2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸酶法合成工藝優(yōu)化

黃立萍 郝建華 王 偉 孫晶晶 劉均忠

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3. 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005)

摘要：以L-抗壞血酸和β-環(huán)糊精為底物，利用海洋微生物Y112所產(chǎn)的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)催化合成2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-2G)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出3個(gè)對(duì)AA-2G產(chǎn)量有顯著影響的因素(pH、底物濃度、加酶量)，然后應(yīng)用Box-Behnken方法進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化AA-2G酶法合成工藝。結(jié)果表明，最佳工藝條件為：加酶量90.78 U/g·β-環(huán)糊精，pH 9.07，底物濃度56.81 g/L，底物配比1∶1(體積比)，轉(zhuǎn)化時(shí)間24 h，溫度45 ℃。該條件下，AA-2G的產(chǎn)量為10.62 g/L。

關(guān)鍵詞：L-抗壞血酸；2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸；環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；海洋微生物

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(編號(hào)：2018YFC0311106)；青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室-鰲山科技計(jì)劃(編號(hào)：2016ASKJ14)；青島市市南區(qū)科技發(fā)展計(jì)劃(編號(hào)：2018-4-002-ZH)

作者簡(jiǎn)介：黃立萍，女，上海海洋大學(xué)在讀碩士研究生。

通信作者：郝建華(1976—)，男，黃海水產(chǎn)研究所研究員，博士。

E-mail:haojh@ysfri.ac.cn

收稿日期：2018-02-09

DOI：10.13652/j.issn.1003-5788.2018.11.037

Abstract： 2-O-α-D-glucopyranosylL-ascorbic acid(AA-2G) was transformed by marine microorganism cyclodextrin glucanotrans-ferase (CGTase) usingL-ascorbic acid andβ-cyclodextrin(β-CD) as substrate. The qualitative and quantitative analyses of AA-2G were undertaken by LC-MS and HPLC. On the basis of single factor experiment Plackett-Burman design was carried out to determine three main effective factors (pH, substrate concentration, enzyme concentration). Then Box-Behnken design using three factors and three levels was applied to optimize synthesis conditions of AA-2G. The results indicated that the optimum conditions were pH 9.07, enzyme concentration 90.78 U/g·β-CD, substrate concentration 56.81 g/L, the ratio of substrate 1∶1(volume ratio), reacting for 24 h, at 45 ℃. Under this condition the yield of AA-2G was 10.62 g/L.

Keywords：L-ascorbic acid; 2-O-α-D-glucopyranosylL-ascorbic acid; cyclodextrin glucanotransferase; marine microorganism

L-抗壞血酸(L-ascorbic acid，L-AA)又名VC，是一種人體不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素，人體自身無(wú)法合成VC，必須從食物中獲得。VC在多種生理活動(dòng)中均起到重要作用，如膠原蛋白合成、改善脂肪代謝、提高免疫力等[1]。VC可廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)療等行業(yè)[2-4]，然而VC分子結(jié)構(gòu)中具有特殊的連烯二醇結(jié)構(gòu)，容易被氧化失去生理活性，限制了它在各領(lǐng)域中的應(yīng)用[5]。因此，人們一直致力于開(kāi)發(fā)穩(wěn)定性好的VC衍生物。

2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-2G)是一種VC糖苷類衍生物，被認(rèn)為是VC的最佳替代品，具有穩(wěn)定性好、安全性高、生理活性與VC最接近等優(yōu)勢(shì)。由于AA-2G進(jìn)入人體后可被緩慢分解成VC與D-葡萄糖，能持續(xù)提供VC[6]，因此可添加到食品中作為抗氧化劑、VC補(bǔ)充劑等。此外還可應(yīng)用于醫(yī)療保健、化妝品、畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域[7]。

AA-2G主要通過(guò)酶法合成，即利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)的轉(zhuǎn)糖基作用，將葡萄糖基以α-1,4糖苷鍵接于L-抗壞血酸的C2上，取代原有的羥基。近年來(lái)中國(guó)對(duì)AA-2G的合成已有很多研究報(bào)道，高愛(ài)偉等[8]利用CGTase、麥芽糊精和VC合成AA-2G，在最優(yōu)條件下產(chǎn)量為3.13 g/L；Eibaid等[9]利用CGTase轉(zhuǎn)化合成AA-2G，最高產(chǎn)量為7.05 g/L；單麗媛[10]用游離CGTase合成AA-2G，經(jīng)條件優(yōu)化后產(chǎn)量為6.02 g/L。但均未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平，一方面是由于底物的轉(zhuǎn)化率較低，另一方面是單位酶活低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高。

