低溫等離子體調(diào)控皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的作用與機(jī)制

任凱旋 夏育民

19世紀(jì)中期，電療法逐漸開始應(yīng)用于醫(yī)學(xué)治療中。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，等離子體以其獨(dú)特的療效被廣泛應(yīng)用于外科手術(shù)治療。等離子體最早用于電外科手術(shù)治療，通過熱效應(yīng)使細(xì)胞脫水、蛋白變性及組織壞死等原理對(duì)組織進(jìn)行切割、凝固及術(shù)中小血管止血。近年來常壓低溫等離子體受到廣泛研究,因其安全性高、離子活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在皮膚、腫瘤、耳鼻喉及口腔領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用前景[1]。與目前手術(shù)中常用的高溫等離子體不同，低溫等離子體主要應(yīng)用于殺菌、助基因轉(zhuǎn)染、細(xì)胞分離及促傷口愈合等方面。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CAP能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞活性、增殖、遷移、炎癥反應(yīng)[2]；并以ROS/RNS 作為介質(zhì)影響細(xì)胞分化、凋亡、細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞骨架及結(jié)締組織)的完整性[3]；抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[4]?，F(xiàn)有研究表明CAP能夠調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，然而CAP的產(chǎn)生機(jī)制、具體成分、功能及其作用機(jī)理尚不完全清楚，各研究之間沒有明確的統(tǒng)一界定標(biāo)準(zhǔn)，難以比較。因此本文就CAP對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 CAP發(fā)生機(jī)制

CAP的發(fā)生機(jī)制為基于電介質(zhì)阻擋放電、以射頻電容耦合的方式在正常大氣壓下產(chǎn)生等離子體，其主要成分為電子、離子、光子、原子、分子、活性自由基及射線等。與高溫平衡等離子體(>80℃)不同,CAP為非平衡等離子體,其特殊的物理性質(zhì)使其溫度維持在20℃～40℃，其機(jī)制為等離子體中電子升溫速度快于其他粒子，而CAP中含有大量質(zhì)量較大的離子、分子等，雖然局部電子溫度升高但等離子體整體仍保持低溫水平。從發(fā)生裝置將CAP分為直接等離子體源、間接等離子體源及混合等離子體源。直接等離子體源以人體作為一端電極，電介質(zhì)阻擋放電即為此類等離子體源，其直接采用空氣進(jìn)行激發(fā)產(chǎn)生等離子體，并直接作用于處理對(duì)象表面；間接等離子體源為由兩個(gè)電極產(chǎn)生等離子體后通過噴射裝置傳輸?shù)教幚聿课?，如等離子針、等離子炬等；混合等離子體源綜合了前兩種等離子體源的發(fā)生方式，如阻擋電暈放電MiniFlatPlaSter為此類等離子體發(fā)生裝置。從激發(fā)氣體所產(chǎn)生的等離子體成分可分為空氣、氬氣、氦氣及氮?dú)馀c氧氣的混合氣體；以作用于處理對(duì)象的方式不同可分為兩類，直接等離子體及間接等離子體，直接等離子體指等離子體流直接接觸處理對(duì)象，間接等離子體指等離子體使用等離子體處理后的媒介作用于研究對(duì)象發(fā)揮效應(yīng)，如等離子水(PAW)及等離子體處理過的培養(yǎng)基等。

2 CAP治療皮膚疾病

2.1 慢性難愈合傷口 CAP在體外實(shí)驗(yàn)中具有高效的抗原核生物和生物膜作用，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)慢性難愈合傷口也有抗感染作用。Wende等發(fā)現(xiàn)CAP作用后傷口細(xì)菌負(fù)荷量明顯少于未處理組，且傷口愈合程度也明顯優(yōu)于未處理組[5]。體外實(shí)驗(yàn)中CAP能減少慢性傷口細(xì)菌負(fù)荷、無任何副作用，而且在處理嚴(yán)重傷口時(shí)其促進(jìn)傷口愈合能力明顯強(qiáng)于安慰劑組。CAP能夠激活角質(zhì)形成細(xì)胞通過旁分泌作用釋放血管生成因子作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管生成，同時(shí)增加局部ROS/RNS濃度使血液灌注到損傷部位[6]。目前臨床研究已證實(shí)CAP處理慢性難愈合傷口2～5 min/d可顯著降低傷口的細(xì)菌負(fù)荷并促進(jìn)傷口愈合，MicroPlaSter多用于此類慢性難愈合傷口治療[7]。

