豬圓環(huán)病毒2型檢測技術及研究進展

錢坤 任連泉 王敬

摘要：本研究對近年來豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）抗體檢測技術的研究進展進行了綜述，旨在為未來的研究方向提供參考。豬圓環(huán)病毒2型是一種單股環(huán)狀負鏈DNA病毒，具有較強的致病性，可通過呼吸道、消化道進行傳播，以及由母豬傳給胎兒，豬被感染后可直接導致豬群的免疫力下降，引發(fā)豬的多種疾病癥狀，給養(yǎng)豬戶帶來了很大的經(jīng)濟損失。因此，PCV2病毒感染早期診斷對豬的多種疾病綜合防控意義重大，同時可保證豬肉類食品質量安全性。目前，北京、上海、南京等大城市已開始實行部分農(nóng)產(chǎn)品市場準入制，不符合食品安全標準的各類肉、禽、畜產(chǎn)品將被拒絕上市銷售，從而使得以便捷、及時為特點的檢測方式得到快速發(fā)展。

關鍵詞：豬;圓環(huán)病毒2型;病毒分離;檢測方法

中圖分類號：S858.28 文獻標識碼：B文章編號：2095-9737（2019）12-0001-03

Abstract：The recent progress in the detection of antibodies against porcine circovirus type 2 is reviewed in this study， aiming to provide a reference for future research. Porcine circovirus type 2 （PCV2） is a single strand annular negative DNA virus. It has strong pathogenicity and can be transmitted through porcine respiratory tract， alimentary tract and sow to fetus. The infection of pigs can directly lead to the decline of immunity of pigs and cause many diseases of pigs， which brings great economic losses to pig farmers. Therefore， the early diagnosis of PCV2 infection is of great significance to the comprehensive prevention and control of various diseases in pigs， and it can also ensure the quality and safety of pork foods. With the improvement of living standard， people pay more and more attention to food safety. At present， Beijing， Shanghai， Nanjing and other big cities have begun to implement market access system for some agricultural products. All kinds of meat， poultry and livestock products that do not meet the food safety standards will be refused to be listed and sold， so that the detection methods characterized by convenience and timeliness can be developed rapidly.

Key words：Porcine circovirus type 2; virus isolation; detection method

1 臨床癥狀

豬圓環(huán)病毒一種單股環(huán)狀負鏈DNA病毒，是已知最小病毒之一，直徑為14～25 nm[1]。對于生長發(fā)育階段的豬，感染PCV2病毒后多誘發(fā)呼吸道綜合征，臨床表現(xiàn)為生長發(fā)育緩慢，豬貧血導致皮膚蒼白、豬毛粗糙、間斷性咳嗽、豬群體質變差等;皮炎、腎衰竭綜合征也主要在發(fā)育階段豬群中發(fā)生，多發(fā)于炎熱的季節(jié)，臨床表現(xiàn)為皮膚、耳部、背部常出現(xiàn)圓形、不規(guī)則的隆起，呈現(xiàn)紅色或紫色，后期演變?yōu)榧t色結痂;對于斷奶后的仔豬，感染PCV2病毒后多誘發(fā)多系統(tǒng)衰竭綜合征，臨床表現(xiàn)為氣喘、咳嗽、日漸消瘦、食欲食量減退等;對于剛出生的仔豬，感染PCV2病毒后多誘發(fā)先天性震顫，臨床表現(xiàn)為共濟失調、震顫等癥狀;母豬感染PCV2病毒后，臨床表現(xiàn)為食欲不振、精神萎靡、呼吸困難、發(fā)情延遲或不孕、流產(chǎn)或早產(chǎn)等癥狀[2]。由于PCV2感染誘發(fā)疾病較多，且疾病混合感染率所誘發(fā)的可能性較高，僅根據(jù)臨床癥狀進行判斷很難確診，因此在臨床表現(xiàn)癥狀的基礎上仍需借助于病毒分離、血清學檢測、分子生物學檢測等結果加以確診。

