苗藥黑骨藤研究進(jìn)展△

楊波，張建鋒

國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550009

黑骨藤是貴州苗族地區(qū)常用藥物之一，其味苦、辛，性溫，有小毒；具有祛風(fēng)除濕、活血消癰之功效，常用于治療跌打損傷、風(fēng)濕痛、骨折等。黑骨藤為蘿摩科植物西南杠柳PeripocaforrestiiSchltr.的根或全株。該種主要分布于貴州、云南、西藏等，在其他民族也有藥用，《廣西藥用植物名錄》(鐵散沙、牛尾蕨、鐵骨頭、山筋線)、《貴州草藥》(黑骨頭、柳葉過(guò)山龍)、《昆明民間常用草藥》(山楊柳、青蛇膽、小青蛇、柳葉夾)、《云南中草藥選》(飛仙藤、達(dá)風(fēng)藤)、《云南中草藥》(小黑牛、青香藤、奶漿藤、青色丹、青風(fēng)藤)等中均有藥用記載[1]。關(guān)于黑骨藤已有較多研究報(bào)道，本文對(duì)其提取工藝、化學(xué)成分、質(zhì)量控制、藥理作用等研究概況進(jìn)行綜述，為其進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 提取工藝研究

賈荷麗等[2]對(duì)苗醫(yī)藥的復(fù)方黑骨藤提取工藝進(jìn)行研究，以總生物堿得率和干膏得率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等參數(shù)。確定最佳提取工藝為藥材粗粉加6倍量70%乙醇提取3次，每次1 h。最終優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，用于制備復(fù)方黑骨藤新制劑。袁德彬等[3]以杠柳苷提取率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝參數(shù)。確定的最佳工藝條件：溶劑為50%乙醇，料液比為1∶15，功率為800 W，溫度為50 ℃，提取2次，每次20 min。此工藝合理可行，適用于黑骨藤中杠柳苷的提取。周秋月等[4]以黑骨藤中杠柳苷、秦艽中龍膽苦苷和元胡中延胡索乙素為檢測(cè)指標(biāo)，采用HPLC 考察3 種大孔樹脂(D-101、AB-8、NKA-9)對(duì)杠柳苷、龍膽苦苷和延胡索乙素的吸附分離性能，并考察分離純化杠柳苷、龍膽苦苷和延胡索乙素成分的最佳工藝條件。結(jié)果顯示，采用大孔樹脂 D-101對(duì)復(fù)方黑骨藤藥物中杠柳苷、龍膽苦苷和延胡索乙素成分進(jìn)行分離、純化為好，可作為復(fù)方黑骨藤藥物質(zhì)量控制方法。陳坤等[5]采用D-101型大孔樹脂，以總萜、總黃酮和總生物堿的轉(zhuǎn)移率評(píng)價(jià)上樣質(zhì)量濃度、上樣量、吸附時(shí)間和洗脫液體積流量對(duì)純化效果的影響，以落干酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、杠柳苷、延胡索乙素、四氫小檗堿和延胡索甲素的轉(zhuǎn)移率評(píng)價(jià)洗脫液濃度對(duì)純化效果的影響，以延胡索甲素的轉(zhuǎn)移率確定洗脫終點(diǎn)，最終優(yōu)化出最佳純化工藝條件，該純化工藝穩(wěn)定可行，可作為黑骨藤?gòu)?fù)方藥物有效部位制備工藝。

2 化學(xué)成分研究

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黑骨藤根莖中含有杠柳苷、杠柳苷元、8-羥基杠柳苷元和滇杠柳苷，還含胡蘿卜苷、熊果酸、北五加皮苷等成分。張宏等[6]首次利用HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地黑骨藤中杠柳苷的含量，建立了HPLC測(cè)定黑骨藤中杠柳苷的方法，并用于不同產(chǎn)地黑骨藤中杠柳苷的測(cè)定，具有簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，為黑骨藤藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考依據(jù)。徐宏等[7]采用反相高效液相色譜法測(cè)定黑骨藤中滇杠柳苷Ⅰ的含量，發(fā)現(xiàn)骨藤中滇杠柳苷Ⅰ對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒活性，可將該成分作為黑骨藤質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，對(duì)提高黑骨藤的質(zhì)量控制水平提供了一定的依據(jù)。采用多種柱色譜及制備型 HPLC 等方法進(jìn)行分離純化，并運(yùn)用現(xiàn)代波譜學(xué)方法，如理化分析、核磁共振和質(zhì)譜等鑒定其結(jié)構(gòu)，對(duì)黑骨藤的化學(xué)成分進(jìn)行研究。在黑骨藤70%乙醇提取物中分離得到19個(gè)化合物中，其中化合物 16種為首次從該屬植物中分離得到，化合物4種為首次從該植物中分離得到[8-9]。趙超等[10]采用反復(fù)硅膠柱色譜法、Sephadex LH-20柱色譜法等進(jìn)行分離純化，并通過(guò)理化常數(shù)測(cè)定和質(zhì)譜、一維、二維核磁共振等波譜方法分析鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，研究黑骨藤化學(xué)成分。從黑骨藤中分離鑒定了2個(gè)神經(jīng)酰胺類化合物，分別為1-O-β-D-葡萄糖-(2S，3S，4R，10E)-2-[(2R)-2-羥基二十四烷酰氨基-10-十八烷-3，4-二醇(1)，(2S，3S，4R，10E)-2-[(2R)-2-羥基二十四烷酰氨基]-10-十八烷-1，3，4-三醇(2)。所有化合物均首次從黑骨藤中分離得到，采用二維核磁技術(shù)確定化合物2的結(jié)構(gòu)，并對(duì)其二維譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸屬。