2.2 皮膚腫瘤 CAP對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用有劑量依賴性，而且其抗腫瘤效果與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度成反比。氧化應(yīng)激與人皮膚腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切連系，與角質(zhì)形成細(xì)胞相關(guān)的皮膚腫瘤有基底細(xì)胞癌與鱗狀細(xì)胞癌兩種。長(zhǎng)期紫外線暴露導(dǎo)致的細(xì)胞抗氧化能力減弱可能與皮膚癌癥的發(fā)生有關(guān)。目前皮膚腫瘤方面的研究多為CAP對(duì)惡性黑素瘤的治療，Binenbaum等用冷等離子體射流處理黑素瘤細(xì)胞及裸鼠種植瘤，體外實(shí)驗(yàn)中CAP處理黑素瘤細(xì)胞60 s后，細(xì)胞增殖明顯抑制；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，CAP處理可抑制黑素瘤細(xì)胞侵入表皮層[8]，提示臨床可應(yīng)用CAP抑制黑素瘤的惡性侵襲性發(fā)展。

2.3 銀屑病 在銀屑病模型的體外實(shí)驗(yàn)中，CAP處理后細(xì)胞線粒體功能障礙且溶酶體滲出增加，IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、VEGF及其mRNA表達(dá)量均升高，IL-12表達(dá)量降低。已知銀屑病患者體內(nèi)IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α高于正常水平，且VEGF是銀屑病發(fā)生發(fā)展過程中炎癥和血管生成的關(guān)鍵因子。IL-12水平與銀屑病臨床癥狀相關(guān)，活化的T細(xì)胞通過IL-12和IL-23來放大炎癥反應(yīng)，因此臨床上常以IL-12作為治療銀屑病的靶點(diǎn)，同時(shí)CAP中的UVB臨床上常用于銀屑病皮損治療[9]。Klebes等在銀屑病皮損的臨床研究中采用療法為CAP處理1 min/cm2，每周5次共持續(xù)2周，75%患者2周后PASI評(píng)分降低，且紅斑及滲出均減少，提示CAP有望成為銀屑病的治療新方法[10]。

除以上幾種疾病外，CAP在延緩衰老[11]、黑素瘤[12]及異位性皮炎[13]的治療中也有著廣泛的應(yīng)用前景。

3 CAP對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的作用

3.1 CAP影響細(xì)胞周期 目前認(rèn)為CAP對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)主要是通過DNA氧化損傷造成，氧化損傷的DNA單鏈易在堿不穩(wěn)定位點(diǎn)斷裂導(dǎo)致DNA雙鏈解鏈，并與可能已經(jīng)存在的DNA斷裂片段形成彗星尾。與UVB導(dǎo)致的DNA損傷不同，CAP處理HaCaT細(xì)胞后立刻出現(xiàn)彗星尾結(jié)構(gòu)，處理后4 h內(nèi)開始降低且在24 h內(nèi)恢復(fù)正常。與UVB照射組相比，細(xì)胞內(nèi)DNA 24 h甚至48 h后DNA損傷仍未能修復(fù)，提示UVB導(dǎo)致的DNA損傷不可逆，而CAP處理可激活細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制，同時(shí)達(dá)到阻滯細(xì)胞周期的效應(yīng)[14]。CAP處理后的細(xì)胞呈劑量依賴性地阻滯在G2/M期，ROS導(dǎo)致的DNA結(jié)構(gòu)損傷被ATM/ATR感知，ATM/ATR激活CHk1/2，導(dǎo)致細(xì)胞周期依賴性激酶25阻滯細(xì)胞有絲分裂。ATM/ATR也可以通過激活腫瘤抑制蛋白p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CAP產(chǎn)生的H2O2作用于G1和G2/M細(xì)胞周期檢查點(diǎn)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于G2/M期[15]。CAP處理后p53表達(dá)增加、PARP分解，但細(xì)胞周期停滯蛋白p21及其mRNA表達(dá)含量明顯升高，提示等離子體可通過直接調(diào)節(jié)基因表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞周期[11]。

