缺血預(yù)處理對神經(jīng)保護(hù)作用的晚期基因管理機(jī)制研究進(jìn)展

早在1986年，Murry等[1]首次在犬心肌缺血的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭杏^察到缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IPC)的保護(hù)效應(yīng)。對麻醉犬給予4次單獨(dú)的分別為5 min的局灶缺血處理，隨后予以冠狀動脈閉塞40 min后再灌注，心肌梗死面積較假手術(shù)組降低75%，提示缺血預(yù)處理對缺血臟器具有保護(hù)作用[2]。1990年，Kitagawa等[3]首次在沙土鼠腦缺血實(shí)驗(yàn)研究中觀察到缺血預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。對沙土鼠頸動脈血流給予兩次2 min阻斷后再灌注的預(yù)處理，2 d后予以更嚴(yán)重的5 min血流阻斷后再灌注，與未予以預(yù)處理的沙土鼠相比，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞神經(jīng)元的死亡明顯減少。隨后的多項(xiàng)研究證明，缺血預(yù)處理同樣具有抑制神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)梗死區(qū)域血管生成、縮小腦梗死體積、減輕腦水腫、改善認(rèn)知功能等中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用?，F(xiàn)就缺血預(yù)處理神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的中晚期基因管理機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 晚期基因管理的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制

1.1 低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(hypoxia-inducible transcription，HIF)及其靶基因的調(diào)節(jié) HIF-1是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。已發(fā)現(xiàn)低氧預(yù)處理(hypoxic preconditioning，HPC)增加新生動物和成年動物腦組織中HIF-1的表達(dá)[4]。HIF-1、HIF-2和HIF-3均由α和β亞基組成，并且是堿性螺旋-環(huán)-螺旋-PAS超家族的成員。在生理?xiàng)l件下，HIF-1α被脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD)家族羥化，進(jìn)一步通過泛素化修飾降解。然而，低氧預(yù)處理通過抑制其中脯氨酰羥化酶-2(prolyl hydroxylase-2，PHD-2)的活性，抑制HIF-1α的降解，增加HIF-1α的功能。因此，在低氧條件下，HIF-1α逃避PHD-2對其的分解作用，轉(zhuǎn)而移位至細(xì)胞核與HIF-1β結(jié)合形成二聚體，與靶基因上的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，激活下游數(shù)十個基因的轉(zhuǎn)錄作用，其中促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[5]作為重要的下游蛋白在低氧預(yù)處理中發(fā)揮著重要作用。Qiao等[6]報道通過間歇性缺氧實(shí)驗(yàn)建立高海拔環(huán)境模型小鼠，與對照組小鼠相比，可誘導(dǎo)HIF-1表達(dá)增加，在隨后3支血管閉塞引起的腦缺血后，表現(xiàn)出更強(qiáng)的認(rèn)知功能。而加入HIF-1抑制劑則可完全阻斷HIF-1的生成及預(yù)缺氧的保護(hù)作用。以上結(jié)果顯示，HIF-1的連續(xù)激活，是缺氧預(yù)處理加速小鼠腦缺血后認(rèn)知功能恢復(fù)所必需的。

1.2 促紅細(xì)胞生成素 EPO過去認(rèn)為是胎兒肝臟和成人腎臟中廣泛產(chǎn)生的造血因子，現(xiàn)證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中也有EPO合成[7]。在腦缺血和創(chuàng)傷的動物模型研究中，證實(shí)EPO能減少缺血損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用。由于EPO屬于大分子物質(zhì)，難以通過血腦屏障，所以內(nèi)源性EPO的產(chǎn)生對腦保護(hù)很重要。EPO在腦中通過其基因3′端的低氧反應(yīng)元件(hypoxia response elements，HREs)以低氧敏感的方式釋放。盡管EPO受體(EPO-R)基因的轉(zhuǎn)錄不被HIF-1調(diào)控，但低氧狀態(tài)確實(shí)誘導(dǎo)了EPO-R在神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)增加，同時增強(qiáng)了細(xì)胞對EPO的敏感性。缺乏EPO或EPO-R的小鼠在發(fā)育過程中神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加[8]。

重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)通過基因重組技術(shù)合成，其氨基酸序列及生物學(xué)活性與天然EPO完全一致。Sola等[9]研究表明，rhEPO 在體外可以誘導(dǎo)酪氨酸激酶JAK2磷酸化，且在急性全腦缺血的新生大鼠模型中激活了JAK2。在慢性腦缺血時，rhEPO可以減少神經(jīng)元凋亡，改善長期腦灌注不足大鼠的認(rèn)知功能，外源性地給予JAK2 特異性抑制劑AG490，可以抑制這一神經(jīng)保護(hù)作用，推測該神經(jīng)保護(hù)作用可能與激活JAK2/STAT3通路有關(guān)。

1.3 血管內(nèi)皮生長因子 VEGF是由腎、睪丸、肺、肝、心臟和腦組織缺氧而產(chǎn)生的重要信號蛋白。VEGF可由平滑肌細(xì)胞、黃體細(xì)胞及腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生和分泌。研究證實(shí)，在腦缺血再灌注后VEGF可在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[10]。VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞以促進(jìn)血管再生[11]，是血管增殖過程中高特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的因子[12]。 Tischer等[13]從人類基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)VEGF 3種亞型，分別由189、165和121個氨基酸組成。VEGF的生物學(xué)效應(yīng)主要由兩種酪氨酸激酶受體Flt1(VEGFr-1)和KDR(VEGFr-2)介導(dǎo)[14]。動物模型顯示，給予缺氧預(yù)處理后，成年小鼠腦中VEGF表達(dá)明顯升高[15]。Laudenbach等[16]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，加入抗VEGFr1/2單克隆抗體可抑制缺氧預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。同時，缺乏低氧反應(yīng)元件的VEGF基因突變小鼠，與野生型同窩出生仔豬相比，缺氧預(yù)處理未體現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，反而加劇了腦損傷。以上試驗(yàn)表明，HPC通過VEGF/VEGFr1/2途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。