2 診斷

2.1 病毒分離法

病毒分離是常用的方法，該方法是取PCV2感染發(fā)病豬的組織（肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結、肺部、血液等）經(jīng)磨碎、提取液混合、離心取上清、溶劑抽提等步驟，然后接種于無PCV污染的豬腎細胞系（PK-15）進行PCV2病毒的分離培養(yǎng)。伊秀鳳[3]等采用多系統(tǒng)衰竭綜合征癥狀的豬腹股溝淋巴結、腎臟組織加液氮研磨、生理鹽水稀釋、凍融、離心、取上清過濾，經(jīng)PCR鑒定為PCV2陽性，然后取分離液接種于PK-15細胞懸液中，37℃培養(yǎng)，細胞形成單層后，棄去生長液加入D-氨基葡萄糖處理，處理后加入新生豬血清的DMEM維持液培養(yǎng)48 h獲取病毒。

2.2 免疫組化法

徐恒[4]采用PCV1和PCV2病毒及其純化蛋白作為抗原，首先采用IFA和ELISA篩選，得到4株雜交瘤分別與PCV1和PCV2進行反應，得到4株抗制備的腹水分別經(jīng)IFA、間接ELISA法、Western-blot、免疫組化法、病毒-抗體中和試驗進行檢測和鑒定，結果顯示1E8和5G4對組織中的PCV2抗原具有較好的反應性。施旅娟[5]等采用9頭32日齡PCV2陰性的仔豬，隨機分為3組，分別為對照組、PCV2接種組、PCV2接種后用鑰匙孔血藍蛋白刺激組，接種后32天取豬腹股溝淺淋巴結切片，采用免疫組化法對病毒進行定位檢測，顯示PCV2病毒主要存在于淋巴小結的上皮巨噬細胞中。

2.3 抗原捕獲ELISA

2002年，McNeilly[6]等以PCV2抗體為工具，建立了抗原捕獲ELISA法用于診斷豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，并與病毒分離、免疫組化法和PCR方法進行對比。

2.4 PCR方法

李婧雅[7]等采用GenBank數(shù)據(jù)庫中的PCV2病毒開放閱讀框2（ORF2）基因的保守序列設計了一對特異性引物。建立了檢測PCV2病毒的PCR方法，并應用該檢測方法對浙江省地區(qū)的142份病料進行檢測，檢測結果顯示PCV2感染率高達56.3%。李英[8]采用針對PCV2病毒ORF2設計特異性引物，建立檢測PCV2病毒的PCR檢測方法，并對山東省日照市某規(guī)?；i場患有多系統(tǒng)衰竭綜合征的10頭病豬進行PCV2的檢測，結果顯示7頭呈現(xiàn)陽性。金任毛等[9]為了了解豬養(yǎng)殖場PCV2感染的情況，采用已建立的PCV2病毒PCR檢測方法對取自廣東省的7個養(yǎng)豬場的樣本（豬淋巴結、全血、血清）進行檢測，結果顯示，7個養(yǎng)豬場陽性檢出率高達100%，腹股溝淋巴結檢出率最高，為85.71%，其次為全血，為72.86%，血清的檢出率最低，為37.14%。

2.5 多重PCR

賀會利等[10]根據(jù)GenBank中報道的PCV2和PCV3病毒全基因序列，在建立各自單項PCR檢測方法的基礎上，篩選雙重PCR最佳條件，建立PCV2和PCV3雙重PCR檢測方法，應用該檢測方法對73份臨床豬病料進行PCV2和PCV3檢測，檢測符合率為100%。王立嬌等[11]建立一種可同時檢測PCV1和PCV2病毒的雙重PCR檢測方法，結果顯示，雙重PCR方法對PCV1和PCV2的檢測靈敏度分別為1.7×103 copies/μL和4×103 copies/μL，采用該方法對2013～2017年15個豬場的145例斷奶仔豬樣本的檢測結果顯示，PCV1和PCV2陽性檢出率分別為11.7 %和77.2%，與單PCR檢測結果對比無顯著差異。季程遠等[12]根據(jù)GenBank中PCV2和PCV3的全基因組序列，設計了2對特異性引物，通過對擴增條件的優(yōu)化，建立了同時檢測PCV2和PCV3病毒的雙重PCR檢測方法，該方法可同時擴增PCV2的266 bp和PCV3的594 bp特異性片段，最低檢出量均為100 copies/μL，采用該方法對廣西境內的100份健康屠宰豬淋巴結樣品檢測，并與單一PCR進行對比，結果顯示，單一和雙重PCR檢測結果一致，符合率均為100%。

