抗菌肽及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用（二）

文/王玉堂

上接2019年2期

用藥指導(dǎo)

四、魚類抗菌肽的生物學(xué)活性與功能

（一）生物活性

魚類抗菌肽是魚體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。當(dāng)魚體受到損傷或受到病原侵襲時(shí)，能迅速產(chǎn)生抗菌肽殺傷病原微生物，防御入侵。其合成速度快，在體內(nèi)擴(kuò)散迅速而靈活的特點(diǎn)是其它大分子蛋白質(zhì)（如抗體）和免疫細(xì)胞所不具備的。細(xì)菌和病毒對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的影響越來(lái)越嚴(yán)重，而且沒(méi)有一種有效的藥物來(lái)抑制病原體的感染，抗菌肽的鑒定和特點(diǎn)日益受到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)界的重視。編碼Ple前肽原的基因組序列已經(jīng)從刺泥鰈中分離出來(lái)，在無(wú)毒啟動(dòng)子的控制下成功克隆到載體上，通過(guò)這種結(jié)構(gòu)，生物活性的Ple轉(zhuǎn)化到魚體細(xì)胞株上，并持續(xù)增長(zhǎng)了2年多。對(duì)于Ple處理加工、成熟、分泌（通過(guò)使用綠熒光蛋白融合技術(shù)）的研究，分泌的重組Ple抗菌肽具有很高的抗菌活性（在未經(jīng)過(guò)濃縮的細(xì)胞懸液中發(fā)現(xiàn)），在此之前沒(méi)有別的重組Ple抗菌肽或魚體抗菌肽表達(dá)到這種程度。這樣一個(gè)重組Ple抗菌肽或其它相關(guān)抗菌肽的過(guò)度表達(dá)可能會(huì)增加發(fā)現(xiàn)新的抗菌藥物的機(jī)會(huì)。張寧應(yīng)用分子生物學(xué)手段和生物信息學(xué)手段，通過(guò)化學(xué)合成從海馬體內(nèi)得到了足量的抗菌肽HKPLP。HKPLP對(duì)10種人和魚類致病或條件致病菌株的活性實(shí)驗(yàn)表明，HKPLP對(duì)大多數(shù)的Gram〈+〉菌和Gram〈-〉菌都敏感，其最小抑制濃度（MIC）大多不超過(guò)16μg/mL，對(duì)白色念珠菌的MIC為32μg/mL，對(duì)銅綠色假單胞菌、副溶血弧菌和鰻弧菌等3株魚類致病菌的作用較弱。盡管HKPLP對(duì)人紅細(xì)胞有一定的溶血活性，但對(duì)大多數(shù)測(cè)試菌株有效抑制濃度下，溶血活性不超過(guò)20%。此外還發(fā)現(xiàn)HKPLP對(duì)Hela、U251和C6等幾種致癌細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒作用，IC〈50〉為18μg/mL～40μg/mL，且該作用發(fā)生迅速，可能與海馬的抗腫瘤活性有關(guān)。

Pan CY.Chan JY等人從鱸魚鰓中分離得到的Epinecidin-1抗菌肽。鱸魚Epinecidin-1的多克隆免疫組織化學(xué)分析表明，這種抗菌肽和它的抗體局限分布于鰓和小腸內(nèi)。鱸魚的2個(gè)合成肽g-Ple22-51和g-Ple22-42對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑菌活性。此外，在鱸魚和羅非魚體內(nèi)注射弧菌屬vulnificus后，抗菌肽通過(guò)處理能夠顯著增加魚的存活量，這些結(jié)果對(duì)于研制魚類病原感染的預(yù)防劑和治療劑提供了一定的依據(jù)，特別是對(duì)魚類的細(xì)菌感染中的免疫缺陷起到了改善作用。生長(zhǎng)于極地海洋環(huán)境的魚類，其血清具有高水平的抗凍蛋白（AFP）或抗凍糖蛋白（AFGP），能夠通過(guò)阻止冰晶的形成而降低結(jié)冰溫度，它成為第二個(gè)常用的外源基因，通過(guò)轉(zhuǎn)AFP基因以提高受體魚的抗凍能力。在鰈形目魚類中發(fā)現(xiàn)了分子量較大的抗菌肽，它們具有相似的結(jié)構(gòu)特征，均富含丙氨酸和α-螺旋結(jié)構(gòu)。此分子的發(fā)現(xiàn)和對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的深入研究，將可促進(jìn)轉(zhuǎn)抗凍蛋白基因魚的培育進(jìn)程。