有研究發(fā)現(xiàn)CAP使細(xì)胞周期停滯于G2/M檢查點(diǎn)以促使腫瘤細(xì)胞凋亡，主要是通過降低細(xì)胞周期蛋白B1及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1，上調(diào)p53、細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子1(p21),升高Bax(Bcl-2-like protein 4)/Bcl-2比值來介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。CAP可降低癌細(xì)胞的遷移能力和細(xì)胞活性，研究表明CAP對(duì)細(xì)胞周期內(nèi)處于各期的細(xì)胞均有影響，未進(jìn)行細(xì)胞有絲分裂的細(xì)胞在CAP作用下多停滯于G0/G1或者S期[17]，CAP處理后S期細(xì)胞中組蛋白磷酸化的H2AX(γH2AX)含量明顯增多，由于γH2AX是DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志，由此證明CAP主要通過氧化損傷DNA來阻滯細(xì)胞周期。

3.2 CAP促進(jìn)細(xì)胞因子分泌 CAP能夠調(diào)控3000多條結(jié)構(gòu)蛋白基因表達(dá)以及某些炎癥介質(zhì)的釋放，如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等。Zhong等發(fā)現(xiàn)CAP處理后人角質(zhì)形成細(xì)胞中IL-12降低，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA表達(dá)增多[9]。CAP也能顯著誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)青蒿琥酯(Artemin)、EGF、內(nèi)皮素-1(ET-1)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-2)及uPA的表達(dá)。CAP刺激角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)TGF-β1和TGF-β2，TGF-β的功能主要有炎癥趨化、纖維化、血管生成及誘導(dǎo)自身基因表達(dá)的作用[18]。在治療傷口過程中，CAP能夠激活角質(zhì)形成細(xì)胞分泌傷口愈合相關(guān)分子促進(jìn)傷口愈合，且通過旁分泌作用釋放血管生成因子作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管生成。

3.3 CAP調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白 CAP可通過下調(diào)縫隙連接蛋白Cx43(gap junctional protein connexin 43)、鈣黏蛋白E(E-cadherin)、整合蛋白(integrins)來調(diào)節(jié)細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附作用。

Cx43分布于角質(zhì)形成細(xì)胞外表面，高表達(dá)的Cx43使細(xì)胞間連接密切從而抑制細(xì)胞遷移和傷口愈合。CAP處理后角質(zhì)形成細(xì)胞中Cx43 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低，提示CAP可能通過降低角質(zhì)形成細(xì)胞表面的Cx43調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移能力，促進(jìn)傷口愈合[3]。等離子體處理后1 h和24 h后角質(zhì)形成細(xì)胞中Cx43 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低，提示Cx43的表達(dá)降低可能與細(xì)胞遷移能力提高有關(guān)。提示CAP可能通過降低角質(zhì)形成細(xì)胞表面的Cx43調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移能力，促進(jìn)難愈合傷口愈合。

鈣黏蛋白E是細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的主要連接蛋白，CAP處理細(xì)胞60 s后，細(xì)胞內(nèi)鈣黏蛋白E表達(dá)量顯著降低。表皮生長(zhǎng)因子樣蛋白3(CELR3)與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞黏附功能有關(guān)，并且在表皮細(xì)胞間、表皮與間葉組織之間起信息傳遞的作用，CELR3獨(dú)特的功能使其可能成為CAP作用的靶蛋白從而調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移及生長(zhǎng)修復(fù)[19]。

