骨肉瘤不良預(yù)后相關(guān)基因研究進(jìn)展*

黃鎮(zhèn) 李曉東 黃慶山 林建華

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，福州350005）

骨肉瘤是一種常見于青少年的原發(fā)性惡性骨腫瘤[1]。70%～80%的骨肉瘤患者發(fā)病年齡為10～25歲每年發(fā)病率為（1～3）人/100萬人[2]。盡管骨肉瘤的發(fā)病率遠(yuǎn)低于常見惡性腫瘤，但是由于該病好發(fā)于青少年長骨時期，最常見的病變部位為生長活躍的股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端的干骺端[3]，起病時無典型的臨床癥狀極易與外傷混淆，且惡性度高，早期即可能發(fā)生肺轉(zhuǎn)移[4]，危害性大，死亡率高[5]。隨著治療方案的改進(jìn)，骨肉瘤患者的5年生存率在過去的十多年里仍維持在70%左右[6]，出現(xiàn)其他部位轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年生存率更低[7]。因此，近年來有許多學(xué)者著重研究骨肉瘤不良預(yù)后相關(guān)基因，這些基因的闡明將為尋找新的治療方法提供理論基礎(chǔ)，以改善骨肉瘤患者的不良預(yù)后。目前骨肉瘤不良預(yù)相關(guān)基因主要可分為ErbB基因家族、癌基因、miRNAs及其他四大類[8]，本文對以上四類具有代表性的骨肉瘤不良預(yù)后相關(guān)基因的研究進(jìn)展作一綜述。

1 ErbB基因家族

ErbB基因家族屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族，主要包括4種跨膜受體：ErbB1（EGFR）、ErbB2（HER-2）、ErbB3（HER-3）和ErbB4（HER-4）[9]，其在腫瘤發(fā)生過程中的作用已在多種惡性腫瘤中闡明，一般是通過形成同源或異源二聚體而被激活的。

1.1 EGFR基因

EGFR基因與多種惡性腫瘤的相關(guān)關(guān)系目前已經(jīng)明確，并且其主要為不良預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)，Kersting等[10]利用免疫組織化學(xué)技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)對所收集的骨肉瘤標(biāo)本進(jìn)行實驗研究，并且分析了EGFR的表達(dá)與完全事件生存率和無事件生存率的相關(guān)性，EGFR基因低表達(dá)患者的生存情況明顯較高表達(dá)患者差，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），證明了EGFR基因低表達(dá)是骨肉瘤患者不良預(yù)后的一個指標(biāo)。

1.2 HER-2基因

HER-2基因是目前研究最為廣泛且研究比較透徹的ErbB受體家族成員，其單克隆抗體藥物注射用曲妥珠單抗（商品名赫賽汀，Herceptin）已經(jīng)成功地應(yīng)用于HER2陽性的早期乳腺癌的輔助治療，與紫杉醇聯(lián)用一線治療HER2陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌，單藥治療已接受過一種或多種化療方案的患者以及與化療藥物聯(lián)用治療先前未經(jīng)治療的HER2陽性的轉(zhuǎn)移性胃癌或胃食管連接部癌癥。HER-2基因是最初于20世紀(jì)80年代在大鼠的神經(jīng)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的DNA中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)化基因[11]。該基因位于人類第17號染色體長臂（17q21-q22）[12]，該基因編碼相對分子質(zhì)量為185 000跨膜蛋白，與表皮生長因子受體有顯著同源性，是酪氨酸激酶受體家族成員[13]。該跨膜糖蛋白分主要為胞外段、跨膜區(qū)、胞內(nèi)段三部分，胞內(nèi)段為內(nèi)源性酪氨酸激酶活性的功能區(qū)[14]。HER-2單體本身不具有激活活性，需要形成同源二聚體或者異源二聚體后才具有活性[15]。HER-2基因與乳腺癌的關(guān)系已經(jīng)明確，在乳腺癌中HER-2基因的過表達(dá)與不良預(yù)后存在明顯相關(guān)性[16]。Geller與Gorlick[17]采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對收集的53例骨肉瘤標(biāo)本HER-2基因的表達(dá)進(jìn)行檢測，并且分析其表達(dá)量與治療反應(yīng)及預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)HER-2的過表達(dá)與術(shù)前化療后腫瘤細(xì)胞凋亡情況有顯著相關(guān)性，HER-2過表達(dá)患者的無事件生存率明顯較低。Zhou等[18]則對25例早期預(yù)處理的骨肉瘤標(biāo)本和12例肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤切除標(biāo)本進(jìn)行研究，采用了免疫組織化學(xué)和熒光原位雜交這2種技術(shù)檢測HER-2基因及其表達(dá)情況，認(rèn)為HER-2的高表達(dá)可能是與早期轉(zhuǎn)移相關(guān)的侵襲性腫瘤表型的特征。因此，骨肉瘤患者HER-2基因的過表達(dá)可以認(rèn)為是預(yù)后不良的一個信號，但是HER-2基因在骨肉瘤中的過表達(dá)又引發(fā)了人們對于使用其單克隆抗體進(jìn)行靶向治療的思考。

