皮質(zhì)脊髓投射決定觸覺和神經(jīng)病理性觸痛的敏感性

為了研究下行的皮質(zhì)脊髓投射是否調(diào)控脊髓水平的感覺信息處理過程，研究者把成年小鼠的雙側(cè)錐體束切斷，以損傷腦干中的CST來檢測(cè)他們對(duì)傷害性刺激和無害刺激的敏感程度，并通過組織學(xué)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。雙側(cè)CST損傷（手術(shù)切斷）造成了小鼠對(duì)動(dòng)態(tài)的和靜態(tài)的輕觸刺激的行為反應(yīng)顯著缺失，如對(duì)柔軟毛刷的輕觸刺激反射減少和后爪足底表面膠帶實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)潛伏期增加。在von Frey測(cè)試中，CST損傷小鼠表現(xiàn)為對(duì)非傷害性的點(diǎn)狀觸壓刺激(0.16 g)的反應(yīng)降低，但對(duì)能激活傷害感受器的較高機(jī)械力(0.6～2.0 g)刺激的敏感性表現(xiàn)為正常；對(duì)傷害性熱刺激和傷害性機(jī)械刺激的后爪縮足反射和一般運(yùn)動(dòng)功能也表現(xiàn)為正常。這種在輕觸觸覺水平的靈敏度選擇性缺失，也確證了這樣的發(fā)現(xiàn)，即CST軸突與外周低閾值敏感的機(jī)械感覺傳入神經(jīng)纖維共同終止于脊髓背角的III-V層。

為研究大腦皮層的哪些區(qū)域包含可能負(fù)責(zé)感覺信息調(diào)控的CSN，研究者使用了順行追蹤技術(shù)來識(shí)別脊髓背角的相關(guān)神經(jīng)支配區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)用來感知后肢初級(jí)感覺的大腦皮層(S1)的CST [也有一小部分來自次級(jí)感覺皮層(S2)的CST]，他們的神經(jīng)軸突終止于脊髓背角的III-V層，表明他們具有參與感覺調(diào)控功能；而支配后肢運(yùn)動(dòng)的皮層更多地向脊髓腹側(cè)投射到VI-VII層，與其已知的參與運(yùn)動(dòng)調(diào)控的功能一致。 因此，來自皮層S1和S2的CST軸突更可能執(zhí)行對(duì)脊髓水平的觸覺信息加工處理過程的控制功能。為了進(jìn)一步測(cè)試此功能，研究者們使用交叉靶標(biāo)技術(shù)在S1/S2的 CSN中表達(dá)人白喉毒素受體(DTR)，從而能夠選擇性殺死（消融）這些神經(jīng)元。

把表達(dá)Cre的高效逆行慢病毒載體(HiRet)在小鼠出生后P14天注射到其脊髓的腰部節(jié)段(T13-L6)。之所以選擇P14時(shí)間點(diǎn)，是因?yàn)檫@時(shí)皮質(zhì)發(fā)育的修剪已經(jīng)完成，接著將AAV-FLEX-DTR載體注射到S1/S2區(qū)域，再給予白喉毒素后可選擇性殺死約85%的S1/S2的CSN。行為學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)這些小鼠完全復(fù)制了錐體束切斷鼠的行為學(xué)表型，表明來自S1/S2皮層的CST軸突在觸覺敏感性中發(fā)揮一定的作用。

周圍神經(jīng)病理性疼痛的一個(gè)突出特征是機(jī)械刺激誘發(fā)的異常疼痛，表現(xiàn)為輕輕觸碰就可誘發(fā)疼痛。為了研究CST是否調(diào)控機(jī)械性異常疼痛，研究者們把給予白喉毒素殺死S1/S2的CSN的小鼠實(shí)施了保留性神經(jīng)損傷(SNI)手術(shù)，形成了神經(jīng)病理性疼痛模型。這些SNI鼠在術(shù)后所有的時(shí)間點(diǎn)（1～21天），都表現(xiàn)出了由低強(qiáng)度靜態(tài)von Frey的點(diǎn)刺激引起的異常疼痛和由毛刷刺激引起的動(dòng)態(tài)的異常疼痛的顯著減弱；而行錐體束切斷術(shù)的小鼠卻沒有形成由SNI或足底注射完全弗氏佐劑（CFA，外周炎性痛的模型）誘發(fā)的機(jī)械性異常疼痛。但 CST損傷（行錐體束切斷術(shù)）的SNI鼠仍表現(xiàn)出冷痛敏和對(duì)高強(qiáng)度機(jī)械刺激所誘發(fā)的痛敏。所以研究者們得出以下結(jié)論：S1/S2的CSN是誘導(dǎo)機(jī)械性異常疼痛所必需的，而不是其他痛敏表型所必需的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論，研究者們運(yùn)用了可誘導(dǎo)的化學(xué)遺傳方法瞬時(shí)沉默了調(diào)控后肢S1/S2中的CSN，發(fā)現(xiàn)SNI鼠的機(jī)械性異常疼痛顯著降低，支持這一結(jié)論。以上結(jié)果表明，投射到脊髓背角深層的軀體感覺CSN負(fù)責(zé)在正常條件下對(duì)非傷害性觸覺信息的加工處理，并參與病理?xiàng)l件下的機(jī)械性異常疼痛的形成，這一觀點(diǎn)以往也未遭質(zhì)疑。

