梔子水提浸膏中化學(xué)成分分析及主要成分的含量測定研究

周嚴(yán)嚴(yán) 祖力皮亞,2 趙海譽(yù) 邊寶林 王宏潔

1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700 2.首都醫(yī)科大學(xué)

中藥梔子來源于茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥成熟果實(shí)，為常用中藥。梔子原名卮子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。梔子性寒、味苦、無毒，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒的功效[1-3]?，F(xiàn)代植物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，梔子中含有大量的環(huán)烯醚萜類化合物，同時(shí)還存在一些單萜、二萜、三萜、黃酮、香豆素等，其中環(huán)烯醚萜類成分為梔子屬植物的特征性成分[4-5]。

本研究以純凈水作為溶劑提取制備梔子水提浸膏，首先采用超高效液相高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（ultra high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry，UHPLC-MS）對梔子水提浸膏主要化學(xué)成分進(jìn)行分析。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，2015年版《中華人民共和國藥典》中僅以梔子苷作為梔子質(zhì)量控制的唯一含量測定指標(biāo)[6]，未能全面地反映出梔子藥材的內(nèi)在質(zhì)量。既往研究報(bào)道，梔子水提浸膏中梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的含量較高[7-9]，本研究前期預(yù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這點(diǎn)，因此本文采取高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定梔子水提浸膏中主要成分梔子苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的含量，為后續(xù)研究梔子配方顆粒及其藥效提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器 Ultimate 3000超高效液相色譜儀（含自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機(jī)、低壓四元梯度泵、PDA檢測器）和LTQ Orbitrap velos pro質(zhì)譜儀含高分辨靜電場軌道阱質(zhì)譜、電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI） 購自美國 Thermo Fisher公司；LC 20AT液相色譜儀購于島津企業(yè)管理中國有限公司；Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為德國Ika公司產(chǎn)品；KQ-250B型超聲波清洗器購于昆山市超聲儀器有限公司；XA105-METTLER TOLEDO十萬分之一電子天平、JA503-DuaIRange萬分之一電子天平購于上海舜字恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 材料和試劑 對照品：梔子苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、羥異梔子苷對照品均購于北京賽百草科技有限公司（批號：17060703、16021804、SH7032103），HPLC純度≥98%。供試品：梔子購于北京仟草中藥飲片有限公司（產(chǎn)地：江西；批號：160803001）。甲醇、甲酸、乙腈均購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司（批號：174486、168642、175160）。

1.3 方法

1.3.1 梔子水提浸膏的制備 稱取中藥材梔子450g，以純凈水回流提取2次，第1次用8倍量的水，第2次用6倍量的水，每次2h。過濾，合并濾液，常壓濃縮到不流動(dòng)狀態(tài)，即得梔子水提浸膏。

1.3.2 對照品與供試品溶液的制備

1.3.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取梔子苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、羥異梔子苷對照品5mg，置于5mL容量瓶，加甲醇溶解至5mL，定容，使終濃度為1mg·mL-1，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得各對照品溶液。

1.3.2.2 供試品溶液的制備 稱取梔子水提浸膏1mg，置于10mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至10mL，搖勻，即得供試品溶液。

1.3.3 色譜條件

1.3.3.1 化學(xué)成分鑒定色譜條件 色譜柱：Agilent Extend-C18 柱（3.0mm×150mm，3.5μm）；柱溫：45℃；流動(dòng)相為A（乙腈）和B（0.1%甲酸-水），梯度洗脫0～20min，10%～50%A；20～30min，50%～95%A；30～36min，95%A；流速：0.3mL·min-1；進(jìn)樣體積：對照品為 5μL，供試品為2μL。

1.3.3.2 含量測定色譜條件 色譜柱：phenomenex-C18 柱(4.6mm×150mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水（12:88）；流速：1mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10μL，時(shí)間：30min；在線紫外波長掃描范圍：200～400nm。

