IVC籠盒原位實(shí)施小鼠二氧化碳安樂(lè)死方法的建立*

龐 帥 師曉萌 鹿雙雙 吳 健 史光華 劉曉宇 盧選成

(1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，北京 102206)(2. 中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可中心，北京 100062)

隨著社會(huì)發(fā)展和科技進(jìn)步，積極踐行“3Rs”原則、提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利已成為科研人員不可推卸的責(zé)任[1]。安死術(shù)是指以迅速造成動(dòng)物意識(shí)喪失而致身體、心理痛苦最小之處死動(dòng)物的方法，具體方法依據(jù)動(dòng)物品種和實(shí)驗(yàn)類型而確定[2]。安死術(shù)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的重要內(nèi)容之一。對(duì)于大鼠、小鼠、豚鼠及倉(cāng)鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，符合要求的CO2吸入法是一種可接受的安樂(lè)死方法[3-5]。

執(zhí)行CO2安樂(lè)死，需嚴(yán)格控制氣體置換率，美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)(American Veterinary Medical Association，AVMA)動(dòng)物安樂(lè)死指南要求CO2氣體置換率為10%～30%容器體積/min，英國(guó)動(dòng)物法案要求為20%容器體積/min[3,5]。目前國(guó)內(nèi)使用的CO2安樂(lè)死設(shè)備或自制儀器，往往無(wú)法按照國(guó)際要求精確控制進(jìn)氣量，且需將不同籠飼養(yǎng)的待處理動(dòng)物轉(zhuǎn)移到安樂(lè)死盒中。由此產(chǎn)生的問(wèn)題是：(1)如果無(wú)法控制置換率，會(huì)在動(dòng)物喪失意識(shí)前給動(dòng)物造成痛苦。(2)動(dòng)物在轉(zhuǎn)移過(guò)程中及轉(zhuǎn)移后處于陌生環(huán)境會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)；且實(shí)際工作中往往會(huì)轉(zhuǎn)移過(guò)多動(dòng)物到安樂(lè)死盒中，造成擁擠狀態(tài)，這些都會(huì)增加動(dòng)物痛苦。

市售二氧化碳安樂(lè)死設(shè)備一般可將CO2廢氣排到室外，而自制儀器往往將CO2直接排到室內(nèi)。盡管CO2無(wú)味、不易燃、不易爆，但封閉環(huán)境內(nèi)CO2相對(duì)濃度過(guò)高也會(huì)對(duì)操作人員健康造成危害。用于感染性實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物安樂(lè)死，其排出廢氣可能含有感染性物質(zhì)而不能直接排入環(huán)境，該問(wèn)題就更難以處理。作者就所在設(shè)施的軟硬件條件下，希望在生物安全柜內(nèi)，建立小鼠在原飼養(yǎng)獨(dú)立通氣籠(individually ventilated cage,IVC)盒中實(shí)施CO2安死術(shù)的方法，以解決上述問(wèn)題，為同行提供一種可借鑒的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1設(shè)備:Ⅱ級(jí)A2型生物安全柜(美國(guó)NUAIRE,NU-425-400E)，二氧化碳鋼瓶(北京天海,40 L)，氣體流量表(華清儀器儀表,25 L)，IVC籠盒(意大利泰尼百斯，1284 L)，膠管，進(jìn)接口，密封膠帶。使用手機(jī)(華為,P9)拍攝安樂(lè)死過(guò)程。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～5周齡BALB/c小鼠，4～5周齡C57BL/6小鼠，2周齡C57BL/6小鼠，各10只，雌、雄各5只，均購(gòu)自華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。

1.2 方法

1.2.1計(jì)算IVC體積: 泰尼百斯1 284 L籠盒近似梯形，按照以下公式計(jì)算泰尼百斯1 284 L小鼠籠盒體積。

S1為底面積，S2為頂面積，H為高度

1.2.2設(shè)備連接:將飼養(yǎng)有小鼠的IVC籠盒平穩(wěn)移至生物安全柜中，將二氧化碳鋼瓶出氣管連接在IVC籠盒的進(jìn)氣接口。設(shè)鎖扣保證接頭連接緊密無(wú)氣體泄漏，在輸氣膠管末端膠帶密封避免氣體泄漏，保證CO2以準(zhǔn)確的流速通入籠盒。飼養(yǎng)籠的生命窗作為氣體排出通道。(見圖1)