海洋中有著極為豐富的微生物資源，隨著海洋資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，與海洋微生物酶相關(guān)的研究逐漸增多，海洋微生物已成為開(kāi)發(fā)新型酶制劑的重要來(lái)源。目前來(lái)自深海和極地的極端微生物作為產(chǎn)酶資源也成為研究熱點(diǎn)，低溫酶、堿性酶和耐鹽酶等結(jié)構(gòu)和功能新穎的極端酶以其獨(dú)特的催化作用大大拓寬了微生物酶的應(yīng)用范圍。但是，目前報(bào)道的從海洋環(huán)境中分離的產(chǎn)CGTase的菌株只有本課題組所篩選到的Y112菌株[11]，該菌株所產(chǎn)的酶穩(wěn)定性好，單位酶活較高，在轉(zhuǎn)化淀粉制備α-環(huán)糊精方面有一定的優(yōu)勢(shì)[12]，未見(jiàn)其他海洋來(lái)源的產(chǎn)CGTase菌株。因此本研究繼續(xù)探討其在海洋生物酶法合成AA-2G方面的應(yīng)用潛力，以VC和β-環(huán)糊精(β-CD)為底物，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)合成條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高AA-2G的產(chǎn)量，為今后的合成工藝研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

AA-2G標(biāo)準(zhǔn)品：色譜純，美國(guó)Sigma公司；

VC標(biāo)準(zhǔn)品：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

海洋微生物環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶酶粉：電泳純，酶活力80 U/g，本研究室發(fā)酵制備；

β-環(huán)糊精、VC：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

磷酸；色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

甲醇：色譜純，德國(guó)默克醫(yī)藥生物科技公司；

甲酸：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

全溫?fù)u床：Modle 481型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；

臺(tái)式高速離心機(jī)：H1650-W型，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

電子天平：HANGPING FA1004型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，美國(guó)戴安公司；

高分辨質(zhì)譜儀：maXis Q-TOF型，美國(guó)布魯克·道爾頓公司；

色譜柱：Symmetry C18型，5 μm (2.1 mm×150 mm)，美國(guó)沃特世科技有限公司；

高效液相色譜儀：2695型，美國(guó)沃特世科技有限公司；

檢測(cè)器：2996型，美國(guó)沃特世科技有限公司；

色譜柱：SB-Aq型，5 μm(250 mm×4.6 mm)，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶活測(cè)定方法

(1) 試驗(yàn)組：用0.2 mol/L的NaOH-甘氨酸緩沖液(pH 8.5)配制4 g/100 mL可溶性淀粉液做為底物，取0.9 mL 底物于試管中，50 ℃水浴預(yù)熱5 min，然后加入適當(dāng)稀釋倍數(shù)的酶液0.1 mL混合均勻，50 ℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，再加入1 mL鹽酸溶液(1 mol/L)終止反應(yīng)，最后加入4 mL甲基橙溶液(8 mg/L)混勻，室溫靜置20 min。

(2) 對(duì)照組：取底物0.9 mL于試管中，50 ℃水浴預(yù)熱5 min。隨試驗(yàn)組一起50 ℃水浴反應(yīng)10 min，加入1 mL鹽酸溶液混合均勻后，再加入與試驗(yàn)組相同的酶液，其他處理與試驗(yàn)組相同。最后用紫外分光光度計(jì)在507 nm下測(cè)定試驗(yàn)組與對(duì)照組的吸光度。1個(gè)酶活力單位定義為上述條件下1 min 生成1 μmolα-環(huán)糊精所需要的酶量[13]。

1.2.2 AA-2G的鑒定 通過(guò)LC-MS 檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中是否含有AA-2G，檢測(cè)條件：柱溫45 ℃，流速0.3 mL/min，流動(dòng)相為95%的甲酸(濃度為2%)和5%的乙腈，離子方式ESI+，錐孔電壓4.5 kV，碰撞能量8 eV，質(zhì)量范圍50～1 500m/z。

