誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞在皮膚科研究與應(yīng)用的進(jìn)展

李遇梅 張怡萱 劉莉萍

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科 鎮(zhèn)江市免疫性皮膚病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212000

誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是通過向體細(xì)胞中導(dǎo)入一些特定的多能性轉(zhuǎn)錄因子使其重編程為干細(xì)胞，擁有類似胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）的特征，具有多能分化性［1］。ESC雖然具有全能分化性，但由于它來自胚胎，在應(yīng)用至細(xì)胞治療時(shí)無可避免會(huì)存在倫理學(xué)爭議，另外組織相容性問題也是它應(yīng)用于臨床的另一障礙［2］，而iPSC 可以更少涉及倫理學(xué)爭議。在適當(dāng)條件下，iPSC可以向三胚層多種細(xì)胞類型分化，其中包括皮膚細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞等。利用iPSC 可以構(gòu)建疾病模型，在體外用于藥物篩選。因此，源自患者的iPSC 是研究和治療不同疾病的理想來源。而且，iPSC可以提供一種將再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用于皮膚領(lǐng)域的新方式，為諸如大皰性表皮松解癥、外胚層發(fā)育不良等基因相關(guān)性皮膚病提供新型干細(xì)胞診療手段。

一、iPSC的產(chǎn)生與應(yīng)用概述

繼2006年鼠源性成纖維細(xì)胞通過病毒法導(dǎo)入特定轉(zhuǎn)錄因子而成功重編程為iPSC 后，人源性成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、毛囊外根鞘細(xì)胞等皮膚及附屬器相關(guān)細(xì)胞陸續(xù)被重編程為iPSC［1］。重編程的iPSC具有以下特征［2-3］：①形態(tài)類似ESC，如細(xì)胞呈緊密的扁平克隆樣生長，具有清晰的圓形邊緣，細(xì)胞核突出并具有較高的細(xì)胞核質(zhì)比；②核型表達(dá)正常；③表達(dá)多能性基因及蛋白；④在表觀遺傳學(xué)方面，重編程因子被認(rèn)為激活了轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)，使八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4 和NANOG 基因啟動(dòng)子序列去甲基化；⑤體內(nèi)畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)證明，iPSC可以向內(nèi)胚層、中胚層和外胚層分化。

iPSC 轉(zhuǎn)錄因子最初是將可以誘導(dǎo)ESC 并維持多能性的24 個(gè)基因作為候選基因用于重編程，最后確定4個(gè)關(guān)鍵基因作為轉(zhuǎn)錄因子，用于轉(zhuǎn)染體細(xì)胞，能夠產(chǎn)生類似于ESC 的細(xì)胞，分別是OCT4、SOX2、KLF4 和c-MYC。用相似或其他家族的因子來代替上述重編程因子也可成功進(jìn)行重編程［4］?；贛YC 家族與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為了臨床使用的安全性，研究者盡量不用c-MYC，僅單獨(dú)利用同源域蛋白或OCT4 導(dǎo)入體細(xì)胞得到iPSC［5］。

理論上，經(jīng)過多能性及表觀遺傳學(xué)驗(yàn)證的iPSC在體外能夠向3個(gè)胚層多種細(xì)胞分化，并且iPSC在體外培養(yǎng)時(shí)具有強(qiáng)大的增殖能力，能夠提供研究所需的細(xì)胞數(shù)量。另外，通過體外誘導(dǎo)iPSC 能夠獲得模擬胃腸道、角膜、皮膚、大腦等的多種類器官，這些類器官具有高度模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)和功能的特性，為研究器官發(fā)育和疾病發(fā)生提供了細(xì)胞模型和動(dòng)物模型無法替代的工具，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。如基于iPSC技術(shù)和新型生物材料在體外建立的心臟三維組織模型，能夠模擬心臟早期發(fā)育過程［6］。iPSC 因?yàn)榭梢蕴峁┐罅繋в屑膊√卣鞯募?xì)胞而成為用于建立藥物篩選模型的最佳選擇。有學(xué)者用肌萎縮側(cè)索硬化癥患者的細(xì)胞制備iPSC，并建立一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元模型［7］，發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生與Src/c-Abl通路異常有關(guān)，兩種免疫抑制劑西羅莫司和博舒替尼（bosutinib）合用可以在一定程度上恢復(fù)肌肉收縮力，減輕患者痛苦。另外，脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)患者的皮膚細(xì)胞也可被重編程為iPSC，并將其分化成為“浦肯野細(xì)胞”，利用分化的細(xì)胞在體外模擬疾病發(fā)生過程，發(fā)現(xiàn)甲狀腺釋放激素與利魯唑可以阻止疾病發(fā)展［8］。由此可見，iPSC不僅解決了構(gòu)建疾病模型的細(xì)胞來源問題，并且能夠?yàn)榛颊咛峁﹤€(gè)體化模型，進(jìn)而精確分析疾病發(fā)生機(jī)制，并選擇有效藥物。