④應(yīng)創(chuàng)新管理機(jī)制，提高隊(duì)伍素質(zhì)。深化用人制度改革。積極推行全員聘用制度和崗位管理制度，對全體職工實(shí)行競爭上崗、持證上崗，以崗定責(zé)，以崗定酬，用人機(jī)制逐步從過去的固定用人、身份管理向合同用人、崗位管理轉(zhuǎn)變。積極做好基層水利職工培訓(xùn)工作，提高隊(duì)伍素質(zhì)。推薦基層干部到更高層次機(jī)關(guān)單位掛職鍛煉；利用國家鼓勵(lì)大學(xué)畢業(yè)生、研究生等高素質(zhì)人才到基層工作的契機(jī)，吸納更多高素質(zhì)人才進(jìn)入基層水利隊(duì)伍。

1.3.4 質(zhì)譜條件 ESI源參數(shù)設(shè)定如下：正負(fù)離子掃描模式，正離子模式下毛細(xì)管溫度為350℃，毛細(xì)管電壓為35V，噴霧電壓為3.5kV，鞘氣（N2）流速為40psi，輔助氣（N2）流速為 10psi；負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓為35V，噴霧電壓為3.5kV，鞘氣（N2）流速為35psi，輔助氣（N2）流速為10psi。樣品一級質(zhì)譜在FT模式下進(jìn)行全掃描，分辨率R為30 000，m/z掃描范圍為150～1 000，二級及三級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描（data dependent scan）。數(shù)據(jù)采集和分析采用Xcalibur，Metworks和 Mass Frontier 7.0 軟件。

2 結(jié)果

2.1 UHPLC-MS/MS技術(shù)鑒定與比較梔子水提浸膏的主要化學(xué)成分 根據(jù)已知化合物的質(zhì)譜裂解碎片及結(jié)構(gòu)，推導(dǎo)出不同類型化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律。借助上述不同種類化合物的裂解規(guī)律和未知化合物的裂解碎片，與參考文獻(xiàn)[10-12]對比，梔子水提浸膏中共推導(dǎo)鑒定化合物16種，包括環(huán)烯醚萜類7種、有機(jī)酸類3種、黃酮類2種、其他類4種。見圖1-2和表1。

在保留時(shí)間6.09min下，梔子苷準(zhǔn)分子離子峰m/z 389.1456[M+H]+及 m/z 387.1286[M-H]-，其相對分子質(zhì)量388.1311Da。正離子模式下檢測到[M+Na]+峰m/z 411.1277，[M+K]+峰 m/z 427.1010 和 [M+HC6H10O5]+峰m/z 227.0920；負(fù)離子模式下，可檢測到[M+HCOO]-峰 m/z 433.1359，二級碎片離子 m/z 225.0780是由準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子葡萄糖殘基（相對分子質(zhì)量162Da）產(chǎn)生，并且其相對保留時(shí)間、分子離子峰和二級質(zhì)譜碎片信息與對照品完全一致，故鑒定該化合物為梔子苷，見圖3。其裂解方式見圖4。說明環(huán)烯醚萜類化合物的裂解方式是以糖苷鍵斷裂為主，丟失一分子葡萄糖基(相對分子質(zhì)量162Da)和H2O。

圖1 梔子水提浸膏總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms in water extracts of Gardenia jasminoides

圖2 梔子苷對照品與梔子水提浸膏中梔子苷二級質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS spectrum of geniposide reference and geniposide in water extracts of Gardenia jasminoides

圖3 正離子模式下梔子苷的裂解方式示意圖Fig.3 Schematic diagram of the cleavage mode of geniposide in positive ion mode

在保留時(shí)間4.77min下，京尼平1-β-D-龍單雙糖苷準(zhǔn)分子離子峰m/z 549.1824[M-H]-及m/z 551.1989[M+H]+，其相對分子質(zhì)量550.1989Da。正離子模式下檢測到[M+Na]+峰 m/z 573.1810，[M+K]+峰 m/z 589.1529，[M+H-glc]+峰 m/z 389.1454 和 [M+H-2glc]+峰 m/z 227.0922；負(fù)離子模式下可檢測到[M+HCOO]-峰m/z 559.1891，與負(fù)離子模式下檢測到的對照品比較，相對保留時(shí)間、分子離子峰和二級質(zhì)譜碎片信息都完全一致，則可確定此化合物為京尼平1-β-D-龍單雙糖苷。見圖4。