1.3 HER-4基因

對于HER-4基因在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用目前還不明確，但相關(guān)研究表明，在骨肉瘤細(xì)胞株HOS與MG63中，通過病毒轉(zhuǎn)染，使HOS與MG63細(xì)胞株過表達(dá)與敲減HER-4基因，過表達(dá)組HOS與MG63細(xì)胞株較敲減組均表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的遷徙、增殖能力。Hughes等[19]采用免疫組織化學(xué)技術(shù)、q-PCR、蛋白印跡、流式細(xì)胞術(shù)對所收集的骨肉瘤標(biāo)本進(jìn)行實驗分析，結(jié)果表明，HER-4的表達(dá)在大多數(shù)骨肉瘤中都是起激活和信號傳遞的作用，而且與骨肉瘤患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)。從而論證了HER-4基因是骨肉瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)基因。

目前對于HER-3基因與骨肉瘤預(yù)后的關(guān)系缺乏相關(guān)報道。

2 癌基因

癌基因是基因的一類，是人類及動物的固有基因，又稱為轉(zhuǎn)化基因，癌基因激活的結(jié)果是使細(xì)胞過度增殖及獲得其他惡性特征，從而形成惡性腫瘤。目前，與骨肉瘤預(yù)后相關(guān)的癌基因主要有p53基因、RB1基因及PTEN基因。

2.1 p53基因

P53基因是一種腫瘤抑制基因，在50%以上的惡性腫瘤中會出現(xiàn)這種基因的突變，由這種基因編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，其控制著細(xì)胞周期的啟動。p53基因在正常情況下對細(xì)胞分裂起著延緩或監(jiān)視的作用。細(xì)胞中抑制癌變的基因p53會判斷DNA變異的程度，如果DNA變異較小，p53基因就促使細(xì)胞自我修復(fù)；若DNA變異較大，p53基因就誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Yao等[20]對目前相關(guān)的p53基因與骨肉瘤的研究結(jié)果采用meta分析，認(rèn)為p53基因陽性表達(dá)者與2年生存率差和2年內(nèi)高死亡風(fēng)險密切相關(guān)，p53基因的過表達(dá)增加了早期腫瘤發(fā)生風(fēng)險[21]，相關(guān)研究通過對骨肉瘤標(biāo)本進(jìn)行二代測序分析得出RB1和（或）TP53基因突變占47%[22]。且Velletri等[23]通過基礎(chǔ)研究得出p53基因在保持小鼠骨組織的成骨與破骨的平衡中起著至關(guān)重要的作用。其研究結(jié)果將會增加人們對于p53基因在骨生物學(xué)中的作用的認(rèn)識，并為尋找新的治療策略和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供幫助。

2.2 RB1基因

RB基因也是一種腫瘤抑制基因，是最早發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[24]。RB1基因編碼的蛋白主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，是一類DNA結(jié)合蛋白，是可控制驅(qū)使細(xì)胞進(jìn)入分裂過程的重要基因。Xu等[25]采用全基因組測序、生存分析、蛋白印跡等技術(shù)對13例原發(fā)骨肉瘤標(biāo)本進(jìn)行檢測，得出結(jié)果認(rèn)為RB1基因缺失在骨肉瘤的早期發(fā)生發(fā)展過程中明顯存在，并與早期的肺轉(zhuǎn)移與不良預(yù)后有相關(guān)性。部分研究將RB1基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中，引發(fā)其高表達(dá)該基因，并且種植在裸鼠身上，結(jié)果顯示，高表達(dá)該基因的腫瘤細(xì)胞成瘤能力明顯弱于正常表達(dá)者及低表達(dá)者。因此，臨床醫(yī)師可以考慮是否能通過RB1基因表達(dá)的蛋白藥物來對骨肉瘤進(jìn)行治療。