為了研究S1中的CSN如何響應(yīng)外周觸覺刺激的，研究者們使用了在體微型顯微鏡技術(shù)來監(jiān)測(cè)表達(dá)GCaMP6（一種遺傳編碼的具有熒光的鈣離子指示劑）CSN中的鈣離子水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常自由活動(dòng)鼠S1 中的CSN表現(xiàn)出了稀少的和時(shí)間上散在的活性；與此相對(duì)應(yīng)的是，給予后爪毛刷或von Frey刺激而不是激光熱刺激，會(huì)誘發(fā)S1中部分 CSN的鈣活動(dòng)，并且同一小鼠在SNI術(shù)后這種鈣離子變化顯著增加；此外，在SNI鼠對(duì)毛刷和von Frey刺激均有反應(yīng)的神經(jīng)元比例有所增加。因此，正常鼠的軀體感覺皮層中的CSN可被非傷害性的觸覺刺激激活，并且在神經(jīng)病理性疼痛條件下被進(jìn)一步放大，表明存在脊髓-皮層-脊髓致敏環(huán)路。

那下行的CST軸突是否調(diào)控低強(qiáng)度的機(jī)械刺激誘發(fā)的脊髓神經(jīng)元的激活呢？研究者們用免疫組化方法在毛刷刺激后的正常鼠和在沒有毛刷刺激的SNI鼠的脊髓背角中檢測(cè)到少有c-Fos表達(dá)的神經(jīng)元；但是給與SNI鼠毛刷刺激可以使同側(cè)脊髓背角所有層面(I-V)中表達(dá)c-Fos神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，切斷CST可以反轉(zhuǎn)c-Fos+神經(jīng)元在深層(III-V)和淺層(I/II)的這種增高，而淺層通常被認(rèn)為僅處理來自傷害感受器的信息輸入并不直接與CST相接觸。以上研究表明，CST的信息輸入影響了脊髓背角所有層面中毛刷刺激所誘發(fā)的神經(jīng)元激活。位于淺層I中表達(dá)神經(jīng)肽1受體(NK1R)的投射神經(jīng)元是負(fù)責(zé)向大腦輸入傷害性信息的主要投射神經(jīng)元，為了研究CSN是否調(diào)控這些神經(jīng)元的激活，研究者們通過監(jiān)測(cè)ERK的磷酸化(pERK)激活作為神經(jīng)元活性的標(biāo)記物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予SNI鼠觸覺刺激能誘導(dǎo)I層中的pERK-NK1R+神經(jīng)元數(shù)量呈CST依賴性的顯著性增加，刺激正常鼠則不會(huì)發(fā)生類似現(xiàn)象。此結(jié)果表明在CST完整時(shí)，觸覺刺激SNI鼠直接激活脊髓背角III-V層中的神經(jīng)元并間接激活I(lǐng)層中的投射神經(jīng)元。后一種效應(yīng)很可能是由于III-V層與I層形成多突觸環(huán)路連接發(fā)生了去抑制作用所導(dǎo)致的。用DTR法消融CST后，通過抑制γ-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸神經(jīng)元功能進(jìn)而阻斷了脊髓背角的去抑制作用，能引發(fā)機(jī)械性異常疼痛。以上研究表明，SNI術(shù)后低閾值傷害性纖維的信息傳入進(jìn)而激活上行傷害性感覺通路是需要從CST直接投射到脊髓III-V層環(huán)路有信息輸入的。與之相一致的研究結(jié)果是，觸覺刺激SNI鼠后，多個(gè)腦區(qū)（包括S1/S2中的CSN）的激活可以被DTR法消融CST所阻斷。

