基于磁彈性傳感器的金黃色葡萄球菌檢測(cè)機(jī)理研究

王 華 陳德文 周德強(qiáng) 曹丕宇

(1. 江蘇省食品先進(jìn)制造裝備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3. 無(wú)損檢測(cè)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室﹝南昌航空大學(xué)﹞，江西 南昌 330063；4. 國(guó)家日用小商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，浙江 義烏 322000 )

食品在生產(chǎn)或食用時(shí)不會(huì)對(duì)廣大群眾造成損害是食品安全的含義[1]。食品安全問(wèn)題主要集中在化學(xué)性危害、生物毒素、微生物危害、食品攙假等多個(gè)方面。食品中存在金黃色葡萄球菌是世界性衛(wèi)生問(wèn)題，跟據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心報(bào)告[2]，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，居全美第2位。金黃色葡萄球菌是引起食源性疾病發(fā)生率較高的5種病原菌之一，每年由金黃色葡萄球菌引起的食源性疾病病例達(dá)24萬(wàn)例[3]。近年來(lái)，隨著抗生素的大量使用，金黃色葡萄球菌耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，甚至出現(xiàn)了多重耐藥菌株和超級(jí)耐藥菌株，致病能力也日趨增強(qiáng)[4]。因此，檢測(cè)金黃色葡萄球菌具有較大的實(shí)際意義。目前，檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌的方法有常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法[5-6]、免疫學(xué)方法[7]、分子生物學(xué)法[8-9]、質(zhì)譜分析[10]、生物傳感器檢測(cè)法[11]等。近幾年生物磁彈性傳感器的研究有較大的進(jìn)展，相較于傳統(tǒng)方法目前很多學(xué)者利用磁彈性傳感器自身質(zhì)量變化而產(chǎn)生的共振頻移的特性，在磁彈性傳感器表面進(jìn)行生物或者化學(xué)材料修飾，在其表面形成一層敏感薄膜，用以檢測(cè)各類細(xì)菌和各種有機(jī)物[12-14]。但現(xiàn)階段沒(méi)有學(xué)者利用質(zhì)量負(fù)載和傳感器所處溶液黏度的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)相同物質(zhì)的檢測(cè)。

本試驗(yàn)擬利用磁彈性無(wú)線傳感器對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)原理研究了黏度變化和質(zhì)量負(fù)載變化對(duì)傳感器的影響，并對(duì)比分析這2種方式的優(yōu)缺點(diǎn)，利用磁彈性傳感器的共振頻移檢測(cè)乳制品中是否含有金黃色葡萄球菌。

1 檢測(cè)原理

對(duì)于非晶合金帶材的磁彈性傳感器而言，其基頻共振頻率f0可由式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

L——非金合金帶材的長(zhǎng)度，mm；

E——非晶合金帶材的楊氏模量，GPa；

ρ——非晶合金帶材的密度，pg/mm3；

ν——非晶合金帶材的泊松比。

磁彈性傳感器在液體中的共振頻率受到多個(gè)因素的影響，其中主要受2個(gè)因素影響，一個(gè)是非晶合金帶材自身質(zhì)量；另一個(gè)是傳感器所處液體的黏度[15]。

當(dāng)傳感器自身質(zhì)量發(fā)生變化時(shí)，根據(jù)式(2)可求得其變化后的共振頻率。

(2)

式中：

A——傳感器的面積，mm2；

d——傳感器的厚度，mm；

m——傳感器的重量，pg。

由于傳感器厚度變化相較與質(zhì)量變化所引起的頻移較小，可以忽略不計(jì)，從而可得：

(3)

對(duì)上式采用二項(xiàng)式展開，并忽略高于二次以上的項(xiàng)，可以得到：

(4)

當(dāng)磁彈性傳感器被置入液體中時(shí)，由于液體黏度會(huì)產(chǎn)生一定的剪切力，會(huì)降低磁彈性傳感器的共振頻率。液體對(duì)磁彈性無(wú)線傳感器的共振頻率影響可以利用將磁彈性材料置入不可壓縮液體內(nèi)的振動(dòng)理論模型進(jìn)行分析計(jì)算。如圖1所示，當(dāng)磁彈性材料被置于液體中時(shí)，可以假定傳感器的位置在2塊面積很大且相等的平板之間，并且假設(shè)磁彈性材料位于YZ平面上，與上下固定平板之間的距離都為h。