3 質(zhì)量控制研究

質(zhì)量控制研究包括建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、多指標(biāo)定量測(cè)定、質(zhì)量分析等諸多內(nèi)容，徐宏[11]以對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著細(xì)胞毒活性的滇杠柳苷和專屬性很強(qiáng)的新化合物羽扇豆烷壬酸酯作為指標(biāo)成分，采用HPLC和薄層色譜掃描法(TLCS)建立其含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步提升黑骨藤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)并制定黑骨藤的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(草案)。同時(shí)，對(duì)苗藥黑骨藤的指紋圖譜進(jìn)行探索性研究，在其有效成分不完全明確的前提下，以作為黑骨藤質(zhì)量控制的輔助手段，為提高黑骨藤的質(zhì)量控制水平和科技含量提供依據(jù)。王文春等[12]采用高效液相色譜法，對(duì)不同產(chǎn)地黑骨藤藥材中槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果有明顯差異，初步說(shuō)明濕度、產(chǎn)地、光照等因素均對(duì)黑骨藤中該成分的含量有影響。胡茜等[13]采用響應(yīng)面法優(yōu)化液相色譜條件，同時(shí)通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)黑骨藤指紋圖譜液相色譜方法進(jìn)行研究，并得到優(yōu)化黑骨藤的色譜分析條件：Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫，時(shí)間為50 min，流速為1.5 mL·min-1，柱溫為50 ℃。利用響應(yīng)面法成功對(duì)黑骨藤指紋圖譜的液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。徐艷等[14]采用HPLC 同時(shí)測(cè)定復(fù)方黑骨藤中落干酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、龍膽苦苷、獐芽菜苷、杠柳苷、延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素9 種有效成分的含量。使用Kromasil C18色譜柱，通過(guò)調(diào)節(jié)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，在波長(zhǎng)206 nm成分為延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素，波長(zhǎng)225 nm成分為落干酸和杠柳苷，波長(zhǎng)243 nm成分為獐牙菜苦苷和獐牙菜苷，波長(zhǎng)275 nm成分為6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷和龍膽苦苷。其中，落干酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、龍膽苦苷、獐芽菜苷、杠柳苷、延胡索乙素、四氫小檗堿和延胡索甲素的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本方法可用于黑骨藤?gòu)?fù)方藥物中9 種有效成分的分析和含量測(cè)定，為復(fù)方黑骨藤藥物的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。李琪等[15]建立了對(duì)復(fù)方黑骨藤提取物中龍膽苦苷、延胡索乙素和杠柳苷3 種成分的含量進(jìn)行測(cè)定的分析方法，本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)色譜條件和樣品的前處理進(jìn)行考察，在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)復(fù)方黑骨藤中的龍膽苦苷、延胡索乙素和杠柳苷3 個(gè)成分同時(shí)進(jìn)行反相高效液相色譜(RP-HPLC)的分析。確定該分析方法對(duì)于樣品前處理簡(jiǎn)單易行、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、實(shí)用性強(qiáng)，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)預(yù)期目的，為后續(xù)復(fù)方黑骨藤的質(zhì)量控制打下良好的基礎(chǔ)。