接下來，研究者們研究了S1/S2 中CST所支配的靶點(diǎn)是脊髓背角中的哪類神經(jīng)元。興奮性膽囊收縮素(CCK)iresCre標(biāo)記的位于背角深層的神經(jīng)元是由CST和Aβ初級(jí)傳入神經(jīng)纖維共同支配的，而CCK+神經(jīng)元的選擇性沉默失活可以導(dǎo)致觸覺缺陷，表明CCK+神經(jīng)元可能是CST支配的靶點(diǎn)。本研究也事實(shí)上證明了，選擇性消融殺死脊髓腰段(T13-L6)中的CCK+中間神經(jīng)元后的行為學(xué)表型同CST切斷的行為學(xué)表型相一致：在正常鼠的觸覺敏感性中產(chǎn)生選擇性缺陷，并在SNI后減輕機(jī)械性異常疼痛。 此外，選擇性消融殺死CCK+中間神經(jīng)元，可以顯著減少毛刷刺激誘導(dǎo)的SNI鼠脊髓背角全層的c-Fos+神經(jīng)元數(shù)量，但減弱程度低于錐體束切斷術(shù)鼠，表明由CST和Aβ纖維共同支配的其他神經(jīng)元也可能參與這一信息的加工處理。這也表明了，脊髓背角深層中的CCK+中間神經(jīng)元對(duì)CST易化觸覺敏感性和機(jī)械性異常疼痛的貢獻(xiàn)更大。

為了測(cè)試CCK+中間神經(jīng)元是否被CST和Aβ纖維直接激活，研究者們用來自CCK-tdTomato轉(zhuǎn)基因鼠、并附著背根的離體脊髓切片進(jìn)行了全細(xì)胞膜片鉗記錄，CCK-tdTomato鼠S1/S2的CST軸突帶有光敏感通道蛋白2，并被黃色熒光蛋白(ChR2-YFP)所標(biāo)記而便于記錄。在被記錄的CCK-tdTomato細(xì)胞中，有50%表現(xiàn)為對(duì)Aβ和CST刺激的興奮性單突觸反應(yīng)，只有少數(shù)是任一輸入的單一刺激足以引起動(dòng)作電位；但在那些與Aβ纖維和CST直接連接的神經(jīng)元中，共同刺激傳入神經(jīng)纖維和CST下行通路，可以導(dǎo)致超加性突觸反應(yīng)，并帶有顯著增加的動(dòng)作電位輸出。在荷包牡丹堿（GABAA受體抑制劑）和士的寧（甘氨酸受體抑制劑）存在的情況下（模仿SNI條件下的脊髓去抑制作用），這種增加反應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)，表現(xiàn)為所有記錄到的CCK-tdTomato神經(jīng)元都產(chǎn)生一串連續(xù)動(dòng)作電位。在SNI鼠，重復(fù)觸摸刺激在脊髓背角誘發(fā)的c-Fos+神經(jīng)元中有一半表達(dá)CCK，但在錐體束切除鼠，這些神經(jīng)元不再表達(dá)c-Fos?？傊陨涎芯拷Y(jié)果表明，在正常鼠的CST-CCK+中間神經(jīng)元環(huán)路對(duì)觸覺輸入信息的加工處理過程中起著至關(guān)重要的敏化作用，這種作用在神經(jīng)損傷的條件下（神經(jīng)病理性疼痛時(shí)）是增強(qiáng)的。

最后，研究者們發(fā)現(xiàn)在表達(dá)ChR2小鼠的S1區(qū)的CSN給以光刺激，能顯著延長(zhǎng)了毛刷輕觸刺激誘發(fā)的縮足和舔足時(shí)間，并顯著增加了毛刷輕觸刺激誘導(dǎo)的脊髓I層 中NK1R+神經(jīng)元的pERK表達(dá)。由此得出結(jié)論，通過CST從軀體感覺皮層到脊髓背角的信息直接輸出，有力地強(qiáng)化了觸覺信息在脊髓水平的加工處理過程，進(jìn)而增強(qiáng)了觸覺相關(guān)信息向大腦的傳遞。這是一條脊髓-皮質(zhì)-脊髓前饋敏化環(huán)路，該環(huán)路在正常狀態(tài)下對(duì)于觸覺感覺的加工控制和在神經(jīng)病理性痛條件下的異常疼痛至關(guān)重要。因此，通過藥理學(xué)或電磁操控方法使已興奮的軀體感覺CSN回歸正常活性，可能是一種治療神經(jīng)病理性疼痛的潛在方法。此外，通過發(fā)現(xiàn)觸覺信息加工處理在脊髓環(huán)路水平的直接地被皮層控制的一系列研究結(jié)果，在不同的情景狀況或情緒狀態(tài)時(shí)，為心理狀態(tài)通過操控從脊髓到腦的信息傳遞過程，進(jìn)而如何直接增強(qiáng)或降低正常狀態(tài)下和病理?xiàng)l件下的觸覺信息加工處理過程，提供了貌似合理的解釋。