羥異梔子苷準(zhǔn)分子離子峰m/z 403.1245[M-H]-，負(fù)離子模式下可檢測到[M+HCOO]-峰m/z 449.1290，二級碎片離子m/z 241.0720，是由準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子葡萄糖殘基（相對分子質(zhì)量162Da）產(chǎn)生，并且其相對保留時(shí)間、分子離子峰和二級質(zhì)譜碎片信息與對照品完全一致，故鑒定該化合物為羥異梔子苷。見圖5。

化合物2和化合物11（已知化合物梔子苷）裂解碎片相對一致，說明兩者都是環(huán)烯醚萜類化合物?；衔?的保留時(shí)間為2.71min，且高分辨質(zhì)譜給出其分子式為C16H22O10，誤差值0.738ppm。負(fù)離子模式下，化合物2的特征性碎片m/z 373.1140，化合物11的特征性碎片m/z 387.1298，由此可以推測，化合物2是由化合物11失去一個(gè)甲基、加一個(gè)氫而來，化合物11為梔子苷，由此可推測化合物2為梔子苷酸。梔子苷酸化學(xué)結(jié)構(gòu)圖見圖6。

圖4 京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷對照品與梔子水提浸膏中京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷二級質(zhì)譜圖Fig.4 MS/MS spectrum of genipin 1-β-D-gentiobiolycosidereference and genipin 1-β-D-gentiobiolycosidein water extracts of Gardenia jasminoides

圖5 羥異梔子苷對照品與梔子水提浸膏中羥異梔子苷的二級質(zhì)譜對比圖Fig.5 MS/MS spectrum of gardenoside reference and gardenoside in water extracts of Gardenia jasminoides

圖6 梔子苷酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.6 Chemical structure diagram of geniposidic acid

2.2 HPLC法測定梔子水提浸膏中主要成分的含量

2.2.1 波長的確定 分別適量取對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀進(jìn)行全波長掃描，分別在238、254、280、310、330、350、370nm 下提取色譜圖。根據(jù)色譜圖分析比較，在238nm下，樣品中主要成分梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的分離度和響應(yīng)值高，結(jié)合藥典因此確定測定梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的測定波長為238nm。見圖7-8。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇 按《中華人民共和國藥典》2015年版梔子項(xiàng)下測定法[6]，流動(dòng)相選擇為乙腈與水，進(jìn)行不同比例的一系列實(shí)驗(yàn)，流動(dòng)相的比例分別為1:99、10:90、12:88、15:85。根據(jù)梔子主要成分梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的響應(yīng)值和分離度結(jié)果，選擇流動(dòng)相乙腈與水百分比例為12:88。流動(dòng)相百分比為12:88時(shí)，梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的響應(yīng)值和分離度較好，色譜峰的對稱度較好。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取梔子苷對照品5.34mg，以甲醇配成 534、106.8、53.40、26.70、13.35、6.68μg·mL-16種濃度的溶液，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為：y=14 339x-63 120（r=0.9997，n=6）；精密稱取京尼平 1-β-D-龍膽雙糖苷對照品2.00mg，以甲醇配成500、100、50、25、12.5、6.25μg·mL-1共 6 種濃度溶液，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為 y=6 802.20x-28 631（r=0.9998，n=6）。

表1 梔子水提浸膏中化合物的質(zhì)譜信息Tab.1 Mass spectrometry information for compounds in Gardenia jasminoides

圖7 梔子苷對照品和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷對照品色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of geniposide and genipin 1-β-D-gentiobiolycoside

圖8 梔子水提浸膏色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of water extracts of Gardenia jasminoides

2.2.3.2 精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD） 實(shí)驗(yàn) 取含濃度為53.40μg·mL-1的梔子苷和50.00μg·mL-1的京尼平1-β-D龍膽雙糖苷混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣10μL，連續(xù)測定5次，記錄峰面積，梔子苷，RSD值為0.49%，京尼平1-β-D龍膽雙糖苷RSD值為0.55%，均符合方法學(xué)要求。

