豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白體外表達技術(shù)研究進展

張柱青，呂其壯,2，卓嚴玲，鄧啟霞

(1.玉林師范學院 生物與制藥學院，廣西 玉林 537000；2.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學與生物技術(shù)重點實驗室，廣西 玉林 537000)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，無囊膜，呈二十面體結(jié)構(gòu)對稱，能夠在哺乳動物細胞中自主復(fù)制，為單股環(huán)狀負鏈DNA病毒。該病毒是目前所發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒之一，其基因組大小約為1.7 kb，病毒粒子直徑約為17 nm[1]。豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)主要包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)等多種癥候群，引起這些疾病的感染及發(fā)展需要許多外部條件，例如環(huán)境因素、遺傳因素、應(yīng)激因素、免疫刺激、病原體的共同感染等，但PCV2一直被認為是這些疾病的主要病原[2]。

PCVAD自從20 世紀90 年代開始流行至今，首先以PMWS形式在1991年出現(xiàn)在加拿大，之后接連出現(xiàn)在英國、美國、法國等國家和地區(qū)，造成豬的死亡率可高達40%，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。此外，豬只單獨感染PCV2可能只會引起一些輕微的臨床癥狀，只有當其與豬肺炎支原體、豬鏈球菌、豬細小病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等病原中的1個或多個混合感染時，才有可能會表現(xiàn)出嚴重的PCVAD癥狀[4-5]。Cap蛋白是PCV2的主要免疫保護性抗原，也是PCV2的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，它常被用作PCVAD診斷的最主要檢測對象，同時也是研制PCV2基因工程疫苗的理想靶抗原，因此，體外成功表達出Cap蛋白顯得尤為重要。為此，針對近些年有關(guān)PCV2 Cap蛋白體外表達技術(shù)的研究進展進行了綜述，以期為PCV2感染的診斷和PCV2基因工程疫苗的研制提供參考。

1 Cap蛋白概述

PCV2包含11個開放閱讀框(Open reading frame,ORF)，各閱讀框大小相差懸殊，其中ORF1和ORF2是其中最為重要的閱讀框。ORF1與病毒的復(fù)制相關(guān)，編碼Rep蛋白。ORF2編碼病毒的衣殼蛋白Cap，全長234個氨基酸，分子質(zhì)量約為 27.8 ku，與PCV2 特異性中和抗體的產(chǎn)生有關(guān)，是病毒主要的免疫原性蛋白，也是研制PCV2新一代檢測技術(shù)以及PCV2疫苗的研究熱點。Cap蛋白的氨基端含有許多堿性氨基酸和精氨酸，Cap蛋白的主要抗原位點和核定位信號(NLS)都位于這些區(qū)域，尤其第12—18個氨基酸殘基(R-H-R-P-R-S-H)和第34—41個氨基酸殘基(H-R-Y-R-W-R-R-K)對Cap 蛋白的核定位至關(guān)重要[6-8]。由于ORF2基因較短，它的測序較整個PCV2基因組的測序省力，有利于PCV2毒株的進化分析以及PCV2和PCV1感染的區(qū)分。PCV2 Cap蛋白具有高度保守的抗原表位，可以刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，是PCV2診斷技術(shù)的理想靶抗原[9]。當前，國內(nèi)外許多研究工作如PCV2基因工程疫苗的研發(fā)和PCV2感染的診斷等都集中在Cap蛋白，而這些研究工作的開展都離不開Cap 蛋白的體外表達。

2 Cap蛋白體外表達技術(shù)

PCV2 Cap蛋白的表達方式多樣，如采用大腸埃希菌、酵母、病毒活載體和細菌活載體等表達系統(tǒng)，都取得了比較理想的表達效果。其中，由于表達條件簡單，成本低，可用于大批量的重組蛋白表達以及可通過口服途徑獲得免疫等原因，大腸埃希菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)成為目前使用最廣泛的表達系統(tǒng)。但是，隨著PCV2毒株的不斷變異，原先比較實用的Cap蛋白體外表達技術(shù)逐漸被新的體外表達技術(shù)所取代。近年來，國內(nèi)外的PCV2流行毒株逐漸變得多元化、復(fù)雜化，在傳統(tǒng)疫苗的免疫壓力下產(chǎn)生了適應(yīng)性進化[10-11]，其氨基酸序列也發(fā)生了突變，導(dǎo)致PCV2檢測及預(yù)防更加困難，因此，PCV2 Cap蛋白體外表達技術(shù)仍然需要不斷探索。