1.2.3 AA-2G含量測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[14]，修改如下，HPLC條件為：檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流動(dòng)相20 mmol/L稀磷酸，流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。用超純水配制濃度為：250，500，1 000，1 500，2 000，3 000 mg/L的AA-2G標(biāo)準(zhǔn)液，通過(guò)HPLC分析，以AA-2G濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，利用軟件Empower pro制作AA-2G的標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)HPLC分析得出反應(yīng)液中AA-2G峰面積后，在軟件Empower pro中處理可直接得出AA-2G濃度。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 酶法轉(zhuǎn)化合成AA-2G條件中主要包括轉(zhuǎn)化時(shí)間、溫度、pH、底物濃度、底物配比、加酶量6個(gè)關(guān)鍵因素。設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)考察這6個(gè)因素對(duì)酶法合成AA-2G產(chǎn)量的影響，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。初始轉(zhuǎn)化條件：反應(yīng)總體系為2 mL，配制濃度均為100 g/L的β-環(huán)糊精溶液和VC溶液，各取1 mL加入反應(yīng)容器中作為底物(終濃度均為50 g/L)，以及0.2 g Na2SO3作為抗氧化劑，調(diào)節(jié)pH至9，按照100 U/g·β-環(huán)糊精的比例加入CGTase，在35 ℃，150 r/min反應(yīng)24 h。

(1) 轉(zhuǎn)化時(shí)間：按照初始轉(zhuǎn)化條件，其他條件不變，轉(zhuǎn)化時(shí)間分別設(shè)為6，12，18，24，36，42，48 h進(jìn)行反應(yīng)。

(2) 溫度：按照初始轉(zhuǎn)化條件，其他條件不變，反應(yīng)溫度分別設(shè)為15，25，30，35，40，45，50，55 ℃進(jìn)行反應(yīng)。

(3) pH值：按照初始轉(zhuǎn)化條件，其他條件不變，調(diào)節(jié)pH值分別至4，5，6，7，8，9，10，11進(jìn)行反應(yīng)。

(4) 底物濃度：按照初始轉(zhuǎn)化條件，其他條件不變，β-環(huán)糊精溶液和VC溶液的終濃度相同，均分別設(shè)置為10，20，30，40，50 g/L。

(5) 底物配比：按照初始轉(zhuǎn)化條件，其他條件不變，分別設(shè)置β-環(huán)糊精溶液與VC溶液的比例(體積比)為1∶4，2∶3，1∶1，3∶2，4∶1作為底物進(jìn)行反應(yīng)。

(6) 加酶量：按照初始轉(zhuǎn)化條件，分別按照0，50，100，150，200，250，300 U/g·β-環(huán)糊精的比例加入CGTase進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)化時(shí)間、溫度、pH、底物濃度、底物配比、加酶量6個(gè)因素進(jìn)行篩選，從中選出對(duì)酶法合成AA-2G具有顯著影響的因素，采Design-Expert.8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析，每組試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Plackett-Burman篩選出的3個(gè)顯著影響因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，以獲得酶法轉(zhuǎn)化合成AA-2G的最佳工藝條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS鑒定轉(zhuǎn)化液中AA-2G

為了確認(rèn)反應(yīng)液中是否有AA-2G生成，對(duì)AA-2G標(biāo)準(zhǔn)品和反應(yīng)液進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。AA-2G的分子量為338.27。AA-2G標(biāo)準(zhǔn)品[圖1(a)]m/z=339(M+H+)=m/z361(M+Na+)，反應(yīng)液[圖1(b)]m/z= 361.07 (M+Na+)，推斷其分子量為338.07，與標(biāo)準(zhǔn)樣品MS圖一致，由此可說(shuō)明反應(yīng)液中含有 AA-2G。

圖1 AA-2G標(biāo)準(zhǔn)品及反應(yīng)液MS圖

2.2 HPLC檢測(cè)反應(yīng)液中AA-2G含量

通過(guò)HPLC檢測(cè)分析AA-2G標(biāo)準(zhǔn)品、VC標(biāo)準(zhǔn)品和反應(yīng)液，結(jié)果表明，VC標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間是5.08 min[圖2(b)]，AA-2G標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間是5.6 min[圖2(a)]，與反應(yīng)液在5.6 min 處出現(xiàn)的峰保留時(shí)間[圖2(c)]一致。通過(guò)HPLC檢測(cè)梯度濃度AA-2G標(biāo)準(zhǔn)液，以AA-2G濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，利用軟件Empower pro制作AA-2G標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為Y=7.09E+003X+1.33E+006(R2=0.98)，經(jīng)HPLC分析得出反應(yīng)液樣品中AA-2G峰面積后，在軟件Empower pro中處理可直接得出其AA-2G濃度。

2.3 酶法轉(zhuǎn)化合成AA-2G的單因素試驗(yàn)

