驢精液冷凍保存技術(shù)研究進(jìn)展

郝志明，陸樹林，楊新軍，陸彥名，王愿林，景兆國(guó)，沈鴻武

（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)科系，天津 300384；2.甘肅龍麒生物科技股份有限公司，瓜州 736100）

驢的精液冷凍保存技術(shù)是在馬的精液冷凍保存技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。早在上個(gè)世紀(jì)七八十年代就有一些研究，但后來由于其役用價(jià)值的逐漸消失，驢養(yǎng)殖業(yè)的頹廢，有關(guān)驢的研究少有人問津。從2008年前后開始，隨著以驢為基礎(chǔ)的保健和美容產(chǎn)品的興起，包括驢精液冷凍保存技術(shù)在內(nèi)的研究明顯增多，也在諸多方面取得了積極的進(jìn)展。

1 精液冷凍保存稀釋液

1.1 基礎(chǔ)稀釋液

國(guó)外研究者采用的基礎(chǔ)稀釋液多為購買的商品化產(chǎn)品，如 INRA［1-4］、BotuSemen［1，5-6］、Botupharma［5］、Berliner Cryomedium［1］、MP 50［6］、Gent［3，7-8］、S-MEDIUM［9］、T2-94［10］等等。國(guó)內(nèi)研究者則多通過研究篩選出的配方自行配制。曾維斌等［11］就5種基礎(chǔ)稀釋液對(duì)驢精液冷凍保存的效果進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5號(hào)基礎(chǔ)稀釋液（葡萄糖 6 g，乳糖 2 g，EDTA 0.5 g，青鏈霉素各 10萬 IU，雙蒸水100 mL）冷凍驢精液，凍后精子活力（0.37±0.04）和頂體完整率（67.7±2.66）%最高，頂體膨脹率（12.0±1.41）%、頂體破損率（14.2±1.47）%和尾部畸形率（6.17±1.47）%最低。王珂等［12］曾對(duì)3種基礎(chǔ)稀釋液的冷凍效果進(jìn)行過研究，發(fā)現(xiàn)2號(hào)稀釋液（葡萄糖5 g，果糖2 g，檸檬酸鈉0.3 g，青鏈霉素各10萬IU，雙蒸水100 mL）的凍后精子活率、頂體完整率和質(zhì)膜完整性最高，分別為（33.08±1.83）%、（42.67±5.39）%和（43.42±3.23）%。李建棟［13］對(duì) 2 種基礎(chǔ)稀釋液、康孟陽［14］對(duì) 5 種基礎(chǔ)稀釋液進(jìn)行的研究結(jié)果都表明，配方為蔗糖7.3 g、葡萄糖2 g、二水檸檬酸鈉 0.12 g、EDTA 0.13 g、NaHCO30.04 g、硫酸鏈霉素0.04 g、青霉素鈉25 000 IU、蒸餾水100 mL的基礎(chǔ)稀釋液明顯較好或最好。王慧偉等［15］對(duì)5種包括基礎(chǔ)稀釋液也不同的冷凍稀釋液的研究表明，5號(hào)冷凍稀釋液（乳糖7.2 g、葡萄糖3.6 g、檸檬酸鈉0.25 g、青鏈霉素各10萬IU、卵黃5 mL、甘油5 mL、雙蒸水90 mL）冷凍驢精子的效果最好，凍后精子的活率、畸形率和頂體完整率分別為（0.36±0.06）%、（27.40±2.91）%和（82.20±3.85）%。張瑞濤［16］則采用在其他動(dòng)物近些年比較多用的Tris-葡萄糖稀釋液（Tris 35.209 g、檸檬酸19.674 g、葡萄糖15.988 g、青霉素14.5萬IU、鏈霉素14.5萬IU、雙蒸水1 000 mL）進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果與卵黃稀釋液相比，加有酪蛋白的冷凍稀釋液凍后的精子膜完整性及頂體完整性兩個(gè)指標(biāo)均顯著高于卵黃稀釋液。