2.1 大腸埃希菌表達系統(tǒng)

大腸埃希菌表達系統(tǒng)具有培養(yǎng)方便、周期短、成本低廉等諸多優(yōu)點[12]。目前，已有許多學者曾嘗試利用大腸埃希菌表達系統(tǒng)表達PCV2 Cap蛋白，不管是將Cap蛋白序列截短，還是將Cap蛋白與某些標簽蛋白融合，基本都成功表達了Cap蛋白[13]。KONG等[14]將密碼子優(yōu)化后的PCV2 ORF2基因克隆至大腸埃希菌中并誘導(dǎo)表達，表達出的重組Cap蛋白不僅量大，而且具有良好的免疫原性，為PCV2血清學診斷和PCV2相關(guān)疾病疫苗的開發(fā)提供了參考。趙曉云等[15]利用大腸埃希菌表達PCV2 NJ 株Cap蛋白，實現(xiàn)了Cap蛋白高效可溶性表達，且獲得的重組Cap蛋白能夠在體外自我組裝成病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)并保持良好的免疫原性，為制備PCV2亞單位疫苗尤其是VLP疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)上市的商品化PCV2亞單位疫苗均是采用大腸埃希菌表達的Cap蛋白與相應(yīng)的佐劑混合制成，如青島易邦生物工程有限公司生產(chǎn)的易圓凈以及洛陽普萊柯生物工程股份有限公司研制的PCV2 VLP疫苗圓柯欣等，再次印證了利用大腸埃希菌表達系統(tǒng)表達PCV2 Cap蛋白的優(yōu)勢[16]。

2.2 酵母表達系統(tǒng)

酵母表達系統(tǒng)因其培養(yǎng)較方便、簡單、成本低廉、產(chǎn)量高、產(chǎn)物易分離、表達的蛋白質(zhì)活性好、能進行翻譯后修飾等諸多優(yōu)點脫穎而出，成為目前最主要的外源基因表達系統(tǒng)之一[17]。BUCAREY等[18]利用釀酒酵母表達出了經(jīng)過優(yōu)化后的PCV2 Cap蛋白，表達產(chǎn)物不僅能夠自我組裝形成VLPs，而且經(jīng)口服免疫后小鼠能夠產(chǎn)生較高的抗體水平，表明PCV2 Cap蛋白可以在酵母表達系統(tǒng)中表達，而且表達出的Cap蛋白具有很好的免疫原性，可借助酵母系統(tǒng)來研發(fā)PCV2的新型口服型疫苗。李中圣等[19]不僅利用畢赤酵母實現(xiàn)了PCV2 Cap蛋白的高效分泌表達，而且對其表達菌進行了篩選，對其表達條件也進行了優(yōu)化，再次為利用酵母表達 PCV2 Cap蛋白進行疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。值得注意的是，雖然酵母表達系統(tǒng)有可能會被廣泛應(yīng)用于PCV2 Cap蛋白的體外表達和PCV2疫苗的制備，但目前由于該系統(tǒng)在工業(yè)生產(chǎn)時可能會面臨蛋白質(zhì)信號肽加工不完全、易降解等瓶頸問題，所以將來還應(yīng)慎重考慮是否可將酵母表達技術(shù)進行產(chǎn)業(yè)化或工業(yè)化發(fā)展。

2.3 病毒活載體表達系統(tǒng)

活載體通常具有宿主范圍廣、表達外源基因效率高等優(yōu)點，因此，目前已有許多國內(nèi)外學者嘗試利用病毒活載體進行PCV2 Cap蛋白體外表達研究。其中以腺病毒、豬痘病毒、偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、桿狀病毒、黃瓜花葉病毒、λ噬菌體等為病毒活載體的研究相對較多，且取得了許多重要進展。