CAP還可通過臭氧和過氧化氫調(diào)節(jié)整合素表達(dá)。人角質(zhì)形成細(xì)胞膜主要表達(dá)整合素α2和整合素β1，研究發(fā)現(xiàn)CAP可以上調(diào)細(xì)胞膜表面整合素α2表達(dá)，當(dāng)CAP處理時(shí)間為5 min時(shí)整合素α2、整合素β1、整合素α5、整合素α6、整合素β3均表達(dá)增多。慢性難愈合傷口細(xì)胞中角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)整合素α5減少導(dǎo)致整合素α5β1受體表達(dá)下調(diào)，提示CAP可以通過增加傷口部位角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)整合素α5的表達(dá)促進(jìn)傷口愈合[20]。

3.4 CAP調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化相關(guān)酶及蛋白 核因子E2相關(guān)因子2(NRF2)控制著許多抗氧化通路，CAP處理后人角質(zhì)形成細(xì)胞中NRF2與還原性谷胱甘肽均表達(dá)下降。NRF2在編碼抗氧化蛋白、解毒酶的合成及調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境氧化還原水平中起到重要的調(diào)節(jié)作用，谷胱甘肽代謝是NRF2相關(guān)信號(hào)通路的標(biāo)志性事件。NRF2能夠感知氧化應(yīng)激反應(yīng)并啟動(dòng)抗氧化程序從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，KEAP1保護(hù)NRF2不被泛素降解。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸發(fā)生氧化反應(yīng)時(shí)，NRF2從KEAP1上解離，并與細(xì)胞核內(nèi)抗氧化反應(yīng)相關(guān)基因的啟動(dòng)子結(jié)合從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，該基因編碼ROS解毒酶、抗氧化物等蛋白質(zhì)如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞色素P450、NQO1酶(NADPH-quinone oxidoreductase 1)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCLC)、谷氨酰半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)物(GCLM)、超氧化物歧化酶1-3(SOD1-3)、硫氧還蛋白(TRX)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)及非酶類抗氧化物如谷胱甘肽等。BACH1通過其亮氨酸拉鏈與抗氧化相關(guān)基因結(jié)合從而抑制基因轉(zhuǎn)錄，雖然CAP對(duì)BACH1表達(dá)的影響機(jī)制并未明確，但是BACH1能夠抑制NRF2介導(dǎo)的血紅素加氧酶1的表達(dá)下調(diào)[21]?？傊?，CAP主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化作用，通過NRF2/KEAP1信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化反應(yīng)。

3.5 細(xì)胞凋亡相關(guān)分子 CAP對(duì)細(xì)胞的凋亡效應(yīng)主要通過RONS對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、能量代謝相關(guān)酶及凋亡相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。CAP處理后細(xì)胞內(nèi)RONS含量升高，許多分子量為42～45KDa的肌動(dòng)蛋白被氧化，研究表明肌動(dòng)蛋白的氧化修飾會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架改變并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的改變。CAP處理后，順烏頭酸酶和α-酮戊二酸脫氫酶(KGDH)均喪失活性，細(xì)胞能量供應(yīng)受到影響從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中起調(diào)節(jié)作用，CAP作用下多個(gè)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)導(dǎo)致線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激作用累積，使線粒體內(nèi)氧化物更易穿透線粒體膜進(jìn)入胞漿，并促進(jìn)促凋亡因子如細(xì)胞色素C釋放，該過程主要由Bcl-2蛋白家族調(diào)控并啟動(dòng)酶聯(lián)反應(yīng)[22]。CAP作用使細(xì)胞培養(yǎng)基和緩沖液中NO產(chǎn)物如亞硝酸鹽和亞硝基硫醇含量增加，由于亞硝酸鹽和亞硝基硫醇在UVA或藍(lán)光的作用下不依賴酶也可以生成NO，因此CAP作用下細(xì)胞內(nèi)NO濃度升高，而NO可通過升高cGMP的濃度調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.6 其他相關(guān)分子 CAP促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞β防御素表達(dá)[23]。防御素是一類富含半胱氨酸的陽離子蛋白，在皮膚炎癥狀態(tài)及皮膚損傷部位均能夠發(fā)現(xiàn)防御素的表達(dá)，其主要功能類似抗菌肽(AMPs)，通過結(jié)合在細(xì)菌細(xì)胞膜上造成膜穿孔，使細(xì)胞內(nèi)重要離子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外流，從而破壞細(xì)菌細(xì)胞完整性，起到抵抗細(xì)菌、病毒及真菌感染的作用。