磁彈性材料在黏性液體中的運(yùn)動(dòng)方程為：

(5)

圖1 在液體中磁彈性材料的理論模型

式中：

ρ——膜片的密度，pg/mm3；

d——磁彈性傳感器的厚度，mm；

η——液體黏度，mPa·s；

κ——與滲透深度相關(guān)的系數(shù)[κ=(1+j)/δ]，mm-1；

h——2個(gè)固定平板之間距離的1/2，mm。

通過(guò)求解式(5)可以得到：

(6)

式中：

式(6)左邊是磁彈性傳感器在液體中共振基頻的平方項(xiàng)，右邊第一項(xiàng)為式(1)的平方，即磁彈性傳感器在空氣中的共振頻率的平方，等式右邊的第二項(xiàng)則是液體中剪切力的消散作用對(duì)磁彈性傳感器的影響。

當(dāng)磁彈性傳感器處在高黏度溶液中時(shí)，即2h/δ<<1的液體而言，磁彈性傳感器的共振漂移可以表示為：

(7)

當(dāng)磁彈性傳感器處在低黏度溶液中時(shí)，即2h/δ>>1，磁彈性傳感器的共振漂移則是：

(8)

2 試驗(yàn)部分

2.1 試劑與設(shè)備

2.1.1 試劑

氨基化適配體：生工生物工程(上海)股份有限公司；

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：江南大學(xué)；

伊利鮮牛奶：市售；

丙烯酸：化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

二乙酸熒光素(FDA)：97%，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

胰蛋白胨、酵母粉：生物試劑，上海根生生物科技有限公司。

2.1.2 設(shè)備

數(shù)字顯示旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)：NDJ-8S型，山東肥城佳貝爾儀器有限公司；

磁彈性傳感器的基體是鐵基非晶帶材：尺寸為3 mm×8 mm×25 μm，上海黃浦區(qū)健磁電子；

信號(hào)發(fā)生器：ET3325型，杭州中創(chuàng)電子有限公司；

壓力蒸汽滅菌器：XFS-280MF型手提式，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2D型，蘇州蘇杰凈化設(shè)備；

數(shù)據(jù)采集卡：DAQ2010型，凌華科技(中國(guó))有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9015A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

熒光顯微鏡：Nikon 80i型正置，日本尼康株式會(huì)社；

自制TR型線圈：其中激勵(lì)線為400匝，檢測(cè)線圈為1 200匝，整個(gè)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)框圖如圖2所示。

圖2 TR型線圈示意圖

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 傳感器的制備 采用的磁致伸縮傳感器的材料為鐵基非晶材料，將材料利用微切割技術(shù)剪裁成3 mm×8 mm的矩形薄片。先用乙醇將膜片清洗消毒后放入丙烯酸溶液中，密封1 h左右，待磁致伸縮膜片表面生成一層保護(hù)膜，防止磁致伸縮膜片生銹，為細(xì)菌提供一個(gè)生長(zhǎng)場(chǎng)所，然后將膜片放置在超凈臺(tái)上通風(fēng)，并用紫外線照射殺菌30 min，取濃度為1 μL/mL適配體溶液30 μL滴在傳感器表面進(jìn)行修飾，放在超凈臺(tái)上2 h使適配體固定在傳感器表面。

2.2.2 測(cè)量 由于TR型線圈是基于離心管繞制而成的，先將牛奶加入離心管中，并將修飾好的磁彈性帶材放入，然后使用掃頻的方法，首先利用間隔為1 kHz的激勵(lì)信號(hào)來(lái)確定共振點(diǎn)的大致頻率范圍，再在初次測(cè)取頻率信號(hào)前后1 kHz的范圍，進(jìn)行間隔為100 Hz的小頻率掃描，從而確定最終共振點(diǎn)的頻率值。每隔1 h重復(fù)1次掃頻，但在進(jìn)行人工污染后的試驗(yàn)中，滴入金黃色葡萄球菌菌液30 min后增加了1組數(shù)據(jù)。由于數(shù)據(jù)采集可能存在誤差，因此在每個(gè)頻率點(diǎn)都采集5次數(shù)據(jù)，最終取5次的平均值作為每個(gè)頻率點(diǎn)的最終阻抗值。