1.2 卵黃

驢精液冷凍稀釋液中卵黃的添加量，不同研究者差異很大，有的添加量為 20%［11-14，17-18］，有的為 10%［10］，有的為 5%［2，15，19］，還有的低于 5%［4，16，20-21］。從凍后精子的活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率來看，卵黃的添加量似乎沒有明顯的影響。然而，在馬上的研究發(fā)現(xiàn)，卵黃的添加量對(duì)精子的受精有明顯影響。Bedford等［22］在奶基礎(chǔ)的稀釋液中添加4%的卵黃，發(fā)現(xiàn)馬精子的受精能力出現(xiàn)了明顯的下降，4%卵黃組的胚胎回收率為17%，而不添加組的則為50%。Jepsen等［23］的研究顯示，甘油作為防凍劑且冷凍稀釋液中的卵黃濃度為20%時(shí)，馬的受胎率為0%；當(dāng)用乙二醇代替甘油，卵黃濃度仍然是20%時(shí)，馬的受胎率則為6.3%；當(dāng)卵黃濃度降為5%時(shí)，馬的受胎率則會(huì)提高到46.5%，因此可以看出，低的受胎率也與卵黃的高濃度有關(guān)。他的另一項(xiàng)研究結(jié)果表明，β-環(huán)糊精能夠中和卵黃的這種損害受胎率的作用，由于β-環(huán)糊精能與脂類和膽固醇結(jié)合，因此認(rèn)為卵黃中的膽固醇可能就是引起馬受胎率下降的物質(zhì)。Parks等［24］的研究結(jié)果表明，高膽固醇對(duì)精子細(xì)胞是有害的，它可引起人精子和馬精子的不育［25-26］，可能會(huì)使精子去能，抑制頂體反應(yīng)［27］。

1.3 抗凍劑

在驢精液的冷凍保存研究上，應(yīng)用過的抗凍保護(hù)劑有甘油［3-4，10，13，16，18］、乙二醇［2-3，15］、DMSO［3，6，15］、二甲基甲酰胺（DMF）［3-4］和二甲基乙酰胺（DMA）［6］等，截至目前，最常用的是甘油，終濃度多為2%～5%。王慧偉［19］曾對(duì)甘油濃度（1.5%、2.5%和3.5%）進(jìn)行過研究，結(jié)果顯示，2.5%的甘油濃度冷凍驢的精子效果最好。與甘油相比，相同濃度的乙二醇冷凍驢精子效果并沒有甘油好［15］；當(dāng)2.2%的甘油濃度與1.4%的乙二醇濃度相比較時(shí)，冷凍驢精子的效果差異不明顯［2］；當(dāng)乙二醇濃度降為1%時(shí)，則能夠顯著提高精子質(zhì)膜的完整性［3］。對(duì)于DMSO，Acha 等［3］和王慧偉等［15］都證明其抗凍效果明顯差于甘油。而對(duì)于二甲基甲酰胺（DMFA），若用2.5%的DMFA代替甘油時(shí)，凍后精子的存活率和膜完整性明顯得到提高［3］；但凍后精液的受胎率，DMFA 組（11%）較甘油組（10%）沒有明顯提高［4］。

2 鮮精的預(yù)處理

預(yù)處理的方法概括起來有兩種，即稀釋—離心—再懸浮的方法［20，28-29］和離心—再懸浮的方法［12，14-15，19］。稀釋—離心—再懸浮的方法是先對(duì)鮮精進(jìn)行稀釋，然后進(jìn)行離心，去上清液，再用冷凍稀釋液進(jìn)行再懸浮。離心—再懸浮的方法則與稀釋—離心—再懸浮的方法相似，只是鮮精不進(jìn)行稀釋而直接進(jìn)行離心而已。

對(duì)于鮮精的稀釋，通常所用的稀釋液為基礎(chǔ)稀釋液，且按照鮮精∶稀釋液=1∶1～1∶3 進(jìn)行稀釋［2，5，20，28-29］。當(dāng)然稀釋時(shí)，要注意稀釋液的溫度要與精液相同，且稀釋要緩慢進(jìn)行，防止稀釋打擊和冷休克的發(fā)生。