4 藥理作用研究

在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療中，苗藥黑骨藤被廣泛應(yīng)用，其生物活性主要有鎮(zhèn)痛、抗炎及強(qiáng)心作用，除此還具有抗癌作用。冉啟軍等[16]采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠致大鼠足趾腫脹2種動(dòng)物模型，檢測(cè)黑骨藤總黃酮的抗炎作用；采用小鼠熱板法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)及冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)模型檢測(cè)其鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果表明，黑骨藤總黃酮具有較好的抗炎消腫與鎮(zhèn)痛作用，提示其黃酮類成分可作為黑骨藤藥材的指標(biāo)性成份。梁勇等[17]通過(guò)對(duì)黑骨藤抗腫瘤活性成分進(jìn)行篩選，并對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行提取分離，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度在25 mg·L-1時(shí)，黑骨藤乙酸乙酯部位對(duì)白血病K562抑制率可達(dá)到80.71%。從該部位分離所得化合物Ⅵ和化合物Ⅸ在10 mg·L-1質(zhì)量濃度下腫瘤抑制率分別達(dá)到97.48%、40.56%。揭示苗藥黑骨藤抗腫瘤活性的有效成分、有效部位和作用機(jī)制，為黑骨藤在抗腫瘤方面的研究、開(kāi)發(fā)和利用奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。甄茹等[18]采用維生素D3誘導(dǎo)兔骨髓細(xì)胞法獲得破骨細(xì)胞，以形態(tài)學(xué)觀察蘇木素、伊紅染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鑒定破骨細(xì)胞，通過(guò)測(cè)定黑骨藤各極性部位不同劑量對(duì)破骨細(xì)胞TRAP酶活力，根據(jù)TRAP+細(xì)胞計(jì)數(shù)及骨吸收陷窩面積的影響來(lái)確定活性部位，從而研究黑骨藤對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響。最終確定黑骨藤主要活性部位是乙酸乙酯部位，它可以抑制骨髓細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化及骨吸收能力。李慧敏等[19]將黑骨藤 95%乙醇提取物分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑進(jìn)行萃取，把乙酸乙酯萃取物用硅膠層析法進(jìn)行分離，研究黑骨藤中抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效成分。把各分離物進(jìn)行小鼠耳廓腫脹和大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定各分離物中總黃酮和總皂苷的含量。黑骨藤醇提物乙酸乙酯萃取物的三氯甲烷-甲醇(5∶1)片段的抗炎作用最好，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，黑骨藤分離物中總黃酮和總皂苷的含量越高其抗炎作用越強(qiáng)。王恒等[20]將成年雄性SD大鼠120只分為4組，分別為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、黑骨藤10 mg·kg-1組(C組)、黑骨藤20 mg·kg-1組(D組)，每組30只。研究黑骨藤乙醇提取物對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)鉗夾損傷的作用及可能的作用機(jī)制。B、C、D組大鼠進(jìn)行坐骨神經(jīng)損傷(SNI)手術(shù)，A組僅暴露游離坐骨神經(jīng)，術(shù)后每日分別給予0.90%氯化鈉(A、B組)或相應(yīng)劑量的黑骨藤乙醇提取物(C、D組)灌胃。各組分為3個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SNI)；取坐骨神經(jīng)，進(jìn)行HE染色，觀察大鼠坐骨神經(jīng)的組織形態(tài)學(xué)變化；取股動(dòng)脈血，ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子的表達(dá)水平。黑骨藤乙醇提取物可改善大鼠SNI，其作用機(jī)制可能與抑制免疫炎癥因子有關(guān)。王霞等[21]采用50 μg·mL-1TNF-α活MH7A細(xì)胞，研究黑骨藤中分離得到的8個(gè)咖啡酰基奎寧酸類單體化合物抑制人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(MH7A)增殖的作用，并對(duì)其活性較好的2個(gè)化合物進(jìn)行可能的分子機(jī)制研究。發(fā)現(xiàn)黑骨藤中咖啡?；鼘幩犷惢衔锞哂休^好的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性，其作用機(jī)制可能與抑制MAPK信號(hào)通路的激活，降低NF-κB 活性，抑制下游炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