2.3 PTEN基因

PTEN基因是于1997年發(fā)現(xiàn)的一種經(jīng)典的抑癌基因[26]。其編碼蛋白磷酸酯酶與張力蛋白是同源物，具有磷酸酶活性，可以調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的水平，從而抑制磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinases，PI3K）信號通路。PI3K信號通路在細(xì)胞新陳代謝、生存、增殖、細(xì)胞凋亡、生長和遷移中起著非常重要的作用，PTEN也因此可以發(fā)揮其腫瘤抑制的功能。PTEN基因的表達(dá)在多種人類惡性腫瘤中明顯降低，如乳腺癌、前列腺癌[27]。Hu等[28]利用野生型PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞，結(jié)果表明，PTEN轉(zhuǎn)染后，骨肉瘤細(xì)胞中PTEN轉(zhuǎn)錄和蛋白發(fā)生過表達(dá)。此外，PTEN轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲和黏附能力均明顯低于未轉(zhuǎn)染PTEN的細(xì)胞。Xi與Chen[29]研究了PTEN在骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PTEN在骨肉瘤中的表達(dá)較正常成骨細(xì)胞有所下降，PTEN的缺失表達(dá)刺激了骨肉瘤的生長與轉(zhuǎn)移，并且認(rèn)為利用基因治療恢復(fù)PTEN基因的功能是潛在的治療骨肉瘤的一個方向。

3 miRNAs

miRNA是一類長度為19～24 nt的非編碼單鏈RNA，通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因的3'-UTR區(qū)部分或完全互補(bǔ)，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的作用。越來越多的研究表明，miRNAs具有癌基因或抑癌基因的作用，它在細(xì)胞的生長、增殖和凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)水平的異常與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[30]。miRNA的異常狀態(tài)在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，并且一直都是研究的熱點。

3.1 miRNA-141

1993年，Lee等[31]在線蟲中發(fā)現(xiàn)首個miRNA-lin4。2000年，Reinhart等[32]在線蟲中發(fā)現(xiàn)第二個miRNAle7。隨后越來越多的小分子RNA被發(fā)現(xiàn)。miRNA-141屬于miRNA-200家族，miRNAs的基因家族可以調(diào)節(jié)細(xì)胞運動，控制“干細(xì)胞”和細(xì)胞凋亡[33]。Xu等[34]研究結(jié)果表明，miRNA-141在骨肉瘤表達(dá)水平降低，過量表達(dá)miRNA-141不僅可以抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miRNA-141是通過ZEB1或ZEB2抑制骨肉瘤的生長并誘導(dǎo)其凋亡。這一發(fā)現(xiàn)可以闡明miRNA-141在骨肉瘤中的作用機(jī)制，其表達(dá)量的高低與骨肉瘤患者的預(yù)后息息相關(guān)，引發(fā)研究者產(chǎn)生是否能針對該基因為骨肉瘤的治療提供新的分子靶點的思考。

3.2 miRNA-152

miRNA-152是miRNA-148/152家族成員，參與一系列的細(xì)胞活動，包括細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成[35]。miRNA-152的低表達(dá)與多種惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和生存時間相關(guān)[36]。Wang等[37]對80例骨肉瘤患者、20例骨膜炎患者和20例正常人的標(biāo)本進(jìn)行研究，探討miRNA-152表達(dá)情況與骨肉瘤的相關(guān)性。研究結(jié)果認(rèn)為，miRNA-152低表達(dá)組生存時間短于miRNA-152高表達(dá)組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。采用Cox回歸分析分析miRNA-152在骨肉瘤預(yù)后預(yù)測中的應(yīng)用價值，結(jié)果顯示，低表達(dá)miRNA-152是骨肉瘤患者的不良預(yù)后的一項指標(biāo)（P=0.004）?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，臨床醫(yī)師可早期對骨肉瘤患者檢測miRNA-152的表達(dá)量，從而對骨肉瘤患者的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測，并形成相應(yīng)的早期治療方案。

3.3 miRNA-221

miRNA-221在脊椎動物中是高度保守的，由人類的X染色體上編碼[38]。迄今為止，許多研究已經(jīng)探索了miRNA-221作為致癌miRNA或腫瘤抑制miRNA時在癌癥發(fā)生中的作用。Zhu等[39]采用q-PCR、蛋白印跡、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等技術(shù)研究miRNA-221基因與骨肉瘤的相關(guān)性，結(jié)果表明，miRNA-221的下調(diào)顯著增加了PTEN的表達(dá)，而上調(diào)的miRNA-221則顯著降低了PTEN的表達(dá)，miRNA-221通過抑制PTEN增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。是否可以通過相關(guān)藥物刺激miRNA-221表達(dá)量的增加來治療骨肉瘤患者，這是一個值得探究的問題。

