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    結(jié)核菌素類產(chǎn)品的發(fā)展歷程概述

    2019-01-04 22:15:09都偉欣趙愛華王國治盧錦標
    中國防癆雜志 2019年10期
    關(guān)鍵詞:結(jié)核菌素卡介苗效價

    都偉欣 趙愛華 王國治 盧錦標

    舊結(jié)核菌素(old tuberculin,OT)是最早應用的結(jié)核病皮膚試驗的診斷試劑,問世至今已有120多年的歷史。該類產(chǎn)品經(jīng)歷了從濾液濃縮粗制發(fā)展為精制結(jié)核菌素純蛋白衍生物(tuberculin purified protein derivative,TB-PPD)階段,迄今仍然是結(jié)核病篩查最常用的診斷試劑。進入21世紀后,具有可鑒別卡介苗接種與結(jié)核分枝桿菌感染的新型皮膚試驗診斷試劑(重組結(jié)核分枝桿菌變態(tài)反應原)問世,為結(jié)核病輔助診斷揭開了新的篇章。筆者簡要概述舊結(jié)核菌素、TB-PPD、卡介菌純蛋白衍生物(BCG-PPD),以及新型皮膚試驗診斷試劑的發(fā)展歷史。

    一、舊結(jié)核菌素的發(fā)現(xiàn)和應用

    1882年,科赫證實結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病菌,雖然發(fā)現(xiàn)了致病原因,但如何治療肺結(jié)核又成為非常重要的研究內(nèi)容。1890年,科赫將結(jié)核分枝桿菌接種于含5%甘油的牛肉湯,在37 ℃條件下經(jīng)6~8周培養(yǎng)后,加溫100 ℃約1 h后過濾,再將濾液加熱80 ℃蒸發(fā),濃縮至原來體積的1/10制成舊結(jié)核菌素,希望借助結(jié)核菌素用于結(jié)核病的治療。但在初次試用舊結(jié)核菌素治療時,觀察到若干患者因此引起了嚴重的全身性或局部反應,包括發(fā)熱、肌肉酸痛、嘔吐等,而未接受結(jié)核菌素治療的患者無這些反應。因此,盡管臨床上的使用結(jié)果表明舊結(jié)核菌素對結(jié)核病無治療作用,但這種超敏反應卻可以作為結(jié)核病的診斷依據(jù),并最終發(fā)展成結(jié)核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test,TST)[1]。

    1907年奧地利醫(yī)生Von Pirquet采用結(jié)核菌素皮膚刮種法用于結(jié)核病診斷,其后關(guān)于舊結(jié)核菌素試驗的方法有了不少改進,如Moro透皮試驗、Trambusti試驗、Vollmer透皮試驗和Mantoux試驗等[2-3]。在這幾種方法中,Von Pirquet和Mantoux的檢測方法應用最為普遍。

    Von Pirquet[4]首創(chuàng)的皮膚試驗法是在前臂消毒過的皮膚上滴兩滴舊結(jié)核菌素(間隔約10 cm),用柳葉刀先在兩滴舊結(jié)核菌素中間的皮膚上做環(huán)狀劃痕為對照,再在兩滴舊結(jié)核菌素處的淺表皮膚上同樣操作制作劃痕。24 h和48 h后,如果舊結(jié)核菌素導致的紅色丘疹直徑大于5 mm,即為陽性。該法引入挪威后,通過在結(jié)核菌素中添加1%腎上腺素,提高了Pirquet法的敏感度[5]。Mantoux檢測法是至今使用最廣泛的皮內(nèi)注射法。將舊結(jié)核菌素用無菌生理鹽水稀釋10 000倍后,在前臂肘關(guān)節(jié)下2寸(約6.7 cm)處皮內(nèi)注射0.1 ml該溶液,必須使注射處產(chǎn)生5 mm的白色輪狀突起。48~72 h后觀察其反應強度,以皮膚上產(chǎn)生紅腫的平均直徑的大小來判定。