此外，利用iPSC 生成移植所需細(xì)胞用于再生治療，目前已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。2017年，日本理化研究所、大阪大學(xué)等多團(tuán)隊(duì)合作完成世界首例自體iPSC 來源的色素視網(wǎng)膜移植手術(shù)［9］，隨訪25個(gè)月未發(fā)現(xiàn)異常反應(yīng)，且移植1年后患者感覺視野較前明亮，光學(xué)相干斷層掃描圖像顯示視網(wǎng)膜完整性良好，并具有高密度區(qū)域，表明感光細(xì)胞在不斷恢復(fù)。同時(shí)，為了儲(chǔ)存可以應(yīng)用于臨床的iPSC，全球人群HLA 配型的iPSC 庫也在建設(shè)中，一旦成功將加速再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，給無數(shù)需要進(jìn)行移植治療的患者帶來福音。

二、iPSC在皮膚疾病中的應(yīng)用

1.iPSC 轉(zhuǎn)化為皮膚：患者來源的iPSC 在細(xì)胞和基因治療方面都顯示出顯著優(yōu)勢。利用iPSC治療皮膚疾病，需要將其有效分化成為皮膚的主要細(xì)胞即角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。2015 年，Gledhill等［10］將正常人來源的iPSC在體外成功定向分化為這兩種細(xì)胞以及黑素細(xì)胞，為iPSC 應(yīng)用于皮膚科奠定了基礎(chǔ)。Yang等［11］將iPSC分化成為存在于毛囊隆突部位、影響毛囊生長和循環(huán)的上皮干細(xì)胞，這些細(xì)胞具有生成所有毛囊譜系（包括毛干、內(nèi)毛根鞘和外毛根鞘）的能力，進(jìn)而以此重建毛囊的上皮成分和濾泡間表皮。上述由iPSC分化而來的皮膚細(xì)胞及附屬器相關(guān)細(xì)胞可以用于研究和治療傷口愈合和其他退行性皮膚病，并且為脫發(fā)提供組織工程學(xué)新療法。

Gledhill等［10］在將iPSC成功在體外分化成角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的基礎(chǔ)上，先開發(fā)出基于兩種細(xì)胞的三維皮膚等效物，證明iPSC 可以成功為皮膚建模，此后又通過添加iPSC 衍生的黑素細(xì)胞增加模型復(fù)雜性，并發(fā)現(xiàn)黑素可在iPSC 衍生的黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移。但這種三維皮膚等效物仍存在一定局限性：第一，它尚未進(jìn)行體內(nèi)移植，未證明其是否能適應(yīng)體內(nèi)環(huán)境；第二，這種三維皮膚等效物無法真正模擬人類皮膚復(fù)雜性，它們通常包含很少的細(xì)胞類型，并且沒有添加皮膚附屬器如毛囊、皮脂腺等。

