一個鳳丹PoFAD2基因家族新成員PoFAD2-2的克隆及表達模式分析

孫 靜，陳 明，孟家松，張克亮，陶 俊

(揚州大學園藝與植物保護學院/江蘇省作物遺傳生理重點實驗室，江蘇 揚州 225009)

脂肪酸去飽和酶(FAD)是植物脂肪代謝的關鍵酶，它能促使脂肪酸轉化為不飽和脂肪酸。目前，人們已經通過對擬南芥等植物的研究，分離出多種參與脂肪酸去飽和代謝過程中相關酶的編碼基因，分別為FAD2、FAD3、FAD6、FAD7、FAD8[1]。根據雙鍵位置的不同，將其分為△9脂肪酸去飽和酶、△12脂肪酸去飽和酶和△15脂肪酸去飽和酶[2-4]。其中，△9脂肪酸去飽和酶是唯一可溶的去飽和酶，它僅包括硬脂酰(18∶0)-ACP去飽和酶(Stearoyl-ACP desaturase，SAD)，△12脂肪酸去飽和酶和△15脂肪酸去飽和酶為膜蛋白[1]，編碼△12脂肪酸去飽和酶的基因有FAD2、FAD6，編碼△15脂肪酸去飽和酶的基因有FAD3、FAD7、FAD8[5-7]。

FAD2基因編碼的△12脂肪酸去飽和酶是合成不飽和脂肪酸的關鍵酶，也是植物合成不飽和脂肪酸的限速酶。FAD2位于內質網膜上，主要催化脂肪酸鏈第12位和第13位碳原子之間形成雙鍵，將油酸轉化成亞油酸，使油酸能夠進一步去飽和[8-10]。目前，人們已經從很多植物中克隆出FAD2的基因序列[11-18]，在擬南芥等少數植物中，只含有1個FAD2基因，而在其他大多數植物中發(fā)現有多個FAD2基因。如大豆中有4個，油橄欖中有2個，玉米中有3個。同一物種中FAD2基因不同，其作用也不盡相同。由于在種子油脂儲存和植物質膜構成中均有多不飽和脂肪酸參與，因此可將不同FAD2基因分為種子儲存油脂的種子特異型和維持細胞質膜脂肪酸代謝所需要的組成型2種。

鳳丹(PaeoniaostiiT. Hong & J. X. Zhang)又名銅陵牡丹、銅陵鳳丹，產自安徽省銅陵縣鳳凰山，芍藥科芍藥屬，屬于油用牡丹的主要品種。近年來，人們發(fā)現鳳丹中α-亞麻酸含量特別高，作為一種新型的油料作物，分離牡丹植物中的FAD2基因，研究其表達模式是十分必要的。目前，少有研究報道鳳丹PoFAD2基因的表達模式及功能，查閱文獻后發(fā)現，宋淑香[19]曾做過一些研究。

本研究擬對PoFAD2新成員進行克隆和生物信息學分析，及其在植物體不同部位和時期的相對表達分析，以期進一步探究PoFAD2在鳳丹中的作用，為牡丹種子高α-亞麻酸含量的進一步研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選用江蘇省揚州市揚州大學牡丹種質資源圃(32°23′N，119°24′E)種植的鳳丹為試驗材料，采集盛花期的根、莖、葉、花、子房及種子(花后40 d、60 d、80 d、100 d、120 d)，立即置于液氮中速凍，-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，pMD19-T載體、TaqDNA聚合酶、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒說明書提取鳳丹種子及葉片的總RNA，提取RNA后，取1 μl進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測其質量及濃度，剩余的保存在-80 ℃冰箱中。cDNA第一鏈的合成利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa公司產品)完成。

1.2.2 引物設計 根據NCBI報道的鳳丹轉錄組數據(登錄號：SRP051810)，篩選到PoFAD2-1和PoFAD2-2 2個基因序列，利用Primer Premier5.0軟件設計引物PoFAD2-1F：5′-CAATGGGAGCCGGTGGTCGAATGGC-3′和PoFAD2-1R：5′-ACTCGTTCCGATACCAAAACACACC-3′以及PoFAD2-2F：5′-ATTGTGGAACAATGGGTGCCGGTGG-3′和PoFAD2-2R：5′-TTATTCAAACTTATTCTTGTACCAG-3′，擴增鳳丹PoFAD2-1、PoFAD2-2基因的開放閱讀框(ORF)。