（二）抗菌肽的功能

綜上所述，可將抗菌肽的功能概括為以下幾個(gè)方面：

一是抗細(xì)菌功能。陽(yáng)離子抗菌肽最顯著的功能就是抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌以及革蘭氏兼氣性細(xì)菌。大多數(shù)的陽(yáng)離子抗菌肽都會(huì)與細(xì)胞質(zhì)膜相互作用，從而抑制或殺滅細(xì)菌。研究發(fā)現(xiàn)，真鯛、虹鱒、斑點(diǎn)叉尾鮰等魚類的抗菌肽對(duì)致病性殺鮭氣單胞菌、鰻弧菌、鮰愛(ài)德華氏菌、熒光假單胞桿菌和魯氏耶爾森氏菌等都有較強(qiáng)的殺滅或抑制能力?？咕呐c細(xì)菌相互作用的驅(qū)動(dòng)力主要是因?yàn)榭咕木哂袃捎H性結(jié)構(gòu)，即親水區(qū)域（與水或帶負(fù)電荷的殘基結(jié)合）和疏水區(qū)域（與脂質(zhì)結(jié)合），這些結(jié)構(gòu)可以使得抗菌肽很好地與兩親性分子結(jié)合，特別是易與負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合，通過(guò)破壞膜或使膜通透性增加殺死靶細(xì)胞。

二是抗病毒功能?？咕囊舱故境隽艘种撇《靖腥镜哪芰?，主要以陽(yáng)離子抗菌肽為代表。受影響的病毒主要包括RNA病毒和DNA病毒，但無(wú)包膜病毒、貓杯狀病毒、艾柯病毒例外。抗菌肽的抗體病毒活性主要與病毒的過(guò)程（推測(cè)可能是由于抗菌肽與病毒或細(xì)胞表面的磷脂結(jié)合，從而阻止病毒粒子與宿主細(xì)胞的融合）以及病毒包上的病毒外殼蛋白直接作用有關(guān)。但是，僅僅根據(jù)抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)似乎無(wú)法對(duì)其抗病毒活性進(jìn)行預(yù)測(cè)。例如，α-螺旋結(jié)構(gòu)的天蠶素、Clavanins肽和LL-37抗菌肽已被證實(shí)幾乎不會(huì)導(dǎo)致單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）失活，而蛙皮素、Dermaseptin和蜂毒肽卻顯示出相當(dāng)強(qiáng)的HSV活性。此外，β折疊肽如預(yù)防素、鱟素、宿主防御肽Protegrins以及β轉(zhuǎn)折肽乳鐵肽也都表現(xiàn)出了對(duì)HSV較高的抑制活性。然而，Protegrin類似物因缺乏一個(gè)或兩個(gè)二硫鍵而使其表現(xiàn)出不同的抗HSV活性?？梢?jiàn)抗菌肽的不同結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出不同的抗病毒能力。

三是抗真菌功能。近年來(lái)，抗菌肽的抗真菌能力逐漸被人們所認(rèn)知。最初人們認(rèn)為抗菌肽主要是參與真菌細(xì)胞的裂解過(guò)程或干擾真菌細(xì)胞壁的形成，從而對(duì)真菌產(chǎn)生作用。然而，近年來(lái)大量的研究表明，天蠶素、果蠅抗菌肽、線肽素、貽貝素、蝎血素以及人工改造的各種抗菌肽等對(duì)真菌都有一定的活性，且抗真菌的機(jī)理也是多種多樣。值得注意的是，抗菌肽的抗真菌活性往往與其相對(duì)豐富的極性氨基酸和中性氨基酸有關(guān)，由此推測(cè)抗菌肽真菌活性與其獵物的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