    舊結(jié)核菌素生產(chǎn)工藝較為粗糙,主要成分為結(jié)核分枝桿菌蛋白及其分解產(chǎn)物,同時還包括了一些與活性無關(guān)的多糖、核酸、脂類、結(jié)核分枝桿菌代謝產(chǎn)物及培養(yǎng)基中的各種成分。1952年,世界衛(wèi)生組織(WHO)將舊結(jié)核菌素標準化,規(guī)定1結(jié)核菌素單位 (tuberculin unit,TU)=1/100 mg的國際標準舊結(jié)核菌素,即1 mg舊結(jié)核菌素=100 TU,1 ml舊結(jié)核菌素=1000 mg,1 ml舊結(jié)核菌素=1000×100=100 000 TU。由于舊結(jié)核菌素皮膚試驗的特異性不足,早已被TB-PPD所替代而停止使用。

    二、國外TB-PPD的研制歷程

    舊結(jié)核菌素問世后,Long和Seibert[6]證明其有效成分為蛋白質(zhì)。1934年,Long等[7]采用Dorset培養(yǎng)基制備了舊結(jié)核菌素,經(jīng)超濾、過濾、三氯乙酸沉淀、離心、乙醚萃取三氯乙酸以及脫水等步驟,獲得了效價、均一性和穩(wěn)定性都優(yōu)于OT的結(jié)核蛋白,并命名為純蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)。

    之后,Seibert發(fā)現(xiàn)用硫酸銨作沉淀可得到純度更高的結(jié)核菌素,1939年生產(chǎn)了一大批PPD(批號49608)共107 g,其主要成分為約92.9%的蛋白質(zhì),5.9%的多糖和1.2%的核酸,當時作為美國結(jié)核菌素參考標準,借以鑒定各地生產(chǎn)的結(jié)核菌素效價。由于這批PPD純度較高,效價和特異度更強,1952年,WHO生物標準化專家委員會將其定為哺乳類結(jié)核菌素國際標準品,并正式命名為PPD-S[8]。PPD單位有2種,一種是“國際單位(IU)”,另一種是“TU”。其中1 IU相當于0.028 μg PPD-S(包含0.02 μg PPD和0.008 μg鹽)的生物活性。在美國和加拿大,PPD的效價單位表示為TU,1 TU相當于0.02 μg PPD-S的生物活性[9]。

    國際上臨床使用量最大的PPD制品是丹麥血清學研究所(SSI)制備的,該研究所于1941年相繼制成了PPD-RT19、PPD-RT20、PPD-RT21、PPD-RT22等幾批PPD制品。20世紀50年代,該研究所受WHO與聯(lián)合國國際兒童基金會的委托生產(chǎn)了一大批PPD,定名為PPD-RT23[10]。WHO推薦各國將PPD-RT23用于結(jié)核病流行病學調(diào)查。PPD-RT23是以7株人型結(jié)核分枝桿菌所制成,其中E5、E9656、E1580和U1921是制備RT19-22的原菌株,新增加的3株——T3419、T3480、T3487均為從結(jié)核病患者中分離出來的菌株。SSI共制備了95批濾液,其中18批發(fā)現(xiàn)有沉淀而廢棄,保留了77批,用乙醚制成混懸液,揮發(fā)干燥,保證了混合的均勻,提高了蛋白純度。在PPD-RT23的標化過程中,添加吐溫-80后可降低容器對PPD的吸附,從而提高其效價,最終標定1單位PPD-RT23為0.02 μg,其生物活性相當于0.06 μg(3單位)的PPD-S[11]。SSI共制備了670.5 g干重的PPD-RT23,復溶的原液用含0.01%羥基硫酸喹啉(防腐劑)和0.005%吐溫-80(穩(wěn)定劑)的磷酸緩沖液(pH 7.38)稀釋成成品,估計可滿足全球十年使用量[12]。