1.2.3 鳳丹PoFAD2-2基因全長的獲得 利用設計的引物對PoFAD2-1和PoFAD2-2的cDNA進行擴增，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對2次擴增的PCR產物進行檢測，目的條帶采用MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit試劑盒(TaKaRa公司產品)進行回收，然后采用pEASYTM-T5 Zero Cloning Kit試劑盒(全式金公司產品)進行TA克隆，轉化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α體內，然后進行抗生素(氨芐西林)篩選，抗生素質量濃度為100 mg/ml。最后將陽性克隆送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.4 生物信息學分析 cDNA全長的開放閱讀框及編碼氨基酸利用Bioedit軟件來預測。利用生物學軟件DNAMAN5.0進行序列的拼接和翻譯，利用在線工具NCBI Blast進行序列的同源性比對，并采用MEGA5.0的鄰接法(NJ)利用獲得基因將鳳丹與目前主要的幾個油料作物進行系統進化樹的構建。利用軟件Prot Param、Prot Scale、TMHMM2.0、SMART分別對基因編碼蛋白質的理化性質、親疏水性、跨膜結構域、保守功能域進行分析。

1.2.5 基因表達模式的分析 利用熒光定量PCR儀CFX96 Reak Time System(Bio-Rad公司產品)，采用實時定量PCR(qRT-PCR)技術分析PoFAD2-2基因在鳳丹根、莖、葉、花、子房和種子中的表達差異，并與PoFAD2-1做對比。實時定量PCR采用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司產品)，內參為鳳丹的ubiquitin基因，特異性表達引物如表1顯示。擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。使用Bio-Rad CFX Manager V1.6.541.1028軟件收集反應的Ct值。每個樣品重復3次，最終結果采用2-△△Ct法[20]進行計算。

表1鳳丹PoFAD2-1、PoFAD2-2基因克隆所用引物及其序列

Table1PrimersandsequenceofPoFAD2-1andPoFAD2-2genecloning

2 結果與分析

2.1 鳳丹PoFAD2-2基因克隆及序列分析

以鳳丹葉片cDNA為模板，經PCR擴增后獲得基因片段，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果與預期相符，測序后經Blast比對確定其為鳳丹PoFAD2-2基因。序列分析結果表明，該基因OFR全長為1 155 bp，編碼384個氨基酸，蛋白質分子量為44 000，等電點為8.51。

為對比PoFAD2-1與PoFAD2-2序列上的差異，用DNAMAN軟件對PoFAD2-1及PoFAD2-2基因編碼的氨基酸進行氨基酸組成與數目對比以及氨基酸序列比對(圖1)。

表2顯示，PoFAD2-1編碼的氨基酸序列長度為383，酸性氨基酸及酰胺個數為52，堿性帶正電荷的R基氨基酸個數為55。PoFAD2-2編碼的氨基酸序列長度為384，酸性氨基酸及酰胺個數為50，堿性帶正電荷的R基氨基酸個數為57。2個基因編碼的氨基酸一致性為77.43%，相似性一般。

為了探討鳳丹PoFAD2-1基因、PoFAD2-2基因與其他植物同類基因的親緣關系及可能的作用方式，用MEGA軟件對PoFAD2-1和PoFAD2-2基因編碼的氨基酸序列與柑橘、油茶、大豆、南瓜等已報道24個物種FAD2基因編碼的氨基酸序列進行比對，構建Neighbor-Joining系統進化樹，設定重復抽樣次數為1 000。聚類分析結果(圖2)表明，對于PoFAD2-1基因，鳳丹在進化上與油茶[Camelliaoleifera(KJ995981.1)]、珙桐[Davidiainvolucrata(EU275211.1)]、毛果楊[Populustrichocarpa(Populusbalsamiferasubsp.trichocarpa) (XM_002297624.2)]、歐榛[Corylusavellana(KF856626.1)]、大豆[Glycinemax(soybean) (AY954300.1)]、大豆[Glycinemax(soybean) (BT098510.1)]的親緣關系較近。對于PoFAD2-2基因，鳳丹在進化上與油橄欖[Oleaeuropaea(common olive) (KY652929.1)]、靛木[Wrightiatinctoria(GU190864.1)]具有較高的相似性。PoFAD2-1與PoFAD2-2親緣關系較遠。

