檢驗(yàn)”或田間種植檢驗(yàn)的方法[6]，后逐漸采用抗生素或其它選擇性媒介、LIST、PCR 等技術(shù)，極大地提高了檢驗(yàn)靈敏度和效率[7]；國(guó)內(nèi)多地對(duì)玉米種子帶菌檢驗(yàn)，認(rèn)為玉米種子帶菌是導(dǎo)致種子活力下降的重要因素[8]，高曉梅等[9-10]報(bào)道遼寧省玉米種子真菌達(dá)16個(gè)屬26個(gè)種，龍書生等[11]鑒定出陜西關(guān)中西部玉米穗粒腐病病穗籽粒表面和內(nèi)部寄藏的真菌有11個(gè)屬14個(gè)種。但作為全國(guó)最大玉米制種基地，河西走廊的種子帶菌情況還未見系統(tǒng)性研究報(bào)道。為此，以河西走廊玉米制種基地生產(chǎn)的種子為研究對(duì)象，檢測(cè)種子帶菌種類、優(yōu)勢(shì)種群，旨在為預(yù)防控制玉米種傳病害、檢驗(yàn)檢疫、藥劑包衣和生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

分別在張掖市12個(gè)制種企業(yè)、武威市4個(gè)制種企業(yè)、酒泉市4個(gè)制種企業(yè)采集新收獲的50個(gè)玉米品種(組合)種子。

1.2 種子帶菌檢測(cè)方法

1.2.1種子外部帶菌檢測(cè)

每個(gè)品種隨機(jī)選取100粒種子，放入滅菌的250 mL三角瓶中，加50 mL無菌水后充分振蕩，吸取10 mL懸浮液，2 000 r/min離心10 min，倒去上清液，加5 mL無菌水均勻懸浮后取出適當(dāng)體積用無菌水進(jìn)行系列梯度稀釋，每個(gè)稀釋梯度菌懸液吸取100 mL涂抹到直徑90 mm的PDA平板上(PDA中加適量乳酸抑制細(xì)菌)，每個(gè)濃度3皿，置20 ℃恒溫箱中黑暗條件下培養(yǎng)觀察，5 d后觀察平板上的菌落，根據(jù)稀釋倍數(shù)和檢測(cè)種子數(shù)計(jì)算種子外部攜帶真菌的孢子負(fù)荷量和檢出真菌的分離比例。每個(gè)供試品種重復(fù)4次[8]。

孢子負(fù)荷量(個(gè)/粒)=(3皿菌落總數(shù)/0.3 mL)×稀釋倍數(shù)×50 mL/100粒；

分離比例(%)=(某類真菌菌落個(gè)數(shù)/菌落總數(shù))×100%。

1.2.2種子內(nèi)部帶菌檢測(cè)

每個(gè)供試品種隨機(jī)選100粒，先將玉米種子在70%酒精中浸15～20 s，然后移入0.1%升汞液中殺菌0.5～1 min，再用無菌水沖洗3次。將經(jīng)表面殺菌的玉米籽粒置于盛有PDA平板上，每皿擺放10粒，每品種重復(fù)3次。于25℃溫箱中培養(yǎng)4～5 d，當(dāng)種子周圍長(zhǎng)出菌絲體或種子表面有霉層時(shí)，將菌絲或霉層移入PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，待長(zhǎng)出籽實(shí)體后進(jìn)行真菌鑒定[8]。

種子帶菌率(%)=(帶菌種子數(shù)/檢測(cè)種子總數(shù))×100%；

某菌分離率(%)=(帶某菌種子數(shù)/檢測(cè)種子總數(shù))×100%。

1.2.3病原真菌的鑒定

根據(jù)分離到的真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)特性，鏡檢病菌形態(tài)特征，并參照相關(guān)真菌鑒定的工具書[12-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米種子外部帶菌情況

從培養(yǎng)平板菌落特征及顯微鏡檢驗(yàn)看，共檢出鐮刀菌屬(Fusariumspp.)、根霉屬(Rhizopusspp.)、青霉屬(Penicilliumspp.)、鏈格孢屬(Alternariaspp.)、凸臍蠕孢屬(Exserohilumspp.)、平臍蠕孢屬(Bipolarisspp.)、黃曲霉(Aspergillusspp.)、枝孢屬(Cladosporiumspp.)、黑孢霉屬(Nigrosporaspp.)、木霉菌屬(Trichodermaspp.)等真菌10個(gè)屬。其中，鐮刀菌主要檢出串珠鐮刀菌(F.moniliforme)和禾谷鐮刀菌(F.graminearum)2個(gè)種；顯微鏡檢驗(yàn)洗滌液時(shí)，除檢測(cè)到上述幾種真菌外，還可檢測(cè)到黑粉菌屬(Ustilagospp.)、腐霉菌屬(Pythiumspp.)2個(gè)屬。

