患者來源腫瘤異種移植模型的建立與應(yīng)用

傅佳琦 滕理送 王浩浩

癌癥是一種高度異質(zhì)性的疾病，其特征是多種遺傳損傷和信號(hào)通路異常。盡管新型治療方法不斷發(fā)展，但對(duì)于腫瘤晚期患者來說，如何解決化療耐藥性和延長(zhǎng)總生存期仍然是重大挑戰(zhàn)，迫切需要更有效的治療方法。臨床前模型是從對(duì)疾病的生物學(xué)理解到開發(fā)新的治療方法過程中的重要組成部分。通過人類惡性腫瘤細(xì)胞系建立的異種移植模型是抗腫瘤藥物研發(fā)中常用的體外平臺(tái)[1]，這種臨床前模型方便易用，在研究導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的分子事件中具有重要價(jià)值，但在臨床前藥物的開發(fā)上有著明顯的局限性。例如在長(zhǎng)期離體培養(yǎng)過程中，細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列重大和不可逆的生物學(xué)特性改變[2]。為克服這些限制，一種更先進(jìn)的腫瘤模型即患者來源異種移植（PDX）模型應(yīng)運(yùn)而生：將患者的腫瘤組織標(biāo)本直接移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，在沒有離體培養(yǎng)的情況下進(jìn)行傳代。與離體培養(yǎng)細(xì)胞相比保留了更多的原發(fā)腫瘤特征，在篩選藥物、鑒定生物標(biāo)志物、個(gè)性化治療研究中有重要的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)綜述如下。

1 PDX模型的建立和驗(yàn)證

建立PDX模型需要將患者腫瘤組織或細(xì)胞直接植入于免疫缺陷小鼠體內(nèi)，免疫抑制更嚴(yán)重的小鼠如非肥胖糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）或NOD/SCID/IL-2λ受體缺失（NSG）小鼠植入率較高[3]，更適合生成PDX模型。PDX模型可分為異位植入和原位植入兩類。異位植入是指將腫瘤碎片或單細(xì)胞懸液植入與原始腫瘤部位無關(guān)的區(qū)域，通常是皮下或腎包膜下，該植入方法簡(jiǎn)單、監(jiān)測(cè)腫瘤大小更準(zhǔn)確，特別適用于需要在短時(shí)間內(nèi)大量移植的情況。此外，也可將患者腫瘤組織移植到與原始腫瘤相同的器官內(nèi)，即患者來源原位異種移植（PDOX）模型，其優(yōu)勢(shì)在于腫瘤可以在相同的解剖微環(huán)境中生長(zhǎng)，但操作過程復(fù)雜，費(fèi)用更高。建立模型通常需要2～4個(gè)月，若6個(gè)月仍未觀察到腫瘤生長(zhǎng)，則表示移植失敗[4]。將從患者體內(nèi)獲取的腫瘤組織切成1～2mm3大小的碎片，置于冷凍培養(yǎng)基中保存。接受腫瘤碎片的第一代小鼠通常表示為F0或G0，當(dāng)腫瘤達(dá)到足夠的大小時(shí)，將其解剖并重新植入其他小鼠體內(nèi)。此后的每一代被命名為 F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3…Fn 或 G1，G2，G3…Gn。為避免PDX模型在傳代過程中與原始腫瘤產(chǎn)生分化，通常第三代（即F3或G3）被用于藥物療效評(píng)估[5]。當(dāng)移植腫瘤達(dá)到一定大?。ㄖ睆?～2cm）時(shí)便可將周圍正常組織一并切除，經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片行HE或免疫組化染色，以便驗(yàn)證其組織學(xué)是否與原發(fā)腫瘤一致。從冷凍組織中提取腫瘤DNA、RNA、蛋白質(zhì)可用于全基因組測(cè)序、特定基因及蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)。

模型的移植成功率受到腫瘤的組織學(xué)亞型、侵襲性特征和植入部位等多種因素的影響。例如，在乳腺癌中，三陰性乳腺癌的移植成功率高于其他組織學(xué)類型[6]。此外，轉(zhuǎn)移性腫瘤比原發(fā)性腫瘤移植成功率更高[7]。由于腎包膜保留了原始腫瘤基質(zhì)和等效的宿主基質(zhì)，腎包膜內(nèi)植入的成功率要高于皮下植入[8]。值得注意的是，腫瘤標(biāo)本對(duì)宿主環(huán)境的適應(yīng)能力不同于原發(fā)腫瘤，若能適應(yīng)環(huán)境而不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，則更有可能成功。