1.4 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS) 線粒體功能障礙在缺血再灌注損傷中起重要作用，一氧化氮(NO)作為一種自由基通過修飾線粒體功能，介導(dǎo)缺血再灌注損傷后的細(xì)胞保護(hù)作用。NO的產(chǎn)生由氧化還原酶一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)介導(dǎo)，NOS有3種亞型：神經(jīng)元型NOS(nNOS)、內(nèi)皮型NOS(eNOS)、免疫或誘導(dǎo)型NOS(iNOS)。Cho等[17]利用脂多糖或短暫性前腦缺血進(jìn)行預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，無iNOS的小鼠不會產(chǎn)生對局灶性缺血的耐受性，提示在預(yù)處理晚期，NO的產(chǎn)生主要由iNOS介導(dǎo)。

NO的細(xì)胞保護(hù)作用主要通過蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(S-亞硝基化作用)，激活環(huán)磷鳥苷酸(cGMP)第二信使系統(tǒng)和形成過氧亞硝酸鹽實(shí)現(xiàn)。S-亞硝基化可抑制N-甲基-D-天門冬氨酸受體活性[18]及抑制細(xì)胞凋亡[19]達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。許多研究表明，cGMP信號通路激活蛋白激酶G(PKG)，抑制細(xì)胞死亡。Costa等[20]研究證實(shí)，在心肌細(xì)胞的缺血再灌注中，PKG的激活能促使線粒體三磷酸腺苷(ATP)敏感的K通道(mitoKATP)開放，通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開啟和關(guān)閉，減少細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。NO與超氧化物反應(yīng)生成過氧亞硝酸鹽具有神經(jīng)保護(hù)作用。Liu等[21]證實(shí)過氧亞硝酸鹽能夠誘導(dǎo)血管舒張并抑制血小板聚集。Rassaf等[22]研究表明，過氧亞硝酸鹽的增加對心臟有保護(hù)作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了NO的保護(hù)效應(yīng)。

Belaidi等[23]研究表明，iNOS是HIF-1的靶基因，低氧情況下，HIF-1表達(dá)上調(diào)的同時，NO的表達(dá)也增加。因此推測腦缺血后NO的升高作為一種生物學(xué)機(jī)制，在腦缺血保護(hù)機(jī)制中起重要作用。

2 臨床研究

臨床上很難對缺血再灌注部位進(jìn)行缺血預(yù)處理。近年來研究證實(shí)，一個器官的短暫缺血可誘導(dǎo)另一個器官的缺血耐受，這一現(xiàn)象被稱為遠(yuǎn)隔器官缺血預(yù)處理(remote ischemic preconditioning，RIPC)。目前國內(nèi)外有大量RIPC的研究，大量證據(jù)證明了其的安全性和有效性。Li等[24]在10例大腦中動脈狹窄及24名健康志愿者中進(jìn)行肢體遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理，包括200 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)上臂加壓5 min后再灌注，重復(fù)5個周期，結(jié)果提示受試者血壓和心率均在正常范圍內(nèi)波動，驗(yàn)證了LRIPC的安全性及可行性。Meng等[25]的前瞻性隨機(jī)試驗(yàn)則證實(shí)了雙側(cè)上臂短暫缺血預(yù)處理對減少腦卒中復(fù)發(fā)的有效性，試驗(yàn)選取了68例有癥狀性動脈粥樣硬化性顱內(nèi)動脈狹窄的病人，其中38例接受300 d的RIPC，包括雙側(cè)上肢袖帶加壓至200 mmHg及再灌注，每天進(jìn)行兩次，每次5個周期，在第90天和第300天試驗(yàn)組復(fù)發(fā)性卒中發(fā)生率分別為5.0%和7.9%，而對照組在第90天和第300天的發(fā)生率分別為23.3%和26.7%，提示遠(yuǎn)隔器官缺血預(yù)處理具有神經(jīng)保護(hù)作用。Liu等[26]應(yīng)用RIPC大鼠模型對預(yù)處理后1 h及再灌注后3 d的血液進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)RIPC可以阻止短暫大腦中動脈閉塞后CD3+、CD8+T細(xì)胞及CD3+、CD161a(+)NKT細(xì)胞的減少，提高外周血中B細(xì)胞的百分比和CD43+、CD172a(+)非炎癥性單核細(xì)胞的百分比，并誘導(dǎo)白介素-6(IL-6)的表達(dá)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的增高。以上提示RIPC可以在嚴(yán)重腦缺血來臨前通過動員外周免疫系統(tǒng)來提供保護(hù)作用，從而增強(qiáng)宿主的防御作用，體現(xiàn)了機(jī)體的調(diào)節(jié)作用。

3 展 望

在全球范圍內(nèi)，缺血性腦卒中是導(dǎo)致死亡的第二大原因，也是造成殘疾的第三大原因。缺血預(yù)處理概念的提出，是近年來腦血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，晚期基因管理在神經(jīng)保護(hù)方面起到了重要作用。深入了解其機(jī)制和開展新的研究，對缺血性腦卒中病人的治療等方面提供了重要的理論基礎(chǔ)和臨床價值。