2.3.1 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)酶法合成AA-2G的影響 由圖3可知，隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長(zhǎng)，AA-2G的產(chǎn)量大幅度增加，當(dāng)時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量最高，超過(guò)24 h后，AA-2G產(chǎn)量開(kāi)始減少，可能是隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)有其他VC衍生物生成。所以選擇24 h進(jìn)行后續(xù)酶法轉(zhuǎn)化合成AA-2G條件優(yōu)化進(jìn)行研究。

圖2 AA-2G標(biāo)準(zhǔn)品、VC標(biāo)準(zhǔn)品及反應(yīng)液HPLC圖

Figure 2 HPLC analysis of AA-2G standard sample and VCstandard sample and biotransformation product

圖3 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)合成AA-2G的影響

2.3.2 溫度對(duì)酶法合成AA-2G的影響 由圖4可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，酶法轉(zhuǎn)化合成AA-2G的產(chǎn)量也在不斷增加，45 ℃時(shí)達(dá)到最大，隨著溫度的繼續(xù)升高，AA-2G的產(chǎn)量反而逐漸下降，可能是β-環(huán)糊精溶解度較小，溫度太低造成β-環(huán)糊精析出，而溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致部分酶活損失。所以選擇45 ℃進(jìn)行后續(xù)酶法轉(zhuǎn)化合成AA-2G條件優(yōu)化研究。

2.3.3 pH對(duì)酶法合成A A-2G的影響 由圖5可知，當(dāng)pH達(dá)到9時(shí)，酶法轉(zhuǎn)化合成AA-2G的產(chǎn)量最高，為8.03 g/L；

圖4 溫度對(duì)合成AA-2G的影響

圖5 pH對(duì)合成AA-2G的影響

當(dāng)pH再升高時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量反而下降，可能是本實(shí)驗(yàn)室制備的CGTase最適pH為堿性，pH太低造成酶失活，而pH過(guò)高使VC氧化速度加快，因此合成AA-2G的產(chǎn)量下降。所以選擇pH 9進(jìn)行后續(xù)酶法轉(zhuǎn)化合成AA-2G條件優(yōu)化研究。

2.3.4 底物濃度對(duì)酶法合成AA-2G的影響 由圖6可知，隨著底物濃度的不斷增加，AA-2G的產(chǎn)量也隨之增加。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到50 g/L時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量達(dá)到最高(6.6 g/L)。當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)50 g/L時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量反而略有下降，可能是高濃度底物降低了水的有效濃度，降低了分子擴(kuò)散性，從而降低了酶促反應(yīng)速度。所以選擇底物濃度為50 g/L進(jìn)行后續(xù)酶法轉(zhuǎn)化合成AA-2G條件優(yōu)化研究。

2.3.5 底物配比對(duì)酶法合成AA-2G的影響 由圖7可知，當(dāng)β-環(huán)糊精溶液的比例逐漸增大時(shí)，AA-2G產(chǎn)量緩慢增加，當(dāng)β-環(huán)糊精溶液與VC溶液體積比達(dá)到1∶1時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量最大，可能由于β-環(huán)糊精是糖基供體的提供者，其所占比例過(guò)大使得小分子糖類副產(chǎn)物生成量太多，與 VC競(jìng)爭(zhēng)CGTase的受體位點(diǎn)從而抑制了AA-2G生成[14]，所占比例過(guò)小則糖基供體不足，都不利于AA-2G的合成，所以選擇β-環(huán)糊精溶液與VC溶液的體積比為1∶1進(jìn)行后續(xù)酶法轉(zhuǎn)化合成AA-2G條件優(yōu)化研究。

圖6 底物濃度對(duì)合成AA-2G的影響

圖7 底物配比對(duì)合成AA-2G的影響

2.3.6 加酶量對(duì)酶法合成AA-2G的影響 由圖8可知，在一定范圍內(nèi)隨著酶濃度的增高，AA-2G的產(chǎn)量隨之增加。當(dāng)酶濃度達(dá)到100 U/g·β-環(huán)糊精時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量最高，達(dá)到7.6 g/L。酶濃度繼續(xù)升高，AA-2G的產(chǎn)量反而逐漸降低，可能是加酶量過(guò)大導(dǎo)致反應(yīng)過(guò)程中過(guò)多小分子糖類副產(chǎn)物產(chǎn)生，制約了AA-2G的產(chǎn)量。所以選擇酶濃度為100 U/g·β-環(huán)糊精進(jìn)行后續(xù)酶法轉(zhuǎn)化合成AA-2G條件優(yōu)化研究。