Kim等［12］將臍帶血單核細(xì)胞重編程為iPSC，通過形成擬胚體定向分化為成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞，并利用這兩種細(xì)胞構(gòu)建三維皮膚類器官，最后通過束縛敷料，將三維皮膚類器官移植進(jìn)入免疫缺陷小鼠皮下，并成功維持2 周。Umegaki-Arao等［13］將大皰性表皮松解癥（EB）患者iPSC分化的角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建的三維皮膚類器官移植到小鼠體內(nèi)，但并未說明維持時(shí)間。Koehler 等［14］早前開發(fā)了一種三維鼠源ESC培養(yǎng)模式，可以產(chǎn)生顱表面上皮（一種皮膚表皮的前體組織），在培養(yǎng)過程中，還產(chǎn)生了異質(zhì)的間充質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞群；利用此項(xiàng)技術(shù)，他們又在體外的三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)鼠源性多能干細(xì)胞（包括ESC 和iPSC），建立皮膚類器官，并表明皮膚類器官在模擬正常胚胎毛囊發(fā)生過程中可自發(fā)地產(chǎn)生新生毛囊［15］。這種皮膚發(fā)育的體外模型將有助于研究毛囊誘導(dǎo)機(jī)制，評(píng)估抑制或促進(jìn)毛發(fā)生長的藥物和模擬皮膚病的發(fā)生。2016 年，有學(xué)者利用iPSC 制備的三維皮膚器官系統(tǒng)（integumentary organ system，IOS）研發(fā)出一種新型體內(nèi)移植模型［16］，稱為聚類依賴性擬胚體移植方法，他們首先探索出iPSC 移植體內(nèi)誘導(dǎo)生成各種上皮胚層的培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路可以影響IOS 移植物的毛囊生長數(shù)量；將IOS 經(jīng)過原位移植進(jìn)入裸鼠后背皮下，證明IOS 具有完整功能性，可以與周圍的宿主組織如表皮、豎脊肌和神經(jīng)纖維正常連接，且無腫瘤發(fā)生，三維IOS 系統(tǒng)中的生物工程毛囊也顯示出正常的毛發(fā)生長周期，這項(xiàng)研究利用iPSC初步實(shí)現(xiàn)了器官替代療法的目標(biāo)。

2.iPSC構(gòu)建皮膚疾病模型：盡管通過活組織體外培養(yǎng)可以得到患者的皮膚細(xì)胞用于構(gòu)建皮膚疾病模型，但這些細(xì)胞在體外增殖能力降低，且低齡患兒活組織檢查較難操作?；颊邅碓吹膇PSC具有無限增殖能力，并可以多向分化，通過基因修正技術(shù)還可糾正引起疾病的原位基因突變，因此成為構(gòu)建皮膚疾病模型的最佳細(xì)胞來源，特別是基因變異相關(guān)的遺傳性皮膚疾病。

EB是由于編碼皮膚表真皮連接成分的基因突變而造成的一組重癥遺傳性皮膚病，目前沒有十分明確有效的療法。對于重癥EB 患者，表皮再生及修正突變基因十分必要。Umegaki-Arao 等［13］將EB患者皮損來源的iPSC成功分化為角質(zhì)形成細(xì)胞，并在體外建立帶有COL17A1（collagen ⅩⅦalpha-1）基因突變的EB模型；由EB患者非皮損部位的皮膚細(xì)胞重編程為iPSC進(jìn)而分化得來的角質(zhì)形成細(xì)胞并不攜帶基因突變，利用這種細(xì)胞制備皮膚等效物并進(jìn)行小鼠皮膚移植，可為今后EB 移植治療提供新方法［13］。營養(yǎng)不良性EB是由于COL7A1基因突變所致，隱性營養(yǎng)不良型EB（RDEB）是其中病情較為嚴(yán)重的表型之一。Itoh 等［17］利用逆轉(zhuǎn)錄病毒法將RDEB患者來源的成纖維細(xì)胞重編程為iPSC，分化為角質(zhì)形成細(xì)胞后建立三維皮膚類似物，成功構(gòu)建RDEB 疾病的體外模型。另外，Matsumura 等［18］利用非整合性的仙臺(tái)病毒載體法將RDEB 患者的角質(zhì)形成細(xì)胞重編程為iPSC，為后續(xù)RDEB安全建模提供條件。