2.3.1 桿狀病毒表達系統(tǒng) 桿狀病毒表達系統(tǒng)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白的穩(wěn)定、高效表達，而且不會刺激哺乳動物產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答，也不會對它們造成功能性損傷，且桿狀病毒是一種極具應(yīng)用前景的基因工程表達載體[20]。FAN等[21]以桿狀病毒為載體在昆蟲細胞中高效表達了PCV2 Cap蛋白，表達的蛋白質(zhì)在免疫小鼠后使其獲得了明顯的體液和細胞免疫應(yīng)答，提示重組假型桿狀病毒有被應(yīng)用于PCV2疫苗研發(fā)的潛力。YE等[22]利用雙重桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達了PCV2 Cap蛋白，且表達的蛋白質(zhì)免疫Balb/c小鼠之后也能夠使其產(chǎn)生較強的體液和細胞免疫應(yīng)答。吳桃芬等[23]利用重組桿狀病毒表達了PCV2a和PCV2b雙亞型重組Cap蛋白并免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫過的小鼠脾臟中PCV2基因拷貝數(shù)明顯低于未經(jīng)免疫小鼠的基因拷貝數(shù)，證實表達出的PCV2a和PCV2b雙亞型重組Cap蛋白具有良好的免疫原性，能用于豬圓環(huán)病毒新型疫苗的開發(fā)。值得一提的是，桿狀病毒表達系統(tǒng)中每一次的新蛋白質(zhì)合成都需要新的宿主，且表達靶蛋白時對技術(shù)和工藝水平的要求均較高，因此，其生產(chǎn)成本往往會比較高。如以勃林格殷格翰、英特威/先靈葆雅動物保健公司為代表的國外企業(yè)所生產(chǎn)的PCV2亞單位疫苗，均是采用昆蟲桿狀病毒表達的Cap蛋白制成，雖然對豬有良好的免疫保護效果，但是其價格昂貴，不利于市場推廣。

2.3.2 偽狂犬病毒表達系統(tǒng) 偽狂犬病毒載體由于具備安全性好、外源基因容量大、生產(chǎn)工藝簡單、原材料來源方便、生產(chǎn)成本低、宿主范圍廣以及人類對偽狂犬病毒沒有易感性等特點而成為極具應(yīng)用前景的基因治療載體[24]。CHI等[25]利用重組偽狂犬病毒表達了PCV2 Cap蛋白，表達產(chǎn)物能夠自我組裝成VLPs且表現(xiàn)出良好的免疫原性。鈔安軍等[26]也證實，表達PCV2 ORF2基因的重組豬偽狂犬病病毒具有良好的免疫原性并在動物試驗中取得良好的效果，再次提示可以采用偽狂犬病毒表達系統(tǒng)研制PCV2 VLP疫苗。鑒于偽狂犬病毒載體不感染人且可以同時插入多個外源基因，有望可以達到1針防治多種疾病的目的。因此，研制能在偽狂犬病毒載體中成功插入PCV2Cap基因且保持載體穩(wěn)定的技術(shù)將是未來PCV2疫苗研制與開發(fā)的熱點和主要方向之一。