四是抗寄生蟲功能?？咕膶?duì)生物體內(nèi)的寄生蟲具有殺滅作用，并對(duì)寄生蟲在宿主間的傳播有預(yù)防作用。蛙皮素2是第一個(gè)被證明具有抗原蟲活性的抗菌肽，可致草履蟲腫脹和破裂死亡。一種?；铣煽咕?，oct-CA(1-7)-M（2-9）已被證明能夠安全地治療利什曼原蟲引發(fā)的自然獲得性犬利什曼病?？咕牡目辜纳x作用機(jī)制尚不明確，推測(cè)可能為膜攻擊性或胞內(nèi)殺傷機(jī)制。抗菌肽作用于質(zhì)膜后，損壞質(zhì)膜形態(tài)，形成離子通道或出現(xiàn)暫時(shí)性的孔洞，導(dǎo)致膜的完整性破壞和功能喪失，造成細(xì)胞崩解或死亡?；蚴峭ㄟ^(guò)影響胞內(nèi)細(xì)胞器、核酸及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方式干擾細(xì)胞的正常代謝過(guò)程，從而殺傷寄生蟲。

五是抗腫瘤細(xì)胞的功能。一些陽(yáng)離子抗菌肽具有獵物的抗癌功效，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都表現(xiàn)出強(qiáng)有力的殺傷作用，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞溶解或凋亡。通常人們將具有抗體細(xì)胞的抗菌肽稱為“抗癌肽”。目前大量的研究都集中在抗菌肽對(duì)宮頸癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞的殺傷作用及劑量相關(guān)效應(yīng)方面。且研究結(jié)果表明，大部分抗癌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用具有特異性，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)害，這給抗癌新藥物的研發(fā)提供了新方向。

六是免疫增強(qiáng)功能?？咕某丝咕钚?，也參與機(jī)體的代謝和維持穩(wěn)定等生命活動(dòng)。一些魚可以通過(guò)皮膚分泌釋放具有毒性兼溶血活性的表面活性物質(zhì)來(lái)預(yù)防肉食動(dòng)物捕殺。如從真鯛上分離到的3種抗菌肽對(duì)人的紅細(xì)胞也具有溶血活性?？咕牡拿庖咴鰪?qiáng)功能主要表現(xiàn)在促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖，提高宿主抗感染能力，調(diào)節(jié)免疫因子活性，抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)，激活特異性免疫等。

五、抗菌肽的作用機(jī)制

就目前的研究結(jié)果，抗菌肽的作用機(jī)制大體上有以下幾個(gè)方面：

（一）抗真菌機(jī)制

到目前為止，有關(guān)抗菌肽抗微生物的機(jī)理研究較多沒(méi)有定論，普遍認(rèn)為存在兩種機(jī)制。一是細(xì)胞膜操作機(jī)制，認(rèn)為抗菌肽是通過(guò)與細(xì)胞膜相互作用改變脂雙層膜的構(gòu)造，使細(xì)胞膜的通透性增加，并破壞了細(xì)胞膜的完整性，造成細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓失衡，細(xì)胞內(nèi)容物外泄而使細(xì)菌死亡。該機(jī)制存在4種假說(shuō)：凝聚模式、穿孔模式、地毯模式、桶板模式。還有研究認(rèn)為，抗菌肽是通過(guò)與細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合而使細(xì)菌死亡?？咕慕Y(jié)合到細(xì)菌帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜上后，必須穿過(guò)富含多糖的革蘭氏陽(yáng)性菌的膜表面或富含酸性多糖的革蘭氏陽(yáng)性菌膜表面，這是抗菌肽獨(dú)有的一種類似穿膜的機(jī)制。另一種是胞內(nèi)操作機(jī)制。抗菌肽富含脯氨酸或精氨酸，這兩種氨基酸可有效地使抗菌肽穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，與脫氧核糖核酸結(jié)合，阻止其復(fù)制，從而達(dá)到殺菌目的。同時(shí)，抗菌肽還可以抑制肽聚糖、核酸和蛋白質(zhì)的合成，造成細(xì)胞的損傷，進(jìn)而發(fā)揮抑菌或殺菌作用。部分抗菌肽還可能會(huì)作用于線粒體，阻止線粒體細(xì)胞膜質(zhì)子梯度的形成，進(jìn)一步使細(xì)胞ATP的合成受阻，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這對(duì)真菌等真核細(xì)胞尤為有效。