外胚層發(fā)育不良是一組影響各類外胚層組織（如神經(jīng)、皮膚等）發(fā)生發(fā)育的先天性疾病，其中外胚層發(fā)育不良性唇裂（ectodermal dysplasia and cleft lip/palate，EEC）由控制表皮發(fā)育和維持細(xì)胞活動(dòng)動(dòng)態(tài)平衡的p63基因單點(diǎn)突變引起，EEC綜合征包括皮膚缺陷和角膜緣干細(xì)胞缺乏癥。有研究者將攜帶p63 基因結(jié)構(gòu)域中兩位點(diǎn)突變的EEC 患者的成纖維細(xì)胞重編程為 iPSC［19］，發(fā)現(xiàn)這種 iPSC 可以分化成早期外胚層標(biāo)志物K18+細(xì)胞，但無法進(jìn)一步分化成K14+細(xì)胞（表皮/角膜緣）或K3+/K12+細(xì)胞（角膜上皮）；APR-246 是一種能夠恢復(fù)突變型p53功能的小化合物，添加APR-246培養(yǎng)后可以使EEC患者來源的iPSC 向角膜上皮細(xì)胞分化，并恢復(fù)正常的p63相關(guān)信號(hào)通路，該研究利用EEC患者來源的iPSC 模擬疾病，并為未來EEC 治療藥物篩選鋪平了道路。

3.iPSC 應(yīng)用于皮膚疾病細(xì)胞/基因治療：來自患者的iPSC 攜帶患者自身信息，可以提供治療所需的各種自體細(xì)胞類型，在移植治療時(shí)不但避免了自身免疫排斥反應(yīng)，還避開了倫理爭議。Itoh等［17］為了進(jìn)一步研究RDEB的細(xì)胞治療方案，將iPSC分化為真皮成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞可以產(chǎn)生Ⅶ型膠原蛋白，成為具有治療RDEB 的潛力細(xì)胞之一。目前EB 的基礎(chǔ)治療研究包括同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem/stromal cell，MSC）移植法［20］。MSC是一類基質(zhì)干細(xì)胞的異質(zhì)群體，可以通過細(xì)胞分化和釋放旁分泌因子對傷口愈合起作用，并且MSC能在體內(nèi)促進(jìn)Ⅶ型膠原蛋白分泌［21］，但獲取供體骨髓中的MSC 對患者損傷較大，因此可以利用患者來源的iPSC 分化為MSC 進(jìn)行治療，減少對患者的傷害；Nakayama 等［22］以仙臺(tái)病毒為載體將RDEB患者的角質(zhì)形成細(xì)胞重編程為iPSC，將其在體外分化成MSC，然后皮下和靜脈注射至全皮膚損傷的免疫缺陷小鼠體內(nèi)，2周后觀察到小鼠皮膚出現(xiàn)再上皮化，證明由iPSC 分化而來的MSC 也具有修復(fù)傷口的能力。另外，Tolar等［23］發(fā)現(xiàn)RDEB患者水皰部位皮膚細(xì)胞有編碼Ⅶ型膠原蛋白的COL7A1 基因突變，而無水皰部位皮膚細(xì)胞則無突變，他們將無突變的皮膚細(xì)胞稱之為自發(fā)性基因修正細(xì)胞，并重編程為iPSC，再分化成角質(zhì)形成細(xì)胞，以此建立的體外皮膚模型可以正常表達(dá)Ⅶ型膠原蛋白，這種方法為在RDEB和其他疾病患者中使用自發(fā)性基因修正細(xì)胞進(jìn)行自體細(xì)胞治療奠定了基礎(chǔ)。