3.4 miRNA-382

miRNA-382是長度為18～22個核苷酸的非編碼小RNA分子，通過與互補(bǔ)序列的相互作用，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[40]。Xu等[41]對所收集的骨肉瘤標(biāo)本采用實時定量PCR、蛋白印跡、流式細(xì)胞技術(shù)和生存分析進(jìn)行研究，論證了miRNA-382表達(dá)量在具有不良化療反應(yīng)的骨肉瘤患者標(biāo)本中明顯下降。此外，臨床數(shù)據(jù)表明，降低的miRNA-382表達(dá)量與骨肉瘤患者不良生存情況相關(guān)。miRNA-382的過表達(dá)分別通過靶向KLF12和HIPK3抑制細(xì)胞的生長和耐藥。相反，miRNA-382抑制表達(dá)或靶基因的過表達(dá)在體外和體內(nèi)刺激了骨肉瘤細(xì)胞的生長和化學(xué)抗性?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)提示miRNA-382是腫瘤抑制性miRNA的一種并且誘導(dǎo)miRNA-382的表達(dá)是一種潛在的抑制骨肉瘤進(jìn)展的策略。

3.5 miRNA-451

近年來，在膀胱癌[42]、胃癌[43]及膠質(zhì)瘤[44]中均有關(guān)于miRNA-451的報道研究，故相關(guān)學(xué)者就著手研究miRNA-451的表達(dá)量與骨肉瘤的相關(guān)性。Yuan等[45]通過q-PCR、流式細(xì)胞技術(shù)并建立動物模型研究miRNA-451對骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的影響，認(rèn)為骨肉瘤組織中miRNA-451的表達(dá)水平低于相應(yīng)的非癌骨組織，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。此外，miRNA-451表達(dá)水平在晚期骨肉瘤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性骨肉瘤、新輔助化療療效差的患者中明顯降低（P=0.001、0.015、0.001）。這些發(fā)現(xiàn)提示miRNA-451不僅可以作為一種新的診斷和預(yù)后指標(biāo)，而且可以作為骨肉瘤分子治療的潛在靶點。

4 其他

4.1 遷移誘導(dǎo)基因7（migration inducing gene-7，MIG-7）

血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是一種最近發(fā)現(xiàn)的不同于傳統(tǒng)的腫瘤血管生成的血液供應(yīng)系統(tǒng)。它的特點是其形成通過無內(nèi)皮細(xì)胞的高侵襲性腫瘤細(xì)胞導(dǎo)液通道參與[46]，促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，從而促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲與轉(zhuǎn)移。Ren等[46]通過實驗研究表明了，MIG-7的表達(dá)獨立顯示了完全和無轉(zhuǎn)移生存率的情況，MIG-7的體外敲低也大大減少骨肉瘤細(xì)胞中的遷移、侵襲和VM形成。MIG-7敲低也在原位小鼠中表現(xiàn)出有效的抗腫瘤、抗轉(zhuǎn)移和抗VM效應(yīng)。因此，可以認(rèn)為MIG-7是骨肉瘤患者一個獨立的不良預(yù)后指標(biāo)，通過檢測骨肉瘤患者M(jìn)IG-7基因的表達(dá)量，從而對骨肉瘤患者的預(yù)后起到一定的預(yù)測作用，并且針對性的進(jìn)行早期治療。

4.2 細(xì)胞色素P-450（cytochrome P450，CYP）基因

CYP基因產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞線粒體內(nèi)膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[47]，參與激素的合成與分解、膽固醇代謝、維生素D代謝，其基因的異常狀態(tài)在腫瘤發(fā)生和治療反應(yīng)中起著重要的作用[48]。Alini Trujillo-Paolillo等[49]通過qRT-PCR技術(shù)和預(yù)后隨訪對135例骨肉瘤患者進(jìn)行研究，結(jié)果表明，CYP基因的高表達(dá)在骨肉瘤的原發(fā)和轉(zhuǎn)移及治療反應(yīng)中起重要作用，促使人們對CYP基因在骨肉瘤早期診斷及治療中的作用的進(jìn)一步思考。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，目前與骨肉瘤不良預(yù)后相關(guān)的基因主要可以歸類為ErbB基因、癌基因、miRNA基因及其他四大類基因家族。這些基因的不良表達(dá)，不僅僅會引起腫瘤細(xì)胞侵襲性、轉(zhuǎn)移性的增強(qiáng)，也會增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對于傳統(tǒng)化療藥物的耐性。對于骨肉瘤患者治療的研究目前正處于瓶頸期，現(xiàn)階段對于骨肉瘤研究的主要目的在于探尋有價值的生物標(biāo)志物，促進(jìn)靶向藥物研發(fā)，最終改善其療效和預(yù)后。本文通過對目前與骨肉瘤不良預(yù)后相關(guān)的主要基因家族的系統(tǒng)闡述，激發(fā)學(xué)者對于骨肉瘤研究的進(jìn)一步思考，以期為骨肉瘤的早期診斷與治療提供新的方向，改善骨肉瘤患者的不良預(yù)后。