2.2.3 熒光試驗(yàn) 在頻率檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)束之前，先將6孔板培養(yǎng)24 h。待測(cè)量試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，先將浸入牛奶中的磁彈性生物傳感器用0.9%的NaCl溶液沖洗，將磁彈性傳感器從染菌的牛奶中取出并置于1個(gè)6孔板中，加入3 mL液體培養(yǎng)基和20 μL的FDA進(jìn)行染色，37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)15 min，在取FDA試劑時(shí)，將酒精燈點(diǎn)燃置于試劑瓶口15 cm內(nèi)。之后采用熒光顯微鏡拍攝樣品表面細(xì)菌熒光圖。同時(shí)，準(zhǔn)備一個(gè)在未染菌牛奶中靜置的磁彈性傳感器做對(duì)比。整個(gè)試驗(yàn)都需在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。

2.2.4 黏度試驗(yàn) 利用黏度計(jì)自身的水平儀調(diào)節(jié)黏度計(jì)處于水平，估計(jì)牛奶的黏度范圍選用合適的轉(zhuǎn)子，在調(diào)節(jié)旋動(dòng)黏度計(jì)升降架時(shí)，緩慢調(diào)節(jié)黏度計(jì)，當(dāng)轉(zhuǎn)子逐漸浸入樣品中，直至轉(zhuǎn)子上的標(biāo)記與液面相平為止，使保護(hù)架、轉(zhuǎn)子處于容器中心。待轉(zhuǎn)子在樣品中浸泡3 min，使轉(zhuǎn)子溫度與樣品溫度一致。開始測(cè)量。當(dāng)轉(zhuǎn)子在液體中旋轉(zhuǎn)20圈以上再讀取示數(shù)，每個(gè)試樣至少測(cè)量2次。在第1次測(cè)量完畢后，按“復(fù)位”鍵，直至轉(zhuǎn)子停止轉(zhuǎn)動(dòng)后，再次啟動(dòng)黏度計(jì)，開始第2次測(cè)量。測(cè)試結(jié)果取這2次測(cè)量結(jié)果的算術(shù)平均值。2次測(cè)量結(jié)果之差小于或等于2次測(cè)量結(jié)果平均值的10%，以保證測(cè)量的準(zhǔn)確性，否則測(cè)量第3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 修飾后的膜片在無(wú)金黃色葡萄球菌的牛奶磁彈性傳感器檢測(cè)試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)25 h的測(cè)量，得到了如圖3所示的共振頻率關(guān)于時(shí)間的圖像。由圖3可知將傳感器放入牛奶中3 h內(nèi)膜片的共振頻率有很明顯的上升。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)都出現(xiàn)了這種現(xiàn)象，這與前文中理論分析并不相符，針對(duì)這個(gè)現(xiàn)象，推測(cè)該現(xiàn)象是磁彈性傳感器上的適配體沒(méi)能充分固定，在振動(dòng)過(guò)程中從磁彈性傳感器上剝落，導(dǎo)致傳感器的自身質(zhì)量降低，使磁彈性無(wú)線傳感器的共振頻率上升。由于在這段時(shí)間內(nèi)牛奶的黏度一直保持在1.60 mPa·s，沒(méi)有出現(xiàn)變化，故排除因黏度變化造成的頻移。從圖3中可知，在經(jīng)過(guò)12 h試驗(yàn)后，磁彈性傳感器的共振頻率發(fā)生了一些變化，由于此時(shí)試驗(yàn)過(guò)程中磁彈性傳感器的位置發(fā)生了的變化，導(dǎo)致了磁彈性傳感器的共振頻率產(chǎn)生了一定的變化，當(dāng)傳感器位置穩(wěn)定之后，頻率穩(wěn)定在76.9 kHz，在隨后的幾個(gè)小時(shí)并沒(méi)有再次測(cè)取，因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)3～11 h時(shí)在沒(méi)有外在影響因素的情況下，傳感器的共振頻率會(huì)在一個(gè)穩(wěn)定的頻率值，因此在隔了9 h后再次測(cè)取其共振頻率，測(cè)得仍為76.9 kHz。整個(gè)試驗(yàn)中，共振頻率由原來(lái)的77 kHz變?yōu)榱?6.9 kHz，是因?yàn)榇艔椥陨飩鞲衅髟陔x心管中的位置發(fā)生了變化。