如前所述，iPSC是可以靶向糾正基因突變的有效工具細(xì)胞，這種細(xì)胞基因修飾療法為皮膚病的治療提供了新視野。Wenzel等［24］為了證明iPSC可應(yīng)用于RDEB 的治療，研發(fā)出帶有RDEB 疾病特征的COL7A1 基因突變小鼠，獲得其iPSC，再利用Flpo技術(shù)將iPSC 進(jìn)行基因修復(fù)，遺傳修復(fù)的iPSC 可以分化為功能性成纖維細(xì)胞，重新表達(dá)并分泌Ⅶ型膠原，移植到RDEB 小鼠體內(nèi)后通過熒光素追蹤至16周，結(jié)果顯示，小鼠表真皮連接處不但恢復(fù)了Ⅶ型膠原沉積，還恢復(fù)了RDEB小鼠皮膚對起皰的機(jī)械抵抗力。幾乎同時(shí)，有學(xué)者制備RDEB患者經(jīng)基因校正的角質(zhì)形成細(xì)胞皮膚片用于移植［25］，即利用腺病毒介導(dǎo)的傳統(tǒng)基因組編輯方法靶向修復(fù)RDEB 患者來源的 iPSC 的 COL7A1 基因突變，以產(chǎn)生校正的iPSC，由其分化的角質(zhì)形成細(xì)胞異質(zhì)性較小，并分泌Ⅶ型膠原，在體外類器官培養(yǎng)和小鼠移植實(shí)驗(yàn)中都能形成分層表皮。此后，Shinkuma等［26］改進(jìn)基因編輯方法，利用內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR 相關(guān)蛋白9技術(shù)，對顯性營養(yǎng)不良性EB 患者來源的iPSC 進(jìn)行基因編輯，經(jīng)過分選，90%的iPSC被成功編輯，這些iPSC可以分化成分泌Ⅶ型膠原蛋白的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，這項(xiàng)研究通過iPSC證實(shí)突變位點(diǎn)特異性基因組編輯在顯性失活疾病中運(yùn)用的可行性。

三、小結(jié)與展望

目前，iPSC技術(shù)在細(xì)胞替代療法和基因靶向治療等方面都表現(xiàn)突出，但將iPSC 衍生的皮膚細(xì)胞應(yīng)用于臨床，還面臨著幾個(gè)重要的問題，即①治療有效性：這意味著不但要獲得大批高質(zhì)量可供移植的細(xì)胞，并且這些細(xì)胞還要耐受移植環(huán)境，可以應(yīng)對應(yīng)激、衰老等情況而維持持久的功能性，這些都需要進(jìn)一步對iPSC 來源的移植細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證；②基因穩(wěn)定性：2014 年有日本學(xué)者將由iPSC 來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植給黃斑變性患者［27］，但由于移植細(xì)胞中有2個(gè)微小基因突變，臨床試驗(yàn)被叫停，如何維持分化細(xì)胞的基因穩(wěn)定性是將iPSC技術(shù)應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵；③免疫原性：iPSC 技術(shù)要被大規(guī)模應(yīng)用于臨床，就需要建立同種異體的iPSC庫，如前文所述這項(xiàng)工作已在進(jìn)行中，在這種情況下，降低異體細(xì)胞的免疫原性，精確地進(jìn)行HLA配型就顯得十分重要。此外，對于iPSC 存在形成腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的質(zhì)疑從未消失，但iPSC 在分化過程中干性基因相繼沉默，目的細(xì)胞的特征性基因上調(diào)，細(xì)胞命運(yùn)發(fā)生改變，從目前的臨床移植試驗(yàn)來看，iPSC分化的細(xì)胞并無形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。

盡管面臨困難，但iPSC 憑借其獨(dú)特優(yōu)勢依然給皮膚疾病的治療和研究帶來深遠(yuǎn)影響。目前iPSC 技術(shù)顯然已成為遺傳性皮膚病的一種新型靶基因治療工具。另外，iPSC分化細(xì)胞若能保持基因穩(wěn)定性，針對一些重度燒傷或瘢痕疙瘩等無法從健康區(qū)域大量擴(kuò)增表皮細(xì)胞的患者，也將具有很大的移植優(yōu)勢。總之，iPSC技術(shù)將加速再生醫(yī)學(xué)在皮膚疾病中的應(yīng)用，為皮膚再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展作出貢獻(xiàn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突