2 PDX模型在腫瘤研究中的應(yīng)用

2.1 PDX模型的特征 目前已成功建立乳腺癌[9]、胃癌[10]、結(jié)直腸癌[11-12]、卵巢癌[13-14]、肺癌[15-16]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[17]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[18]、黑色素瘤[19]等多種惡性腫瘤的PDX模型，這些模型可在沒有離體培養(yǎng)的情況下進(jìn)行傳代，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)在類似于患者原發(fā)腫瘤部位的氧、營(yíng)養(yǎng)和激素水平的微環(huán)境中，因而可保留其供體腫瘤的大部分組織病理學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)特征和表觀遺傳異常等關(guān)鍵特征。例如，結(jié)直腸癌的PDX模型保存了原發(fā)腫瘤的組織病理學(xué)特征、基因拷貝數(shù)變異率，并檢測(cè)到與原發(fā)腫瘤相一致的KRAS、NRAS、BRAF和PI3K突變狀態(tài)，且在傳代后保持穩(wěn)定[11]。有研究比較不同傳代的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌PDX模型對(duì)西妥昔單抗治療的敏感性反應(yīng)，結(jié)果表明幾代間保持穩(wěn)定的應(yīng)答[17]。其次，PDX模型在藥物療效、生物標(biāo)志物分析的研究中表現(xiàn)出與原代腫瘤相似的結(jié)果，顯示出較高的預(yù)測(cè)能力，進(jìn)一步體現(xiàn)其在腫瘤研究中的價(jià)值。

2.2 藥物篩選和生物標(biāo)志物開發(fā) 抗癌藥物開發(fā)的主要問題之一是新藥成功率低，僅5%的臨床前抗癌藥物最終被批準(zhǔn)用于臨床治療[20]。這可能與篩選新藥物的傳統(tǒng)臨床前模型的預(yù)測(cè)價(jià)值低和缺乏合適的用于選擇患者和監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物有關(guān)。PDX模型的應(yīng)用可能改變這一現(xiàn)狀。

越來越多的證據(jù)表明，無論是靶向藥物還是經(jīng)典細(xì)胞毒藥物，PDX模型的藥物應(yīng)答率與臨床結(jié)果相近。例如，對(duì)BRAF V600E突變型結(jié)直腸癌PDX模型進(jìn)行分析，評(píng)估選擇性BRAF抑制劑達(dá)布拉非尼與選擇性MEK抑制劑曲美替尼聯(lián)合治療的療效，結(jié)果與提供腫瘤標(biāo)本的患者數(shù)據(jù)一致[12]。又如，化療相關(guān)研究中也顯示出PDX模型與臨床相一致的反應(yīng)率[21]。此外，PDX模型還可作為潛在的臨床藥物篩選平臺(tái)。在PDX模型中，二甲雙胍無法抑制胰腺癌生長(zhǎng)，同樣，臨床試驗(yàn)也表明在局部晚期和轉(zhuǎn)移性胰腺癌的聯(lián)合治療方案中加入二甲雙胍沒有任何益處[22]。提示腫瘤患者對(duì)藥物的陰性臨床結(jié)果也可通過PDX模型來預(yù)測(cè)，從而節(jié)省臨床試驗(yàn)所需的時(shí)間和資源。

除確定潛在的臨床適應(yīng)證外，PDX模型還有助于鑒定潛在的生物標(biāo)志物。在乳腺癌PDX模型中，黏附分子nectin-4可作為原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌的特異性有效治療靶點(diǎn)，同時(shí)也可作為新的乳腺癌預(yù)后不良標(biāo)志物[9]。藥物敏感性和耐藥性的生物標(biāo)志物可能有助于設(shè)計(jì)聯(lián)合臨床試驗(yàn)。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤PDX模型中，DNA修復(fù)基因甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）啟動(dòng)子超甲基化可顯著提高替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的療效，被用作評(píng)價(jià)替莫唑胺和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）抑制劑維利帕尼（veliparib）聯(lián)合治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生物標(biāo)志物[18]，已納入Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗(yàn)。在BRAF V600E突變型黑色素瘤PDX模型中，發(fā)現(xiàn)多種類似于應(yīng)用BRAF抑制劑治療過程中的臨床數(shù)據(jù)中所確定的耐藥途徑，而MEK抑制劑的加入可克服其對(duì)單藥BRAF抑制劑產(chǎn)生耐藥性[19]。基于這些數(shù)據(jù)，PDX模型可在藥物研究中發(fā)揮重要作用，以幫助選擇最可能對(duì)新藥物敏感的患者群體，確定合適的生物標(biāo)志物，以便納入臨床研究。

2.3 PDOX模型對(duì)于惡性腫瘤轉(zhuǎn)移研究的應(yīng)用價(jià)值 研究表明，大多數(shù)人實(shí)體瘤在裸鼠皮下植入后不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，而PDOX模型可以重現(xiàn)原發(fā)腫瘤的局部侵襲性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移行為，比PDX模型更好地再現(xiàn)人類腫瘤行為[23]，通常用于建立轉(zhuǎn)移性腫瘤模型，包括將原發(fā)腫瘤碎片原位移植等待移植瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生自發(fā)轉(zhuǎn)移[23]，或?qū)⑥D(zhuǎn)移灶直接作原位移植[24]。