5 臨床應(yīng)用研究

對(duì)黑骨藤提取物和黑骨藤制劑的臨床應(yīng)用已有研究報(bào)道。張貴源等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黑骨藤可使線蟲被損傷的神經(jīng)恢復(fù)功能，揭示黑骨藤在治療神經(jīng)退化性疾病方面的價(jià)值。PC12細(xì)胞被廣泛用于神經(jīng)保護(hù)作用藥物篩選研究，在使用H2O2氧化損傷之前，PC12細(xì)胞先接受黑骨藤乙醇提取物的藥物作用，可提升PC12細(xì)胞的存活率，說(shuō)明黑骨藤具有抗氧化損傷作用。黑骨藤既具有神經(jīng)保護(hù)作用又具有抗氧化作用，具有開(kāi)發(fā)成治療神經(jīng)退化性疾病藥物的潛能，為進(jìn)一步探索黑骨藤的新用途提供了參考。黃明進(jìn)等[23]觀察黑骨藤提取物對(duì)AA 大鼠足腫脹、體質(zhì)量、器官指數(shù)及血清與炎性組織液中白介素-1β(IL-6)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量水平的影響，結(jié)果表明黑骨藤提取物能有效下調(diào)胸腺指數(shù)、抑制AA 大鼠足腫脹、降低AA 大鼠血清與炎性組織液中IL-6IL-1β、TNF-α、IL-6的含量水平。黑骨藤具有良好的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫器官功能及促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量水平有關(guān)。張鷹等[24]采用磺酰羅丹明B比色法和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)考察苗藥黑骨藤抗肺癌活性部位，并對(duì)西南地區(qū)苗藥黑骨藤防治肺癌的分子機(jī)制進(jìn)行研究。通過(guò)文獻(xiàn)查閱篩選出黑骨藤中與肺癌相關(guān)的活性成分。黑骨藤抗肺癌活性成分共42個(gè)，活性成分與疾病作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)53個(gè)，GO富集分析顯示，黑骨藤作用于肺癌的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)為EGFR、GRB2、P53、NF-kB；信號(hào)通路主要富集在細(xì)胞增殖、凋亡、應(yīng)激及泛素介導(dǎo)的水解、MAPK等16條信號(hào)通路。進(jìn)一步證明黑骨藤抗肺癌可能是通過(guò)PI3K-AKT和MAKB信號(hào)通路發(fā)揮作用。莫禮華等[25]觀察隔苗藥黑骨藤追風(fēng)液紙火法治療急性期肩周炎的臨床療效，治療60例急性期肩周炎。臨床治愈38例，顯效12例，有效10例，無(wú)效1例，總有效率96.9%，其中1個(gè)療程治愈40例，2個(gè)療程治愈11例，顯效9例。隔苗藥黑骨藤追風(fēng)液紙火法治療急性期肩周炎果明顯，療效確切。張兆奎等[26]采用隨機(jī)、對(duì)照臨床試驗(yàn)的方法，將60例膝骨性關(guān)節(jié)炎患者隨機(jī)分為隔苗藥黑骨藤追風(fēng)液紙火法組(治療組)和熱奄包組(對(duì)照組)。研究苗藥黑骨藤追風(fēng)液治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床療效，并運(yùn)用膝骨性關(guān)節(jié)炎治療效果判定標(biāo)準(zhǔn)(JOA)進(jìn)行臨床評(píng)分，比較兩組臨床療效。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，治療組臨床療效優(yōu)于對(duì)照組，治療組在用藥過(guò)程中未見(jiàn)不良反應(yīng)。隔苗藥黑骨藤追風(fēng)液紙火法治療膝骨性關(guān)節(jié)炎是一種安全有效的方法。梁江等[27]觀察黑骨藤乙醇提取物對(duì)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的增殖以及環(huán)氧化酶-2、前列腺素2的表達(dá)影響。離體培養(yǎng)第4 代的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，兩組細(xì)胞均先予白介素-1β干預(yù)刺激，實(shí)驗(yàn)組予不同質(zhì)量濃度的PFE(125、250、500 μg·mL-1)干預(yù)細(xì)胞，24 h 后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率。用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-PCR)法測(cè)定COX-2的mRNA表達(dá)。免疫蛋白印記(WB法)檢測(cè)COX-2的表達(dá)量，ELISA法檢測(cè)48 h末，細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2的含量，干預(yù)48 h后，PFE對(duì)細(xì)胞抑制率呈量效正相關(guān)性，各劑量組的PFE對(duì)PGE2、COX-2 mRNA及其蛋白的表達(dá)量有明顯抑制(P<0.05)，PFE能抑制IL-1β誘導(dǎo)的RASF 增殖，在mRNA和蛋白兩個(gè)層面均對(duì)RASF高表達(dá)的COX-2有明顯抑制效果，同時(shí)對(duì)該細(xì)胞分泌的炎癥效應(yīng)分子PGE2也有抑制作用，這可能是黑骨藤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在機(jī)制之一。

6 展望

近年來(lái)，隨著黑骨藤的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，部分研究學(xué)者對(duì)黑骨藤資源學(xué)、分子生藥學(xué)、提取方法、化學(xué)成分、生物活性和臨床應(yīng)用等方面進(jìn)行深入細(xì)致的研究，研制出以黑骨藤為主藥的系列產(chǎn)品，包括：黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊、黑骨藤追風(fēng)液、黑骨藤伸筋透骨液、黑骨藤傷濕帖、復(fù)方仙靈風(fēng)濕酒、生龍驅(qū)風(fēng)藥酒、楓荷除痹酊等品種。在臨床對(duì)風(fēng)濕病、類風(fēng)濕病的治療方面，黑骨藤及其復(fù)方制劑具有良好的治療效果和應(yīng)用價(jià)值，彰顯良好的發(fā)展?jié)摿Α?duì)苗藥黑骨藤進(jìn)行全面、細(xì)致、深入研究和開(kāi)發(fā)尤為重要，讓其進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化進(jìn)行種植和管理，使之朝著產(chǎn)業(yè)化方向快速發(fā)展。