圖3 磁彈性傳感器在未染菌的牛奶中的頻率響應(yīng)曲線

Figure 3 Frequency response curve of magnetoelastic sensor in milk withoutStaphylococcusaureus

為了進(jìn)一步證實(shí)該牛奶中是否含有金黃色葡萄球菌，利用熒光試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，圖4顯示傳感器上沒(méi)有任何異樣，證實(shí)了該牛奶是沒(méi)有金黃色葡萄球菌。

3.2 修飾后的膜片在含有金黃色葡萄球菌的牛奶中磁彈性傳感器檢測(cè)試驗(yàn)

圖5顯示，在菌液滴入后的0.5 h內(nèi)，傳感器的共振頻率有很明顯的增大，該階段主要是由于磁彈性傳感器在離心管中位置發(fā)生了變化，在隨后的3 h內(nèi)，傳感器的共振頻率一直維持在77.2 kHz，而經(jīng)過(guò)5 h后，傳感器的共振頻率再一次提高到了77.5 kHz，這是由牛奶黏度的變化所引起的，由于金黃色葡萄球菌的增殖分解了牛奶中的大分子物質(zhì)，導(dǎo)致牛奶黏度減小，因此牛奶對(duì)傳感器的消散作用減小，傳感器共振頻率增加，并在10 h時(shí)其共振頻率達(dá)到最大值后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，牛奶開始凝固，使得牛奶黏度上升，其對(duì)傳感器的消散作用增大，傳感器共振頻率減小。這一過(guò)程也與黏度試驗(yàn)中的結(jié)果相一致。牛奶的黏度由初始的1.60 mPa·s 減小到1.45 mPa·s，之后牛奶的黏度再次上升到1.59 mPa·s。對(duì)比圖3、5，發(fā)現(xiàn)傳感器對(duì)其自身質(zhì)量的變化具有較快的響應(yīng)。雖然圖5顯示傳感器也能較好地反映黏度變化，但是牛奶中的金黃色葡萄球菌繁殖引起牛奶黏度變化的過(guò)程比較緩慢。

由于染色試驗(yàn)使金黃色葡萄球菌在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色，圖6顯示傳感器上吸附了較少的細(xì)菌。假設(shè)傳感器上仍舊吸附適配體，那么適配體上定會(huì)吸附大量的金黃色葡萄球菌。顯然電鏡觀測(cè)結(jié)果與假設(shè)不相符，因此進(jìn)一步證實(shí)了適配體從膜片上剝落的推測(cè)，這也是在初始的階段牛奶黏度沒(méi)有很明顯的變化而共振頻率有明顯上升的原因。

圖4 未染菌的牛奶中磁彈性傳感器在染色試驗(yàn)后電鏡圖片

Figure 4 Electron microscopy image of magnetoelastic sensor in milk withoutStaphylococcusaureusafter dyeing test

圖5 磁彈性傳感器在含有金黃色葡萄球菌的牛奶中的頻率響應(yīng)曲線

Figure 5 Frequency response curve of magnetoelastic sensor in milk containingStaphylococcusaureus

圖6 染菌的牛奶中磁彈性傳感器在染色試驗(yàn)后電鏡圖片

Figure 6 Electromagnetic image of magnetic elastic sensor in milk withStaphylococcusaureusafter dyeing test

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了磁彈性傳感器共振頻率的測(cè)量原理，并制備了檢測(cè)金黃色葡萄球菌的磁致伸縮無(wú)線傳感器，研究了有菌和無(wú)菌情況下磁彈性傳感器共振頻移。驗(yàn)證了磁彈性傳感器共振頻率受到其自身質(zhì)量影響，同時(shí)也驗(yàn)證了，磁彈性傳感器置于黏性液體中受到液體黏度的影響，但由于牛奶中金黃色葡萄球菌引起牛奶的黏度變化較為緩慢，相較于自身質(zhì)量變化，黏度變化不是快速檢測(cè)的最優(yōu)方案。此外發(fā)現(xiàn)磁彈性傳感器相對(duì)于線圈的位置變化也會(huì)引起共振頻移。

本次試驗(yàn)驗(yàn)證了這種磁彈性傳感器對(duì)檢測(cè)牛奶是否含有金黃色葡萄球菌具有較高的可行性。但忽略了磁彈性尺寸的影響，同時(shí)，牛奶的溫度也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，這些將在接下來(lái)的研究中進(jìn)行探討。