PDOX模型中生長(zhǎng)的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤藥物敏感性可能不同，這在皮下移植腫瘤模型中是無法檢測(cè)到的。例如，HER-2陽(yáng)性宮頸癌的裸鼠皮下PDX模型和PDOX模型對(duì)苯甲酰胺組蛋白脫乳糖酶抑制劑eninostat均不敏感，但在PDOX模型中觀察到該藥與對(duì)照組相比明顯降低了轉(zhuǎn)移性腫瘤的負(fù)荷[25]。PDOX模型通過保留腫瘤的微環(huán)境，更好地反映腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過程，可用于基質(zhì)在腫瘤治療過程中的作用、腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制、轉(zhuǎn)移性腫瘤藥物反應(yīng)等相關(guān)臨床研究[26]，對(duì)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的精準(zhǔn)治療具有重要意義。盡管如此，PDOX模型仍然相對(duì)罕見，可能是因?yàn)槿狈ζ鞴偬禺愋砸浦菜璧木?xì)顯微外科手術(shù)以及合適的用于監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展的影像學(xué)技術(shù)，未來需要進(jìn)一步研究。

2.4 共臨床試驗(yàn) 為實(shí)時(shí)整合和分析小鼠模型與患者之間的信息，研究者提出“共臨床試驗(yàn)（co-clinical trial）”的概念[27]。該試驗(yàn)是指臨床前試驗(yàn)與臨床試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，對(duì)相關(guān)的臨床、生物學(xué)和藥理學(xué)信息進(jìn)行全面分析并進(jìn)行整合，以確定對(duì)特定治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。這些研究在最初是將基因工程小鼠模型對(duì)藥物的結(jié)果應(yīng)用到臨床試驗(yàn)，并在急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療中得到驗(yàn)證[27]。目前，PDX模型已經(jīng)被用于臨床試驗(yàn)的平行研究中，以研究藥物應(yīng)答與耐藥機(jī)制、研發(fā)提高藥物療效和抗耐藥的治療策略以及篩選預(yù)后生物標(biāo)志物。Kim等[15]的一項(xiàng)共同臨床試驗(yàn)中，PDX模型忠實(shí)復(fù)制了肺鱗狀細(xì)胞癌患者對(duì)多激酶抑制劑多維替尼(dovitinib)的臨床反應(yīng)，并確定FGFR基因的表達(dá)是預(yù)測(cè)肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)該藥療效的敏感性生物標(biāo)志物。共臨床試驗(yàn)不僅是為了預(yù)測(cè)正在進(jìn)行的人類臨床試驗(yàn)的結(jié)果，而且也是為了產(chǎn)生能夠?yàn)槿祟愌芯康姆治龊驮O(shè)計(jì)提供依據(jù)的臨床相關(guān)假設(shè)。例如，Owonikoko等[16]的一項(xiàng)研究三氧化二砷治療復(fù)發(fā)性小細(xì)胞肺癌的療效的試驗(yàn)中，PDX模型與Ⅱ期臨床試驗(yàn)中的結(jié)果相一致。這些研究支持在患者接受臨床試驗(yàn)前使用PDX模型預(yù)先篩選有前途的抗癌藥物，以節(jié)省藥物開發(fā)的時(shí)間，取得更有效的臨床成果。

2.5 個(gè)性化治療 腫瘤被認(rèn)為是一種由遺傳變異累積而引起和驅(qū)動(dòng)的疾病，幾乎每種腫瘤都有其獨(dú)特的分子變化。個(gè)性化PDX模型即Avatar小鼠模型已被用于個(gè)性化的癌癥治療[28]。其理論基礎(chǔ)來自于腫瘤患者對(duì)治療方案的不同敏感性以及上述PDX模型中藥物應(yīng)答與臨床反應(yīng)之間存在的顯著相關(guān)性[13-14]。研究人員對(duì)晚期實(shí)體腫瘤患者進(jìn)行外顯子測(cè)序，通過建立Avatar模型來鑒定腫瘤的藥物靶點(diǎn)并篩選藥物，并為每例患者確定最佳的治療方案[28]。當(dāng)基因組分析提供的信息較少或靶向途徑失敗時(shí)，Avatar模型有助于選擇更多的常規(guī)藥物及藥物組合。盡管在效率、速度和成本方面存在局限性，但目前的數(shù)據(jù)支持使用個(gè)性化腫瘤移植模型作為治療決策的研究平臺(tái)。