表2PoFAD2-1和PoFAD2-2基因編碼的氨基酸組成及數目

Table2AminoacidcompositionandnumberofproductsencodedbyPoFAD2-1andPoFAD2-2genes

氨基酸 數目PoFAD2-1PoFAD2-2氨基酸 數目PoFAD2-1PoFAD2-2丙氨酸2325亮氨酸3837精氨酸1616賴氨酸1520天冬酰胺1310甲硫氨酸85天冬氨酸1721苯丙氨酸2025半胱氨酸66脯氨酸2625谷氨酰胺68絲氨酸2424谷氨酸1611蘇氨酸1920甘氨酸2225色氨酸1312組氨酸2421酪氨酸2825異亮氨酸1618纈氨酸3330

圖1 鳳丹PoFAD2-1與PoFAD2-2蛋白質氨基酸序列對比Fig.1 Amino acid sequences comparison of PoFAD2-1 and PoFAD2-2

圖2 鳳丹PoFAD2-1和PoFAD2-2系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of PoFAD2-1 and PoFAD2-2

2.2 PoFAD2-2生物信息學分析

用NCBI軟件對PoFAD2-2的保守結構域進行分析，用TMHMM軟件對PoFAD2-2的跨膜結構域進行分析，結果(圖3)表明，PoFAD2-2蛋白質屬于膜結合型的FAD超家族，在第 105～110個氨基酸位點、第 140～145個氨基酸位點、第 315～320氨基酸位點3處共有3個可能的Fe2+結合位點，可能起催化作用。PoFAD2-2有5個跨膜結構域，分別為 49～71、81～102、179～196、223～245、250～272位的氨基酸，第5個跨膜區(qū)疏水性較強。

圖3 PoFAD2-2編碼蛋白質的保守結構域(a)和跨膜結構域(b)分析Fig.3 Analysis of the conserved domain of PoFAD2-2-encoded proteins (a) and transmembrane domain (b)

2.3 PoFAD2疏水性分析

利用Hydrophobicity ProtScale軟件預測PoFAD2蛋白質的疏水性。圖4顯示，PoFAD2-2基因所編碼的蛋白質疏水性最小為-3.244，最大值為2.744，說明該蛋白質為偏親水性蛋白質。其中49～102、179～272位的氨基酸殘基區(qū)域構成了2個疏水性區(qū)域，1～48、103～178、273～384位的氨基酸殘基區(qū)域構成了3個親水性區(qū)域。

圖4 PoFAD2-2基因編碼蛋白質的疏水性Fig.4 Hydrophobicity analysis of the protein encoded by the PoFAD2-2 gene

2.4 鳳丹PoFAD2-1和PoFAD2-2基因在植株不同組織中的表達分析

采用qRT-PCR方法測量了PoFAD2-1和PoFAD2-2在鳳丹根、莖、葉、花、子房、種子中的表達量，以及開花后40 d、60 d、80 d、100 d、120 d時PoFAD2-1和PoFAD2-2在種子中的表達量。圖5顯示，PoFAD2-1在鳳丹的根、莖、葉、花、子房、種子中均有表達，而PoFAD2-2在根和子房中沒有表達。PoFAD2-1主要在子房和種子中表達，PoFAD2-2主要在花和葉表達。隨著種子逐漸成熟，PoFAD2-1和PoFAD2-2在種子中的表達量均是先降低再升高然后再降低，PoFAD2-1表達量在100 d升高，而PoFAD2-2表達量在80 d升高。PoFAD2-2在種子中不同時期的表達量均低于PoFAD2-1(圖5)。