于靜等[13]根據(jù)PCV2病毒ORF2基因保守區(qū)，設計了熒光定量聚合酶鏈式反應引物，利用SYBR Green作為熒光染料建立了一種定量檢測PCV2的PCR方法，結果顯示最低檢出量為10 copies/μL，利用該方法對34份PCV2陽性臨床樣本進行檢測，檢測符合率為100%，明顯高于普通PCR檢測結果。郭慧娟等[14]根據(jù)PCV1和PCV2全基因序列，選取PCV2 CaP基因中相對保守而不同于PCV1的序列，設計一對SYBR Green熒光定量PCR引物，建立了一種檢測PCV2的SYBR Green熒光定量PCR方法，結果顯示，該方法最低檢出量到10 copies/μL，比普通PCR檢測方法靈敏度高1000倍。馮華等[15]采用PCV2 ORF2基因序列，構建pMD19T-ORF2重組質粒作為陽性標準品，設計特異引物，建立了一種基于SYBR Green的PCV2熒光定量PCR檢測方法，結果顯示，該方法檢出量為3×102 copies/μL，而普通PCR檢出量僅有3×104 copies/μL，采用該方法對38個樣本進行檢測，陽性檢出率為81.5%，而常規(guī)PCR檢出率僅為68.4%。

2.6 PCR產(chǎn)物限制性長度多態(tài)性分析法

郭龍軍等[16]為了了解我國PCV2病毒流行毒株遺傳變異情況，選用分離得到的19株PCV2毒株進行PCR擴增，采用AccⅠ和FbaⅠ內切酶對19株病毒基因PCR擴增產(chǎn)物進行了酶切和限制性片段長度多態(tài)性分析，該方法可以作為PCV2流行毒株分型鑒別的一種手段。

3 結語

病毒分離僅得到了目標病毒，仍需借助于間接免疫熒光實驗（IFA）、免疫組織化學染色法、PCR或電子顯微鏡觀察，確認病毒的分離情況。由于PCV2病毒的分離步驟繁雜費時、費力，不適用于PCV2病毒的快速診斷。間接免疫熒光試驗（IFA）主要用于PCV2病毒分離效果的鑒定以及檢測發(fā)生病變的組織或豬源細胞的感染情況，既可用于檢測特異性的抗原，可以用于檢測特異性的抗體。免疫組化法（IHC）是將動物組織或細胞中的某些化學成分提取、分離出來，以此成分作為抗原或半抗原，經(jīng)免疫獲取抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的抗原物質。但是，由于抗原和抗體結合形成免疫復合物無色，因此，必須經(jīng)化學方法將抗原和抗體反應部位顯示出來，進而對組織或細胞中的抗原進行定性、定位、定量研究。該方法的優(yōu)勢是可以對攜帶抗原的細胞、組織的大體形態(tài)進行評價，用普通顯微鏡在日光下就可以進行觀察。

但是，該操作比較繁瑣，時間較長，而且必須在處理中去除內源過氧化物酶對反應的干擾?？乖东@ELISA法能很好的鑒別多系統(tǒng)衰竭綜合征和PCV2的感染，為多系統(tǒng)衰竭綜合征和PCV2的亞臨床感染的診斷提供了一種很好的檢測手段。PCR一種檢測速度快、特異性強、操作方便的診斷方法，隨著分子生物學不斷的發(fā)展，PCR在疾病病原檢測中已得到了廣泛的應用。PCR一種檢測速度快、特異性強、操作方便的診斷方法，隨著分子生物學不斷的發(fā)展，PCR在疾病病原檢測中已得到了廣泛的應用。

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