3 PDX模型的局限性

近年來，PDX模型因其獨(dú)特性在癌癥研究領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展，但仍存在一些局限性。第一，模型建立時(shí)間較長(zhǎng)，限制了在預(yù)計(jì)生存期較短的患者中的應(yīng)用。Mini-PDX模型提供了一種有效的替代方案，將原始腫瘤標(biāo)本以腫瘤細(xì)胞懸液的形式轉(zhuǎn)移到洗滌膠囊中并埋于裸鼠皮下組織內(nèi)，只需7d就可以完成藥物敏感性測(cè)試[29]。第二，小部分PDX模型與原代腫瘤組織存在分化差異[10]。此外，連續(xù)傳代過程中，小鼠基質(zhì)逐漸取代人類基質(zhì)，可能導(dǎo)致腫瘤旁分泌調(diào)節(jié)和間質(zhì)壓力等物理性質(zhì)的改變，繼而限制與腫瘤微環(huán)境相關(guān)藥物的研究[30]。第三，模型長(zhǎng)期保存比較困難，需要建立有效的長(zhǎng)期冷凍保存條件以及提高后續(xù)再移植效率。已有研究表明特殊冷凍保護(hù)劑顯示出較傳統(tǒng)介質(zhì)更優(yōu)越的性能，可縮短腫瘤形成時(shí)間和收獲時(shí)間，將再生移植率提高近3倍，即使是超過3年的長(zhǎng)期冷凍儲(chǔ)存也能成功地再移植，并可將模型因低溫保存而丟失的潛在風(fēng)險(xiǎn)減少4倍[31]。這一領(lǐng)域的未來研究應(yīng)該致力于確定安全可靠的冷凍保存時(shí)間的上限。第四，模型易受微生物感染。淋巴增生性病變的高發(fā)生率是由于動(dòng)物模型的免疫缺陷性質(zhì)引起的，多與EB病毒感染相關(guān)[7]。移植瘤被淋巴增生性病變?nèi)〈?，兩者大體外觀上很難區(qū)分，因此，在傳代之前檢查移植物的組織學(xué)非常重要。第五，由于小鼠的免疫缺陷性質(zhì)，傳統(tǒng)的PDX模型不適用于疫苗和檢查點(diǎn)阻斷抗體等免疫調(diào)節(jié)劑的篩選。人源化小鼠模型[26]或基因工程小鼠模型可以作為一種替代選擇。第六，PDX模型藥效評(píng)價(jià)系統(tǒng)有待完善。在治療過程中腫瘤生長(zhǎng)遲緩?fù)ǔ?huì)導(dǎo)致腫瘤體積在終點(diǎn)大于治療前而小于對(duì)照，雖然這很可能表明治療是具有生物活性的，但這并不意味著該療法在臨床上有效；事實(shí)上，這種反應(yīng)在臨床上被定義為“疾病進(jìn)展”，甚至是“疾病穩(wěn)定”[26]，需要使用定量指標(biāo)對(duì)反應(yīng)進(jìn)行分類以便更精確地評(píng)估試驗(yàn)中的治療效果。有研究者提出改良評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[32]，將反應(yīng)速度、強(qiáng)度和持久性相結(jié)合，進(jìn)一步統(tǒng)一解讀治療反應(yīng)。第七，雖然PDX模型具有上述多種優(yōu)點(diǎn)，但建立和維持該類模型為基礎(chǔ)的腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)需要高成本和大量人力資源，這就需要充足的后勤保障，目前已創(chuàng)建和實(shí)施共享包括歐洲EurOPDX資源、美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（NCI）的患者模型存儲(chǔ)庫(kù)、異種移植公共存儲(chǔ)庫(kù)（PRoXe）等大規(guī)模PDX模型平臺(tái)[26]，這些多機(jī)構(gòu)平臺(tái)依賴于共同的、經(jīng)過廣泛測(cè)試的操作程序，得到大量資金的支持，確保了可擴(kuò)展、同質(zhì)和可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)方案。

4 小結(jié)

總之，PDX模型保留了患者腫瘤的基本特征，在腫瘤研究領(lǐng)域中有重要用途。這一模型在藥物篩選、生物標(biāo)志物，共臨床試驗(yàn)中具有許多優(yōu)勢(shì)，可作為制定個(gè)性化醫(yī)療策略的臨床前研究工具。此外，PDOX模型對(duì)于惡性腫瘤轉(zhuǎn)移研究具有價(jià)值。然而，目前仍有一些關(guān)鍵問題需要解決，設(shè)法提高模型移植成功率、加快生成速度、完善長(zhǎng)期保存條件、減少微生物感染、完善藥效評(píng)價(jià)系統(tǒng)、提高在基質(zhì)及免疫系統(tǒng)相關(guān)研究方面的應(yīng)用等有助于發(fā)揮其巨大的發(fā)展?jié)摿?，成為臨床腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的主流模式。