2.3.3 腺病毒表達系統(tǒng) 腺病毒載體因其宿主范圍廣、外源基因載量大、能有效地將外源基因轉(zhuǎn)染到各種靶細胞或組織中、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、易于制備純化、病毒易于包裝等特征成為目前細胞試驗中常用的基因轉(zhuǎn)移載體之一，且已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、制藥、基因治療和基因工程疫苗等研發(fā)領(lǐng)域[27-29]。郭全海等[30]成功構(gòu)建了包含PCV2 Cap蛋白中2個特異性表位基因片段的重組腺病毒，經(jīng)PCR、IPMA、IFA和ELISA檢測表明，PCV2 Cap蛋白的這2個特異性抗原表位基因片段能夠在HEK-293A細胞中表達，且表達產(chǎn)物與豬抗PCV2陽性血清反應(yīng)良好，提示重組腺病毒介導(dǎo)表達的Cap蛋白具有良好的免疫原性，可以進一步應(yīng)用于PCV2 Cap蛋白單克隆抗體的制備、PCV2快速檢測試紙條的組裝以及基于腺病毒的重組PCV2活載體疫苗的研制。盡管腺病毒載體可廣泛應(yīng)用于PCV2疫苗開發(fā)、基因治療等領(lǐng)域，具有良好的應(yīng)用前景，但由于腺病毒載體本身存在不足之處，如靶向性差、首過效應(yīng)強、能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的抗腺病毒中和抗體等缺陷，因此，未來有關(guān)腺病毒載體表達系統(tǒng)的研究將主要集中于對該載體的遺傳改造和優(yōu)化等方面。李萌等[29]借助Gibson組裝技術(shù)發(fā)明了一種能夠簡化腺病毒感染性克隆構(gòu)建工作的新策略，該策略是一種通過酶切連接結(jié)合Gibson組裝對腺病毒載體實施定點突變的方法，這為后續(xù)需要對腺病毒載體進行反向遺傳修飾的研究提供了便利。

2.3.4 豬痘病毒表達系統(tǒng) 痘病毒宿主范圍較寬、基因組大、含有多個復(fù)制非必需區(qū)、可容納大片段外源基因，是疫苗載體的良好選擇，而豬痘病毒因嚴格的宿主特異性、溫和的致病性、熱穩(wěn)定性和低傳播力等特點使其備受載體疫苗研究者的青睞[31]。范紅結(jié)等[32]利用重組豬痘病毒表達出的PCV2 Cap蛋白制備出了免疫效果良好的PCV2活載體疫苗，并成功申請了專利。鐘羅華等[33]利用重組豬痘病毒表達的PCV2 Cap蛋白能夠與PCV2 Cap蛋白單克隆抗體6E12發(fā)生特異性反應(yīng)，且由該重組豬痘病毒制備的PCV2 滅活疫苗能夠與PCV2商品疫苗產(chǎn)生相當?shù)目贵w水平，表明豬痘病毒載體表達系統(tǒng)有望被應(yīng)用于PCV2 Cap蛋白的表達中。然而，雖然痘病毒表達系統(tǒng)可以用于哺乳動物以及人類疾病的防治，且對于免疫低下或患有缺陷的動物是一種理想表達載體，但是鑒于痘病毒各成員間具有的抗原相關(guān)性可能會抑制痘病毒科其他病毒的侵入，因此，使用痘病毒載體表達系統(tǒng)表達PCV2 Cap蛋白以制備PCV2活載體疫苗還具有一定的局限性。

2.3.5 其他病毒表達系統(tǒng) 除了以上幾種常見的病毒活載體表達系統(tǒng)被嘗試用于PCV2 Cap蛋白體外表達外，以λ噬菌體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、牛痘病毒、黃瓜花葉病毒等為活載體進行PCV2 Cap蛋白表達的研究也在不同的實驗室進行，并取得了一定的進展[4,32,34-37]。HAYES等[38]將PCV2 Cap蛋白的優(yōu)勢表位顯示于λ噬菌體的表面并免疫仔豬，取得了很好的免疫保護效果，說明λ噬菌體也可以用于PCV2 Cap蛋白的體外表達，更可用于研制PCV2亞單位疫苗。GELLERT等[39]采用重組黃瓜花葉病毒表達出的PCV2 Cap蛋白抗原表位飼喂小鼠和豬后，均能夠引起其特定的免疫反應(yīng)，說明今后利用植物病毒表達PCV2 Cap蛋白并將其用于開發(fā)基于植物病毒表達系統(tǒng)的黏膜疫苗具有可行性。

2.4 細菌活載體表達系統(tǒng)