    三、國內(nèi)TB-PPD產(chǎn)品的研制歷程

    TB-PPD的國產(chǎn)化研究起始于20世紀70年代末,中國藥品生物制品檢定所的科學工作者在總結(jié)國外的酸變性沉淀法和鹽析法的優(yōu)點基礎(chǔ)上進行改進,建立了酸變性加鹽析的PPD綜合制備方法,以此方法研制出了TB-PPD和我國獨有的BCG-PPD[13-15]。并將1980年制備的批號為80-1的TB-PPD和BCG-PPD凍干制劑作為我國PPD參考品。我國PPD參考品的純度與活性各項指標均達到了WHO關(guān)于結(jié)核菌素制品相關(guān)規(guī)程的要求。

    我國建立的PPD生產(chǎn)工藝與國外生產(chǎn)工藝不盡相同,國外PPD-RT23和PPD-S的生產(chǎn)工藝均為單一沉淀法。PPD-RT23制品采用的是三氯醋酸沉淀法,PPD-S制品采用的是硫酸銨鹽析法。三氯醋酸沉淀法無法徹底去除多糖與核酸,導致PPD-RT23制品雜質(zhì)含量相對偏高。硫酸銨鹽析法的缺點是產(chǎn)量低。國產(chǎn)TB-PPD和BCG-PPD生產(chǎn)工藝均采用的是雙酸沉淀法和冷凍干燥技術(shù),即保證了產(chǎn)量,又能有效控制雜質(zhì)含量[15]。即首先應用終濃度2%三氯醋酸沉淀蛋白,加壓過濾后去除上清,蛋白沉淀以磷酸鹽緩沖液溶解后,以硫酸銨法再沉淀蛋白,并收集蛋白于3 μm孔徑濾膜上以10%氯化鈉脫鹽至中性,加入適量防腐劑,以磷酸鹽緩沖液溶解,除菌過濾后冷凍干燥制成。同時我國PPD產(chǎn)品中均加入吐溫-80表面活性劑,有效避免了蛋白吸附,極大提高了PPD產(chǎn)品的穩(wěn)定性,延長了有效期。

    目前,國內(nèi)TB-PPD制品有2個規(guī)格,分別為2 IU 和5 IU。BCG-PPD制品僅有1個規(guī)格,即5 IU。我國TB-PPD與BCG-PPD均采用國際TB-PPD 標準品PPD-S為標準基礎(chǔ)進行標化,5 IU BCG-PPD與相同劑量5 IU TB-PPD的效價與反應強度基本一致。如薛平等[14]在臨床上進行BCG-PPD和TB-PPD的同體雙臂皮膚試驗,結(jié)果顯示BCG-PPD與TB-PPD在5 IU相同劑量下,卡介苗接種后陽轉(zhuǎn)率與結(jié)核分枝桿菌感染者檢測結(jié)果陽性率基本一致,但反應強度略有差異。二者的使用說明書內(nèi)容也基本一致,主要用途為“供結(jié)核病的臨床診斷、卡介苗接種對象的選擇及卡介苗接種后的質(zhì)量監(jiān)測用”。

    國內(nèi)2 IU TB-PPD的用途為“專供結(jié)核病流行病學調(diào)查及臨床疑似結(jié)核病患者診斷用”。2 IU和5 IU TB-PPD來自生產(chǎn)工藝相同的相同原液,且分別采用與其劑量對等的國家參考品進行標化,因此,一般2 IU TB-PPD的皮膚試驗反應強度會低于5 IU 產(chǎn)品。如蘇城等[16]進行的動物試驗結(jié)果顯示:2 IU TB-PPD誘導的皮膚試驗反應強度小于5 IU。