（二）免疫增強(qiáng)機(jī)制

諸多研究表明，抗菌肽具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫活性的生物學(xué)功能?？咕哪軌蛞种七^(guò)度炎癥反應(yīng)，主要是通過(guò)直接中和脂多糖（LPS）和抑制生物炎癥因子的產(chǎn)生。它還可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞發(fā)生脫顆粒作用，釋放組胺和前列腺素D2，引起血管舒張而導(dǎo)致血液中免疫細(xì)胞的釋放。抗菌肽LL-37通過(guò)LPS受體復(fù)合物的集合以及受體CD14、Toll樣受體（TLR4）和酸化的應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK）來(lái)阻止LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。大量研究認(rèn)為，抗菌肽是通過(guò)調(diào)節(jié)某些生長(zhǎng)因子與其受體的表達(dá)，激活機(jī)體相關(guān)信號(hào)通路，充當(dāng)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞的趨化因子，與動(dòng)物非特異性免疫協(xié)同作用來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫力，從而對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。還有研究表明，抗菌肽還能啟動(dòng)和調(diào)節(jié)特異性免疫，注射蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（PTd）和抗菌肽HH2-CpG可以提升免疫球蛋白G（IgG）的分泌水平。抗菌肽LL-37與自身DNA形成復(fù)合體，進(jìn)而通過(guò)Toll樣受體9（TLR9）信號(hào)通路激活漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（DC細(xì)胞），引起干擾素-γ（IFN-γ）的產(chǎn)生與自免疫型T細(xì)胞的激活，表明抗菌肽可以通過(guò)特異性受體激活免疫細(xì)胞功能。

（三）屏障保護(hù)機(jī)制

對(duì)于水生動(dòng)物而言，非特異性免疫遠(yuǎn)重要于特異性免疫，因?yàn)樗鷦?dòng)物的屏障作用是保護(hù)水生動(dòng)物生命安全的第一道防線。近年來(lái)許多的研究表明，很多水生動(dòng)物的上皮細(xì)胞均可表達(dá)抗菌肽，抗菌肽可以通過(guò)多種信號(hào)途徑參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，提高角質(zhì)層形成細(xì)胞功能，從而提高機(jī)體對(duì)病原微生物的抵抗防御能力，即抗菌肽在水生動(dòng)物黏膜的皮膚防御方面起重要作用。

其作用機(jī)制就在于抗菌肽可以調(diào)節(jié)控制緊密連接蛋白質(zhì)，相鄰細(xì)胞間的這些蛋白質(zhì)的相互作用是緊密連接發(fā)揮防御功能的基礎(chǔ)，該過(guò)程涉及多個(gè)信號(hào)通路和相關(guān)因子?？咕腖L-37既可以提高緊密連接蛋白質(zhì)Occludin的表達(dá)，也可以通過(guò)對(duì)Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1（Rac1）的調(diào)控來(lái)加強(qiáng)細(xì)胞屏障功能。蛇源抗菌肽Cathelicidin-BF（C-BF）可以通過(guò)應(yīng)激活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路提高緊密連接蛋白質(zhì)ZO（zonula occludens proteins）和Occludin的表達(dá)，增強(qiáng)屏障功能，保護(hù)機(jī)體屏障結(jié)構(gòu)的完整性。

魚類抗菌肽的種類和數(shù)目繁多，在魚的體表黏膜、皮膚、鰓、血液、血清、小腸和肝臟等組織中都分離得到抗菌肽。同種魚的不同組織可能產(chǎn)生不同類型的抗菌肽，不同魚的抗菌肽分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制差異也較大。因此，有關(guān)魚類抗菌肽的功能機(jī)制還需要大量研究才能揭示。