4 CAP的安全性研究

有學(xué)者對(duì)CAP的致突變效應(yīng)進(jìn)行研究，CAP處理角質(zhì)形成細(xì)胞2 min后孵育觀察72 h，未見明顯毒性反應(yīng)發(fā)生。連續(xù)處理過程中，每24 h CAP處理1～2 min連續(xù)處理4次，仍未產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)。但處理5 min時(shí)細(xì)胞活力明顯下降，間隔24 h重復(fù)處理后并未發(fā)現(xiàn)損傷累積作用。與UVC對(duì)照組相比，CAP導(dǎo)致的基因突變并不顯著，接近于隨機(jī)突變水平[24]。Lademann等對(duì)CAP的溫度及其發(fā)射的紫外線進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CAP中紫外線劑量并不足以在人皮膚表面引起紅斑效應(yīng)，而且處理部位未發(fā)現(xiàn)CAP導(dǎo)致的熱損傷[25]。因此認(rèn)為CAP應(yīng)用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞尚無基因毒性作用，但CAP的體內(nèi)作用機(jī)制及其副作用仍需進(jìn)一步研究。

激發(fā)氣體種類不同CAP中RONS成分也不盡相同，目前認(rèn)為以氮?dú)鉃榧ぐl(fā)氣體產(chǎn)生的CAP較以空氣為激發(fā)氣體的CAP對(duì)細(xì)胞的損傷作用更小，安全性更好，添加氮?dú)夂驝AP中RNS的含量增多，而添加氧氣后ROS顯著增多。潮濕環(huán)境下等離子體中ROS更產(chǎn)生且高濃度的ROS如H2O2易造成組織損傷，75% O2與25% N2混合氣體作為激發(fā)氣體時(shí)ROS和RNS含量均達(dá)到最低且基因表達(dá)和蛋白質(zhì)水平最高。當(dāng)100% N2或75% N2和25% O2混合氣體作為激發(fā)氣體時(shí)，產(chǎn)生的ROS和RNS最多，對(duì)細(xì)胞及組織的損傷作用最強(qiáng)[26]。而目前氬氣作為最常用的激發(fā)氣體，其優(yōu)點(diǎn)如下: (1)在臨床可獲得;(2)化學(xué)反應(yīng)惰性，激發(fā)后產(chǎn)生有毒物質(zhì)少；(3)相較其他氣體如空氣更容易激發(fā)。因此相較于氮?dú)狻⒖諝饧捌渌旌蠚怏w成分而言，氬氣作為惰性氣體激發(fā)后產(chǎn)生的有毒物質(zhì)少，常溫常壓條件下更易被激發(fā)，產(chǎn)生的CAP溫度更低從而保證其對(duì)組織的熱損傷效應(yīng)亦最小，因此目前認(rèn)為最安全的CAP為氬氣來源。

5 結(jié)論

綜上所述，低溫等離子體以其獨(dú)特的生物學(xué)特性擁有廣泛的臨床應(yīng)用前景。目前盡管有學(xué)者提出了數(shù)條可能的信號(hào)通路，如GP-PKG信號(hào)通路、RhoA-ROCK、Nod2-NF-kB信號(hào)通路[22]及NRF2/KEAP1信號(hào)通路[20]，但確切的CAP蛋白質(zhì)靶點(diǎn)仍未明確，CAP的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。由于多種因素均能影響CAP的生物學(xué)效應(yīng)，如處理時(shí)間長(zhǎng)度、氣體來源、氣體流速和激發(fā)電壓及培養(yǎng)基的成分、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)差異等，使不同研究結(jié)果之間難以進(jìn)行比較。因此，隨著CAP生物學(xué)效應(yīng)研究的不斷深入，建立標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)體系亦系迫在眉睫。