稀釋后，有的馬上進(jìn)行離心處理，如Saragusty等［1］、Oliveira 等［6］以及樸順官等［29］試驗(yàn)方法，有的放置 10 min后再進(jìn)行離心處理，如 Rota 等［2］、張瑞濤［16］、史福艷［18］試驗(yàn)方法。至于離心的速度和時(shí)間，由于受離心機(jī)離心半徑、精液的質(zhì)量以及精液稀釋液的影響，最好進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)確定。為了做到既能保證精子的分離，又不至于造成對(duì)精子的損傷，Saragusty等［1］在精液下部加入預(yù)熱至37℃的60%的碘克沙醇，1 000 g離心10 min，然后再去除上清液和碘克沙醇。

關(guān)于精子密度與冷凍效果的關(guān)系，Contri等［38］和曾維斌等［17］均進(jìn)行過研究，然而兩者研究結(jié)果剛好相反，前者對(duì)5種驢的精液研究結(jié)果表明，精子密度越高，凍后精子的質(zhì)量越差；而后者的研究則發(fā)現(xiàn)精液濃縮能夠明顯提高凍后精子活力。

3 精液的降溫和平衡

降溫和平衡時(shí)間有 20～30min 的［5，29］，有 1～2h 的［6，14，28］，有 2～3 h 的［1，12，15，19］，也有 3～4 h 的［11，13，17-18］。至于合適的降溫和平衡時(shí)間，則應(yīng)是能夠完成降溫和平衡的最短時(shí)間，因?yàn)闀r(shí)間越長(zhǎng)，抗凍劑的毒性作用就會(huì)越大。由于降溫和平衡時(shí)精液的體積不同，完成降溫和平衡的時(shí)間也會(huì)不同。對(duì)于細(xì)管精液的降溫和平衡，Oliveira等［5］只在5℃的冰箱放置了20 min，用傳統(tǒng)手動(dòng)冷凍方法冷凍的驢精液，凍后活率達(dá)到（39.9±2.6）%。

4 精液的分裝

精液的分裝，目前絕大多數(shù)用的是細(xì)管法。由于驢的輸精量較大，因此多用 0.5 mL 的冷凍細(xì)管［7，15，28，30］，但也有人用 0.25 mL 的細(xì)管［12，14］。Saragusty 等［1］和 Pablos等［31］用Hollow管冷凍保存驢精液，也取得了不錯(cuò)的效果。至于精液分裝的時(shí)間，不同研究者也有區(qū)別，有的在平衡后分裝［2，7，14］，有的則在降溫前分裝［6，18，20］。

5 精液的熏蒸冷凍

精液的冷凍有傳統(tǒng)的手工冷凍和冷凍儀自動(dòng)冷凍。傳統(tǒng)的手工冷凍就是將平衡好的精液放在加有液氮的泡沫箱中在離液氮面一定高度而進(jìn)行的冷凍。這種方法成功的關(guān)鍵在于冷凍時(shí)精液距離液氮面的高度，高度不同溫度就有差異，造成精液的降溫速度就不同，冷凍效果自然也會(huì)不同。從已有的研究資料來看，這一高度并不確定，有 1 cm 的［11，17］、2 cm 的［15］、3 cm的［13，18，29］、4 cm 的［14，29］，還有 6 cm 的［5-6］，至于哪個(gè)高度最合適，恐怕與泡沫箱的大小、結(jié)構(gòu)以及泡沫箱內(nèi)液氮的多少等有關(guān)，應(yīng)在試驗(yàn)中對(duì)比研究確定。關(guān)于熏蒸時(shí)間，也有不小的差異，總的來說，國(guó)內(nèi)研究者的液氮熏蒸時(shí)間較短，通常在 15min 以下，最常用的是 7～8 min［11，15，17，19］，李建棟［13］、史福艷等［18］還用 3 min 進(jìn)行過熏蒸冷凍；國(guó)外研究者的熏蒸時(shí)間則較長(zhǎng)，通常不低于 15 min［1，5-6］。近年來，也有人開始將冷凍胚胎的程序冷凍儀應(yīng)用于驢精子的冷凍［2，5，16］。Oliveira 等［5］對(duì)傳統(tǒng)的手工冷凍方法與自動(dòng)的程序冷凍方法（5～-10℃時(shí)的降溫速度為-15℃/min，-10～-140℃時(shí)的降溫速度為-40℃/min）進(jìn)行過對(duì)比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)程序冷凍方法冷凍的驢精子，凍后活率為（44.5±3.9）%，而傳統(tǒng)手工冷凍方法冷凍的驢精子，凍后活率為（39.9±2.6）%，程序冷凍方法優(yōu)于傳統(tǒng)手工冷凍方法。