    因國內(nèi)存在著不同類型和不同劑量PPD產(chǎn)品,有些研究會采用不同劑量PPD產(chǎn)品進行對比研究。但在采用不同劑量產(chǎn)品的研究中,劑量對皮膚試驗反應結(jié)果的影響會大于不同類型制品的影響。由于TB-PPD與BCG-PPD均采用國際標準品PPD-S為標準基礎(chǔ)進行標化,效價差異不大;因此,陽性率與皮膚試驗反應(硬結(jié)平均直徑的大小)的差異主要由劑量差異引起,不同類型差異造成的影響較低。目前,以2 IU TB-PPD和5 IU TB-PPD或BCG-PPD進行同體雙臂大樣本研究的極少,非同體雙臂而樣本量較大的有孟煒麗等[17]的研究,該研究回顧性分析了2012—2013年北京市西城區(qū)3所大學5 IU BCG-PPD與2 IU TB-PPD兩組學生皮試反應結(jié)果,其中5 IU BCG-PPD組的陽性率為54.8%(759/1386),明顯高于2 IU TB-PPD組的32.7%(469/1435)。該結(jié)果也證實了PPD制品的劑量越高則陽性率越高。

    四、新型皮膚試驗診斷試劑的研究

    雖然結(jié)核菌素試驗是世界各國篩選結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者的重要方法,但該試驗仍具有一定的缺陷性。由于結(jié)核菌素試驗所依賴的PPD制品含有200多種抗原,并且大多數(shù)抗原為分枝桿菌屬所共有,因此在鑒別結(jié)核分枝桿菌感染與非結(jié)核分枝桿菌感染的特異性較差,并無法區(qū)分卡介苗接種陽性者與結(jié)核分枝桿菌感染者。因此,新穎的和更有效的皮膚試驗診斷試劑是當前研究熱點,主要是尋找和制備特異性強的結(jié)核分枝桿菌抗原,以單一抗原或組合抗原來制備新的皮試試劑。目前,研究較多的為早期分泌抗原靶6(ESAT6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP10)、MPT64等卡介苗丟失而結(jié)核分枝桿菌依然保有的抗原,其中有些抗原已經(jīng)完成人體臨床試驗。比如國內(nèi)的重組結(jié)核分枝桿菌ESAT6-CFP10變態(tài)反應原(簡稱EC),是由ESAT6、CFP10蛋白融合表達,純化制備而成。EC作為新型皮膚試驗診斷試劑,較PPD制品的特異性強,可區(qū)分卡介苗接種和結(jié)核分枝桿菌感染[18]。目前,EC制品已完成Ⅲ期臨床研究。通過對EC用于結(jié)核病臨床輔助診斷、結(jié)核潛伏感染者篩查、結(jié)核感染與卡介苗接種者的鑒別等系統(tǒng)研究,證實該重組變態(tài)反應原安全、有效[19-20]。EC現(xiàn)已經(jīng)申報一類治療用新生物制品,生產(chǎn)注冊申請已被國家新藥審評中心正式受理(CXS1800022)。該制品將成為新一代極具潛力與市場前景的結(jié)核潛伏感染人群篩查和結(jié)核病輔助診斷的皮試試劑。

    五、小結(jié)

    結(jié)核菌素類產(chǎn)品歷史悠久,經(jīng)過百余年的發(fā)展,隨著新型皮膚試驗診斷試劑的問世,該類產(chǎn)品的應用將面臨新的變革。由于PPD與新型皮膚試驗診斷試劑特點各異,互相不能完全取代,在以后的實際使用中,應根據(jù)產(chǎn)品特點選擇更優(yōu)的使用方案。如在卡介苗接種者陽轉(zhuǎn)考察及成人接種或補種卡介苗前的篩查試驗中可單獨使用PPD產(chǎn)品。在結(jié)核病流行病學調(diào)查、結(jié)核病輔助診斷、結(jié)核潛伏感染人群篩查等方面可單獨使用EC產(chǎn)品。而PPD和EC聯(lián)用將主要用于結(jié)核感染與卡介苗接種者的鑒別診斷,以及結(jié)核病高風險人群全人群預防免疫接種前的篩查等方面。

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