從分離比例和孢子負(fù)荷分析看，各種品種所攜帶的病原真菌種類及數(shù)量、孢子負(fù)荷量均有所差異。其中檢出率最高的是鐮刀菌(Fusariumspp.)，豫玉22分離率最高(達(dá)67.74%)，良玉188分離率最低(為0)，平均分離率41.52%。有27個(gè)品種分離率在43.75%～67.74%之間，高出平均值達(dá)2.23%～26.22%，占分離品種54%；根據(jù)分離率的高低，檢出依次為根霉屬>青霉屬>鏈格孢屬>凸臍蠕孢屬>黃曲霉>平臍蠕孢屬>枝孢屬>木霉菌屬>黑孢霉屬；從每粒種子表面孢子負(fù)荷量分析，品種浚單29、鄭單958孢子負(fù)荷量最高(600個(gè)/粒)，品種良玉188負(fù)荷量最低(116.67個(gè)/粒)，平均負(fù)荷量322.67個(gè)/粒。有21個(gè)品種孢子負(fù)荷量超過平均值，為333.33～600個(gè)/粒，高出平均負(fù)荷量在10.66～277.33個(gè)/粒，占分離品種42%。品種的孢子負(fù)荷量Log值高于平均值2.48的占分離50%。

2.2 玉米種子內(nèi)部帶菌情況

經(jīng)分離培養(yǎng)法檢驗(yàn)，檢出的真菌種類與洗滌培養(yǎng)法檢出的真菌相同，但分離率與帶菌率與洗滌培養(yǎng)法不同。分離結(jié)果顯示，檢出的內(nèi)部帶菌種類間差異比較明顯，鐮刀菌(Fusariumspp.)分離率最高為豫玉22，達(dá)61.11%，玉油1號(hào)、士海718、土海916、海單9號(hào)、登海3737、良玉9、良玉188、華農(nóng)138、華農(nóng)866、中科16等10個(gè)品種上分離最低，為0，平均分離率29.20%，有28個(gè)品種分離率超過平均值，為30.00%～61.11%，高出平均值0.8%～31.91%，占分離品種的56%。根據(jù)分離率的高低，病原菌依次檢出鏈格孢屬>凸臍蠕孢屬>青霉屬>黃曲霉>黑孢霉屬>枝孢屬>木霉菌屬>根霉屬。

試驗(yàn)結(jié)果表明，種子帶鐮刀菌率在品種間也存在不同差異。帶鐮刀菌率最高的是豫玉22、浚單29，為36.67%。除不帶鐮刀菌的10個(gè)品種外，最低的是鄂玉16、濟(jì)玉1號(hào)、大豐30等3個(gè)品種，為3.33%。平均帶鐮刀菌率為12.87%，27個(gè)品種超過平均值，占供試品種的54%；

種子帶菌在品種間也具有一定差別。種子帶菌的主要菌群有鐮刀菌屬、鏈格孢屬、凸臍蠕孢屬、青霉屬、黃曲霉、黑孢霉屬、枝孢屬、木霉菌屬、根霉屬等，還有一些未鑒定的菌群；帶菌率最高是浚單29，為63.33%。最低是華農(nóng)138、華農(nóng)866，為10%。平均種子帶菌率37.60%，帶菌率高于平均值的品種占48%。

2.3 2種方法的比較

從2種方法分離結(jié)果看，一個(gè)共同特點(diǎn)是鐮刀菌(Fusariumspp.)分離頻率最高，且以串珠鐮刀菌(F.moniliforme)和禾谷鐮刀菌(F.graminearum) 2個(gè)種為主，僅鐮刀菌分離率有所差別，洗滌檢驗(yàn)法平均分離率最高達(dá)41.5%，PDA平板法平均分離率最高達(dá)29.20%，二者平均分離率相差12.3%，說明鐮刀菌既可在種子表面腐生，又可內(nèi)藏寄生種子內(nèi)；其次是鏈格孢屬(Alternariaspp.)、凸臍蠕孢屬(Exserohilumspp.)通過PDA平板法分離率較洗滌法高，分別達(dá)15.95%、10.17%，高出6.85%、5.48%。說明鏈格孢屬、凸臍蠕孢屬是玉米種子內(nèi)藏寄生菌；三是黑孢霉屬(Nigrosporaspp.)、黃曲霉(Aspergillusspp.)、木霉菌屬(Trichodermaspp.)在PDA平板法中分離率有所上升，分別為5.91%、8.34%、4.40%，較洗滌法分離率高出4.87%、3.05%、1.02%，這3種菌一直被認(rèn)為是種子的腐生菌，說明玉米種子的寄生性在上升；其他菌在PDA平板法中的分離率低于洗滌法，說明經(jīng)洗滌消毒后外部腐生的數(shù)量在減少。