6 精液的解凍

根據(jù)解凍溫度可分為低溫解凍（0～5℃）、常溫解凍（15～25℃）、體溫解凍（37～40℃）和高溫解凍（＞45℃）。從現(xiàn)有的資料來看，大部分人采用的是體溫解凍，即在37～40℃的水浴中進(jìn)行 20～30 s 的解凍［1-2，8，12，14］，有的在水浴前還在空氣中停留 3 s 或數(shù)秒［13，18-19］。易理輝等［20］曾用5℃水浴解凍過袋裝驢精液。Oliveira等［5］則用46℃20 s的方法解凍過細(xì)管驢精液。王慧偉等［15］對(duì)冷凍驢精液的解凍溫度進(jìn)行過研究，發(fā)現(xiàn)40℃的解凍效果最好。袁瑋等［32］則用5℃、38℃和手搓對(duì)驢冷凍精液的解凍進(jìn)行過研究，發(fā)現(xiàn)38℃水浴鍋解凍30 s時(shí)的精子活力最高。

7 解凍精液的處理

Rota等［2］對(duì)解凍后的精液稀釋液進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)解凍后的精液若用精漿（SPL）和INRA稀釋液進(jìn)行稀釋，精子的存活率和活力INRA稀釋液組明顯高于SPL組，然而從輸精后的受胎情況來看，SPL和INRA稀釋液組的受胎率分別為61.5%和23.1%，似乎精漿的加入具有提高凍后精液人工授精受胎率的趨勢(shì)。Sabatini等［33］也做了類似的試驗(yàn)，同樣發(fā)現(xiàn)解凍后的驢精液用70%的自體精漿以及5%或20%的異體精漿處理，也會(huì)降低凍后精子的存活率、活率以及膜完整性。Ortiz等［34］則對(duì)解凍后的精液進(jìn)行了單層密度離心研究，發(fā)現(xiàn)用Androcoll-E-Small或膠體進(jìn)行單層密度離心的精液，精子質(zhì)量系數(shù)明顯高于未離心組。而且低耐凍性的精液，在進(jìn)行單層密度離心后，精液質(zhì)量提高得更明顯［35］。Trimeche等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，解凍后的精液只有去除甘油后才能受孕懷胎。

8 冷凍精液的受胎率

由于人工授精輸入的有效精子數(shù)和輸精部位等的不同，授精的受胎率也各不相同。Rota等［2］和王慧偉［19］將3億以上的有效精子輸入子宮體深部，每個(gè)情期輸精1～2次，在不補(bǔ)加精漿的情況下，分別獲得20%～31%和42.9%的情期受胎率。Saragusty等［1］則將有效精子數(shù)增加到4.8億以上，在子宮體輸精2次的情況下，獲得50%的情期受胎率，似乎提高有效精子數(shù)能夠提高發(fā)情母驢的受孕率。然而Oliveira等［5］將輸入的活精子數(shù)提高到10億，子宮體授精的受胎率為0%，而子宮角深部授精的受胎率則為28.3%。國(guó)內(nèi)張瑞濤［16］也進(jìn)行了子宮角深部?jī)鼍斁?，輸入活力?5%的5支細(xì)管精液后，母驢3個(gè)情期的受胎率為63.9%。

總之，驢的精液冷凍保存技術(shù)在近些年來取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，凍后精子活率及其受胎率都有了一定的提高，但其受胎率離人們的期望還有較遠(yuǎn)的距離，相信隨著驢精液冷凍保存技術(shù)和人工授精技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，其必將在驢的良種繁育和品種改良中發(fā)揮更加重要的作用，必將有力地推動(dòng)驢養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。