目前，細菌活載體表達系統(tǒng)也是用來表達抗原基因以制備活載體疫苗的常用工具。其中，乳酸菌不僅是安全的口服細菌，而且可以有效表達外源蛋白，因此，常被選為載體來表達抗原成分以制備口服型疫苗。WANG等[40]利用乳酸菌表達的PCV2 Cap蛋白制備口服型PCV2活載體疫苗并免疫小鼠，結(jié)果表明，小鼠口服后可產(chǎn)生PCV2特異性抗體，提示用乳酸菌來表達PCV2 Cap蛋白并制備口服型PCV2亞單位疫苗是可行的。此外，KIM等[41]利用支氣管敗血性博代氏桿菌表達的PCV2 Cap蛋白制備出PCV2活載體疫苗，并將其免疫仔豬，結(jié)果表明，被免疫豬體內(nèi)不僅產(chǎn)生了抗體，而且PCV2病毒載量也顯著降低，提示博德氏菌也可以作為載體用于PCV2 Cap蛋白的體外表達及PCV2亞單位疫苗的研發(fā)。

2.5 其他表達系統(tǒng)

目前，還沒有非常理想的PCV2 Cap 蛋白體外表達系統(tǒng)，已被廣泛使用的幾種表達系統(tǒng)都存在一定缺陷，因此許多新型PCV2 Cap 蛋白體外表達技術(shù)開始出現(xiàn)。如哺乳動物細胞表達系統(tǒng)能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)高效表達，指導(dǎo)蛋白質(zhì)正確折疊，具有翻譯后的加工修飾體系，且表達的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)，成為了重組藥物蛋白質(zhì)生產(chǎn)的優(yōu)選系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用于基因工程藥物的生產(chǎn)[42-43]。DONG等[44]構(gòu)建了表達PCV2 Cap蛋白的真核表達載體pVAX-PCV2-ORF2，將其轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后，用IFA能檢測到Cap蛋白的表達，且以此重組質(zhì)粒載體免疫小鼠后能夠使其產(chǎn)生抗PCV2感染的免疫應(yīng)答，提示可以應(yīng)用真核表達系統(tǒng)制備PCV2 DNA核酸疫苗。相比于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，果蠅S細胞表達系統(tǒng)(DES)中的果蠅S2細胞是半懸浮細胞，培育方便，能夠產(chǎn)生較高的蛋白質(zhì)量。因此，DES更有可能成為將來研究 Cap蛋白功能和研制 PCV2基因工程亞單位疫苗的表達系統(tǒng)。馬凱凱[45]構(gòu)建了重組昆蟲細胞表達載體 pMT/Bip/V5-HisA-Cap，將其與篩選質(zhì)粒pCoHygro共轉(zhuǎn)染S2細胞后，表達產(chǎn)物能夠與帶有V5標簽的抗體結(jié)合，表明DES能夠穩(wěn)定表達PCV2 Cap蛋白，且表達出的Cap蛋白具有良好的抗原性。

3 小結(jié)

PCVAD作為近年來的一種多發(fā)性豬傳染病，傳播方式多種多樣，同時還會伴隨其他病原的并發(fā)或繼發(fā)感染，大大增加了防治該病的難度，加之PCV2毒株不斷發(fā)生變異，開發(fā)研制PCV2檢測方法和預(yù)防疫苗顯得尤為重要，尤其是基于PCV2 Cap蛋白所研制的PCV2診斷和檢測方法以及PCV2基因工程亞單位疫苗。雖然科研人員已經(jīng)通過原核表達系統(tǒng)以及酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、植物生物反應(yīng)器等真核表達系統(tǒng)成功獲得了各種PCV2 Cap重組蛋白，但各種表達系統(tǒng)都有其各自的優(yōu)缺點，例如酵母菌易降解、桿狀病毒合成新蛋白需要更換新宿主、腺病毒具有靶向性差、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)存在病毒感染的風險等，說明目前PCV2 Cap蛋白體外表達技術(shù)仍不成熟，今后還需對以上各種表達系統(tǒng)進行進一步的改造和優(yōu)化。此外，許多體外表達技術(shù)因為申請了專利保護等原因也還沒有被廣泛使用，這在一定程度上阻礙了PCV2 Cap蛋白體外表達技術(shù)的推廣和發(fā)展。因此，研發(fā)更高效、方便、快捷、安全、低廉的PCV2 Cap蛋白體外表達技術(shù)將是未來的研究熱點和主要方向。