圖1 設(shè)備連接圖Fig.1 Connection of the devices

1.2.3實(shí)施二氧化碳吸入法安樂(lè)死，觀察動(dòng)物:將CO2流量表調(diào)至符合10%～30%容器體積/min的流量，通CO2氣體。通氣過(guò)程中觀察小鼠并錄像。有研究指出，在一定濃度的CO2中動(dòng)物可能因窒息而產(chǎn)生假死現(xiàn)象[6]，故待籠內(nèi)所有動(dòng)物均未觀察到呼吸后，再保持通氣1～2 min。取出小鼠,進(jìn)一步觀察呼吸、角膜反射、尸體僵硬以確認(rèn)動(dòng)物是否死亡。上述指標(biāo)除尸體僵硬外，不能基于某個(gè)單獨(dú)指標(biāo)確認(rèn)動(dòng)物的死亡[6]。如有未死亡動(dòng)物，在CO2麻醉狀態(tài)下采用頸椎脫臼方法安樂(lè)死。按相關(guān)規(guī)定處理動(dòng)物尸體。

通過(guò)錄像觀察小鼠，觀察指標(biāo)包括呼吸困難、躁動(dòng)、爬高、停止有意識(shí)運(yùn)動(dòng)和停止呼吸(見表1)，記錄每只小鼠停止有意識(shí)運(yùn)動(dòng)和呼吸的時(shí)間[7-9]。比較不同品系之間、不同周齡之間小鼠失去意識(shí)時(shí)間和死亡時(shí)間。

表1 CO2安死術(shù)觀察指標(biāo)Table 1 Observation index and standard of carbon dioxide euthanasia

1.2.4美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health,NIH)《成年嚙齒類動(dòng)物二氧化碳安樂(lè)死指南》(簡(jiǎn)稱《指南》)對(duì)成年嚙齒類動(dòng)物使用二氧化碳安樂(lè)死方法提出了具體要求，將本方法與該指南要求做一比對(duì)，了解本方法是否符合其要求。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用兩組間t檢驗(yàn)方法分析觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 按照公式計(jì)算，泰尼百斯1 284 L籠盒體積約為9升

依據(jù)AVMA動(dòng)物安樂(lè)死指南中的氣體置換率為10%～30%容器體積/min的要求，本方法采用的CO2流速在0.9 L/min至2.7 L/min之間均可。本次研究置換率采用2.5 L/min(置換率為28%容器體積/min)，即將流量計(jì)刻度調(diào)至“2.5”。

圖2 氣體流量表刻度Fig.2 The scale of flowmeter

2.2 不同品系和不同周齡小鼠之間比較

按照方法中提到的連接方式連接設(shè)備，氣體流速2.5 L/min，對(duì)4～5周齡Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠，2周齡C57BL/6小鼠進(jìn)行二氧化碳安樂(lè)死。安樂(lè)死過(guò)程中,觀察到小鼠躁動(dòng)、爬高、停止有意識(shí)運(yùn)動(dòng)和呼吸停止等一系列行為變化。結(jié)果見表2，4～5周Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠約在2～3 min之間失去意識(shí)，4～5分鐘之間停止呼吸。2周齡C57BL/6小鼠停止呼吸所需時(shí)間較長(zhǎng)，與4～5周齡C57BL/6小鼠相比停止呼吸的時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組小鼠喪失意識(shí)和停止呼吸時(shí)間的比較Table 2 Comparison the time of losing conscious and death between different groups

注：與4～5周齡C57BL/6組比較，*P<0.05

Note：*P<0.05,compared with 4～5 w C57BL/6 group

2.3 該方法與NIH的要求相比較結(jié)果

NIH《指南》對(duì)成年嚙齒類動(dòng)物使用二氧化碳安樂(lè)死方法提出以下要求[4]，本文建立的方法符合其要求(見表3)。

表3 本方法與NIH《指南》要求的比較Table 3 Comparison of this method with the requirement of NIH Guidelines