2.2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取梔子水提浸膏一份，分別于0、2、4、6、8、12h 測定梔子水提浸膏中的梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的峰面積。梔子水提浸膏中的梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的RSD值分別為0.40%、0.50%，結(jié)果表明梔子水提浸膏中梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷均在12h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取6份梔子水提浸膏各10mg，分別加甲醇25mL溶解，超聲處理30min，搖勻；再從中精密吸取1mL，置5mL容量瓶，加甲醇至5mL，稀釋，搖勻，即得供試品溶液，測定兩種主要成分在水提浸膏中的含量。梔子水提浸膏中梔子苷含量RSD值為2.13%，京尼平1-β-D龍膽雙糖苷RSD值為2.12%。

2.2.3.5 加樣回收率 各取已知含量的梔子水提浸膏6份，精密加入梔子苷對照品和京尼平1-β-D-龍單雙糖苷對照品，按樣品測定方法制備供試品溶液，測定，測得平均回收率分別為102.68%和103.48%。見表2-3。

2.2.3.6 含量測定結(jié)果 梔子水提浸膏中梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的平均含量分別為13.42%和4.88%。見表4。

表2 梔子水提浸膏中梔子苷成分的回收率結(jié)果Tab.2 Recovery results of jasminoidin in water extract solution of Gardenia jasminoides

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用純凈水制備梔子水提浸膏，對水提浸膏中主要化學(xué)成分進(jìn)行了UHPLC-MS鑒定分析，同時(shí)對其中含量較高的兩種成分梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷進(jìn)行了含量測定。

基于UHPLC-MS技術(shù)，根據(jù)質(zhì)譜裂解碎片和文獻(xiàn)對比，梔子水提浸膏中共推導(dǎo)鑒定化合物16種，包括環(huán)烯醚萜類7種（雞矢藤次苷甲酯、梔子苷酸、羥異梔子苷、山梔子苷、京尼平1-β-D-龍單雙糖苷、梔子苷、6″-對香豆?；┠崞烬垎坞p糖苷），有機(jī)酸類3種[咖啡酸、3-O-咖啡?？崴帷?,4-咖啡酰-5-（3-羥基-3-甲基戊二酰）奎尼酸]，黃酮類2種（芒果苷、新芒果苷），其他類4種（Jasninoside B、反式紅花苷、順勢紅花苷、西紅花苷）。通過對梔子水提浸膏中主要化學(xué)成分進(jìn)行鑒定分析，明確了梔子水提浸膏的主要化學(xué)成分模式。羥異梔子苷由于已有標(biāo)準(zhǔn)品，所以也對其進(jìn)行了裂解規(guī)律分析。但是羥異梔子苷在原藥材中的含量較少，經(jīng)過水提之后含量會(huì)更低，故無法進(jìn)行含量測定。同時(shí)通過液質(zhì)分析提取羥異梔子苷的精確分子量有多個(gè)峰，說明其存在同分異構(gòu)體，所以并未對其進(jìn)行含量測定。在HPLC圖譜中從峰面積角度觀察到兩個(gè)主峰是梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷，因此本研究同時(shí)對梔子水提浸膏中的梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷兩種成分進(jìn)行了含量測定研究。結(jié)果表明梔子水提浸膏中梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的平均含量分別為13.42%和4.88%，此梔子質(zhì)量達(dá)到要求。說明此方法穩(wěn)定簡便，為以后在藥典中增加京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷為梔子含量測定指標(biāo)提供基礎(chǔ)，同時(shí)為后續(xù)梔子配方顆粒的藥效研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

表3 梔子水提浸膏中京尼平1-β-D-龍單雙糖苷成分的回收率結(jié)果Tab.3 Recovery results of genipin 1-β-D-gentiobiolycoside in water extracts of Gardenia jasminoides

表4 梔子水提浸膏中梔子苷和京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的含量（%）Tab.4 The content of geniposide and genipin 1-β-D-gentiobiolycoside in water extracts of Gardenia jasminoides(%)