3 討 論

脂肪酸有飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸又分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。油酸作為單不飽和脂肪酸同飽和脂肪酸一樣能由人體合成，而亞油酸則需要從食物中獲取。亞油酸是單不飽和油酸轉化為多不飽和酸的第一步中間產物，因此，FAD2基因作為將油酸轉化為亞油酸的關鍵基因，是非常重要的。

關于FAD2基因的研究很多，人們已經從芝麻、橄欖樹、油茶、文冠果、油葵、黃瓜、油桐、花生等植物中克隆出FAD2基因，而且這些植物中大多不止1個FAD2基因。在黃瓜中發(fā)現了2個不同拷貝的FAD2基因[21]，從花生中分離出了6個不同拷貝的FAD2基因[22]。不同FAD2基因在植物體中的作用可能也不同。它們在序列特點、表達調控和功能機理方面都存在著顯著差異[23-24]。王仲偉等[25]發(fā)現，油茶CoFAD2-2基因的表達模式比較特異，在開花后42周到44周之間(油茶種子趨于成熟)高表達，其他階段表達水平一直維持在較低水平，尤其在種子成熟后期趨于更低水平的表達。Liu等[26]發(fā)現，在低溫脅迫下，棉花FAD2-2基因表達量顯著升高，而FAD2-3基因的表達則被抑制，FAD2-4和FAD2-5基因的表達量只是輕微上升。Hernández等[16]發(fā)現，油橄欖中的FAD2-1使幼小種子中儲存的脂質去飽和，而FAD2-2使成熟的種子和中果皮中的脂肪去飽和。Suresha等[27]指出，FAD2在芥菜的所有組織中表達，在油的合成過程中受到調控。FAD2-1和FAD2-3-1在亞麻薺中的表達主要集中在花和種子上[28]。對花生中FAD2轉錄本分布進行分析，發(fā)現FAD2-1基因在發(fā)育種子中的表達量比FAD2-2基因高70倍，但是FAD2-2基因在花中大量表達[22]。

根據FAD2基因的位置和表達模式將它分為4種類型，即FAD2-1、FAD2-2、FAD2-3和FAD2-4。FAD2基因的4個變異顯示出高度的序列相似性，但在脂肪酸修飾中的表達模式和功能存在差異[29]。FAD2-1是一種種子特異性去飽和酶，可合成幼苗和花芽中的多不飽和脂肪酸[30]。FAD2-2基因在大豆的營養(yǎng)組織和整個種子發(fā)育中呈組成型表達[31]。FAD2-2是負責亞油酸合成的主要基因[32]。幾乎在所有組織中FAD2-3和FAD2-4均主要合成多不飽和脂肪酸。據報道，FAD2-3多肽與FAD2-4多肽具有98%的相似性[33]。

PoFAD2-1基因在花中表達量最低，在子房中表達量最高，在花后40 d、60 d、80 d、100 d、120 d的種子中PoFAD2-1表達量分別為PoFAD2-2的8.8倍、5.7倍、2.8倍、9.0倍、1.0倍，而且在種子發(fā)育進程中，剛開始表達量比較高，然后快速下降，在花后80 d時又開始上升，花后100 d又急劇下降。這與宋淑香[19]所測的鳳丹PoFAD2-1熒光定量結果相似。PoFAD2-1基因表達量在種子發(fā)育100 d時開始急劇下降，這與鳳丹不飽和脂肪酸含量在種子發(fā)育100 d時最高，隨后不飽和脂肪酸含量又下降的趨勢一致[19]。說明，PoFAD2-1基因確實是種子特異性基因。

本研究發(fā)現，PoFAD2-2基因在鳳丹莖、葉、花、種子中均有表達，在根、子房中卻沒有表達，在種子整個發(fā)育期中的表達量都很低，在花中的表達量最高，說明此基因表達具有組織特異性。PoFAD2-2基因在種子發(fā)育進程中的表達趨勢與PoFAD2-1相同。而PoFAD2-2基因在葉和花中的表達量都較高，分別是PoFAD2-1表達量的8.4倍、71.0倍。這可能是因為PoFAD2-2基因是負責亞油酸合成的主要基因。