3 討論

通過(guò)與NIH《指南》要求相比，本研究成功建立了一種小鼠在原飼養(yǎng)IVC籠盒中實(shí)施二氧化碳安樂(lè)死的方法。Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠失去意識(shí)和死亡所需時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,均適用于該種方法；不同性別小鼠失去意識(shí)和死亡所需時(shí)間也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?！吨改稀吠扑]超過(guò)10日齡小鼠可使用二氧化碳安樂(lè)死，本研究將2周齡與4～5周齡C57BL/6小鼠相比較，失去意識(shí)的時(shí)間無(wú)顯著區(qū)別，但死亡時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？赡芘c周齡較小的鼠對(duì)氧氣量的需求相對(duì)較低，故所需時(shí)間更長(zhǎng)有關(guān)。

該方法優(yōu)點(diǎn)在于：首先，CO2氣體對(duì)操作人員身體健康危害較小，并且相對(duì)于頸椎脫臼、放血、斷頭等物理方法，該方法對(duì)操作人員的心理沖擊也較??；其次，在動(dòng)物原飼養(yǎng)籠具中實(shí)施二氧化碳安死術(shù)，能有效地避免待處理動(dòng)物在轉(zhuǎn)移到新環(huán)境后產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，降低動(dòng)物安樂(lè)死過(guò)程中的可能存在的疼痛和焦慮，提高了動(dòng)物的福利。IVC籠遮光性好但又不影響透過(guò)籠盒觀察動(dòng)物安樂(lè)死過(guò)程中的行為變化；最后，該方法操作簡(jiǎn)單，提高了工作效率。

從生物安全角度考慮，IVC籠具密封性好，充入CO2氣體不會(huì)外溢。CO2氣體密度大于空氣，位于空氣下部，而籠蓋頂部的生命窗可作為出氣通道使原有空氣排除。本研究中，安樂(lè)死操作在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。我們使用煙霧發(fā)生器檢測(cè)了通入CO2過(guò)程中籠盒生命窗處的氣體流向，氣體均通過(guò)位于工作臺(tái)面前面和后面的排風(fēng)格柵排出，符合Ⅱ級(jí)A2型生物安全柜要求。這有效解決了感染性動(dòng)物安樂(lè)死的生物風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題，保證病原微生物通過(guò)生物安全柜的高效過(guò)濾器排出而不會(huì)泄露到環(huán)境中。

然而隨著研究的深入開展，安樂(lè)死方法也將不斷改進(jìn)。CO2安樂(lè)死存在的不足之處是：一是動(dòng)物對(duì)CO2氣體有厭惡感；二是動(dòng)物吸入CO2氣體過(guò)程中，CO2會(huì)在呼吸系統(tǒng)和視覺系統(tǒng)的黏膜處形成碳酸而引發(fā)疼痛，也會(huì)因缺氧而造成呼吸困難[10]。疼痛感受器在CO2濃度達(dá)到40%時(shí)開始應(yīng)答，故為使動(dòng)物在感受到疼痛前失去意識(shí)，AVMA動(dòng)物安樂(lè)死指南要求置換率為10%～30%之間，英國(guó)動(dòng)物法案要求置換率為20%。但近期，有報(bào)道指出置換率為50%，才可減輕動(dòng)物安樂(lè)死過(guò)程的痛苦[7]。還有研究指出，為緩解動(dòng)物CO2濃度高卻未失去意識(shí)時(shí)可能存在的應(yīng)激和疼痛反應(yīng)，應(yīng)配合其他藥物先麻醉動(dòng)物，再使用CO2進(jìn)行安樂(lè)死[11]。加拿大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂(lè)死指南以及一些出席2006年和2013年英國(guó)紐卡斯?fàn)枙?huì)議的研究人員，也推薦CO2安樂(lè)死前使用其他麻醉劑，但未見有強(qiáng)制要求的報(bào)道[12-13]。

本文建立的方法符合目前國(guó)際公認(rèn)的要求，但尋找更人道的安樂(lè)死方法是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員共同的目標(biāo)，如有新的研究成果或做法被廣泛認(rèn)可，本方法也需隨之改進(jìn)和完善。