3 結(jié)論與討論

1) 試驗(yàn)結(jié)果表明，從玉米種子外部和內(nèi)部檢出情況看，攜帶的真菌類群主要有10個(gè)屬，與高曉梅等[9-10]報(bào)道玉米種子攜帶真菌有16個(gè)屬有差異，尚未檢測(cè)到枝頂孢屬(Acremonium)、刺毛霉屬(Actinomucor)、毛殼屬(Chaetomium)、附球菌屬(Epicoccum)、串棒霉屬(Gonatobotrys)、糞殼菌屬(Sordaria)等6個(gè)屬；從分離率的高低分析，表面攜帶優(yōu)勢(shì)種群為鐮刀菌(Fusarium)、根霉菌(Rhizopus)、青霉菌(Penicillium)、鏈格孢菌(Alternaria)，種子內(nèi)部寄藏的真菌主要有鐮刀菌(Fusarium)、鏈格孢菌(Alternaria)、凸臍蠕孢菌(Exserohilum)，這與李健強(qiáng)等[15]、徐秀蘭等[8]報(bào)道相一致；因此，需要密切檢驗(yàn)種子帶菌和監(jiān)測(cè)種子病害的發(fā)生情況。

2) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，河西走廊部分玉米種子帶菌率高，帶菌量大，50個(gè)檢測(cè)品種中，56%的品種帶菌率比平均值高(36.70%)，54%的品種帶菌量比平均值大(332.67個(gè)/粒)；玉米品種間帶菌率及帶菌量存在一定差異，如豫玉22、浚單29、鄭單958等無論外部、內(nèi)部帶菌率和帶菌量均比較高，如鐮刀菌、鏈格孢菌等的帶菌率較高，這與田間苗枯病、頂腐病等苗期病害發(fā)病率在15%～25%之間是相互吻合。玉油1號(hào)、士海718、土海916、海單9號(hào)、登海3737、良玉9、良玉188、華農(nóng)138、華農(nóng)866、中科16等外部帶菌量均比平均值低，內(nèi)部帶菌率為0，田間苗枯病及頂腐病的發(fā)病率均低于5%；分析認(rèn)為，帶菌率和帶菌量高低與品種繁種年份長(zhǎng)短、連作現(xiàn)象、親本組合的抗病性關(guān)系密切。帶菌低的繁種年份較短，一般3～5年。有些親本材料對(duì)優(yōu)勢(shì)種群的抗病性較弱，而親本材料既在河西走廊繁殖，又在河西走廊制種，侵染循環(huán)的周期縮短，造成苗期病害嚴(yán)重發(fā)生。一般帶菌率和帶菌量高的品種在河西走廊繁種年份均在10年以上，土壤連作現(xiàn)象突出，影響土壤中有益微生物數(shù)量和土壤活性[16]，種子帶菌導(dǎo)致土傳病害的加重。

3) 玉米種子分離病菌與玉米果穗腐病具有一定的相關(guān)性。如鐮刀菌、平臍蠕孢、鏈格孢菌、青霉、木霉、曲霉等分別引起穗腐病，黑孢菌引起裂軸病，根霉引起果穗煤污病，枝孢霉引起黑霉病[17]。其中一些病菌是先寄生于葉、莖引起葉部和莖部病害，從苞葉侵染果穗而附著于種子表面，之后逐漸寄藏于種子內(nèi)。如鐮刀菌、平臍蠕孢引起莖基腐病，鐮刀菌、鏈格孢菌引起鞘腐病，鏈格孢菌、平臍蠕孢、枝孢霉引起葉斑病[17]，這些病菌由莖、葉、葉鞘等部位向果穗擴(kuò)展，造成種子帶菌；一些是腐生菌青霉、木霉、曲霉、根霉、黑孢霉等在果穗收獲時(shí)，因受田間鉆蛀性害蟲危害、鮮穗堆集而通風(fēng)不良、涼曬時(shí)遇多雨或潮濕環(huán)境條件等因素影響，腐生菌迅速繁殖附著或侵染種子內(nèi)部，形成致病菌，造成種子帶菌而成為下一季玉米苗期病害主要侵染源；有關(guān)攜帶真菌的寄生部位的研究，馬奇祥等[18]報(bào)道玉米種子外部主要腐生于果皮與種皮(籽實(shí)皮)表面，內(nèi)藏真菌主要寄生于胚乳內(nèi)。這方面報(bào)道還不多，有待進(jìn)一步研究。