2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)6個(gè)因素進(jìn)行篩選，每個(gè)因素取2水平，PB試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，得到PB試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表3，pH、底物濃度、加酶量3個(gè)因素的P值<0.05，是顯著因素，因此確定這3個(gè)因素為AA-2G產(chǎn)量的主要影響因子。

2.5 Box-Behnken試驗(yàn)

Box-Behnken試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平

用Design-Expert V8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，分析結(jié)果見(jiàn)表6，P值<0.000 1，說(shuō)明該模型是顯著的，失擬項(xiàng)P=0.127 3>0.05，表明該模型的失擬項(xiàng)不顯著。方程的R2=0.976 9，說(shuō)明模型擬合度較好，能較好地預(yù)測(cè)AA-2G產(chǎn)量變化。二次多項(xiàng)式回歸方程：

Y=10.25-0.99A-0.41B+2.06C-0.90AB+0.74AC+1.60BC-2.18A2-2.02B2-3.01C2。

(1)

2.6 響應(yīng)面圖分析

用Design-Expert V8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，各因素的交互作用對(duì)酶法轉(zhuǎn)化AA-2G產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖9～11。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平

由圖9可知，響應(yīng)面變化明顯，隨著pH的升高，AA-2G產(chǎn)量先緩慢增加后減小，隨著加酶量的增大，AA-2G產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。等高線圖表明，等高線呈橢圓形，說(shuō)明交互作用較強(qiáng)。由表6可知，其交互作用對(duì)AA-2G產(chǎn)量影響極顯著。由圖10可知，響應(yīng)面變化明顯，隨著底物濃度和加酶量的增大，AA-2G產(chǎn)量先增加后減小。等高線圖表明，沿底物濃度軸向的等高線變化密集，加酶量的軸向等高線變化比較稀疏，說(shuō)明底物濃度對(duì)AA-2G產(chǎn)量的影響比加酶量大，等高線呈橢圓形，說(shuō)明交互作用強(qiáng)，由表6可知，其交互作用對(duì)AA-2G產(chǎn)量影響顯著。由圖11可知，響應(yīng)面變化明顯，隨著底物濃度和pH的增加AA-2G產(chǎn)量先升高再逐漸降低。等高線圖表明，沿底物濃度軸向的等高線變化密集，pH的軸向等高線變化相對(duì)稀疏，說(shuō)明底物濃度對(duì)AA-2G產(chǎn)量的影響比pH大，等高線呈橢圓形，說(shuō)明交互作用強(qiáng)，由表6可知，其交互作用對(duì)AA-2G產(chǎn)量影響極顯著。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 響應(yīng)面模型方差分析表?

? **表示極顯著(P<0.01)；*表示顯著(0.01

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，得到理論最優(yōu)條件組合：加酶量90.78 U/g·β-環(huán)糊精，pH 9.07，底物濃度為56.81 g/L，底物配比1∶1(體積比)，轉(zhuǎn)化時(shí)間24 h，溫度45 ℃，該條件下AA-2G達(dá)到最高產(chǎn)量為10.67 g/L。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次實(shí)驗(yàn)AA-2G平均產(chǎn)量為10.62 g/L，與模型預(yù)測(cè)值基本吻合，說(shuō)明該試驗(yàn)選用的模型是合理的。

圖9 加酶量與pH對(duì)AA-2G產(chǎn)量的交互作用

圖10 加酶量和底物濃度對(duì)AA-2G產(chǎn)量的交互作用

圖11 pH和底物濃度對(duì)AA-2G產(chǎn)量的交互作用

3 結(jié)論

本研究采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法對(duì)CGTase酶法合成AA-2G的條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了最優(yōu)工藝條件為加酶量90.78 U/g·β-環(huán)糊精，pH 9.07，底物濃度56.81 g/L，底物配比1∶1(體積比)，轉(zhuǎn)化時(shí)間24 h，溫度45 ℃，在此條件下AA-2G產(chǎn)量為10.62 g/L。相較于之前的研究[15]，AA-2G產(chǎn)量達(dá)到較高水平。CGTase酶被認(rèn)為是合成AA-2G的最佳酶源，但該酶價(jià)格昂貴，本實(shí)驗(yàn)室利用海洋微生物Y112發(fā)酵制備的CGTase酶粉單位酶活較高，有利于降低生產(chǎn)成本。然而游離酶存在難以回收利用的缺點(diǎn)，后續(xù)將對(duì)固定化CGTase合成AA-2G進(jìn)行研究，進(jìn)一步提高AA-2G產(chǎn)量及固定化CGTase的利用次數(shù)。