茯苓多糖抑制甲醛誘導(dǎo)小鼠血清DNA加合物的實(shí)驗(yàn)研究①

張志軍 黃雪梅 胡昌軍

(湖南醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，懷化 418000)

茯苓又稱玉靈、茯靈、萬(wàn)靈桂、茯菟，為多孔菌科臥菌屬真菌的干燥菌核，形如甘薯，球狀，外皮淡棕色或黑褐色，內(nèi)部粉色或白色。茯苓味甘淡，性平，有健脾補(bǔ)中、養(yǎng)心安神、利水滲濕的功能。我國(guó)食用茯苓已有長(zhǎng)達(dá)千年的歷史，其功效廣泛，與多種藥材相配均能發(fā)揮其藥效，是一種重要的中藥藥材。茯苓多糖(Pachymaran)是從茯苓中提取的生物活性物質(zhì)，由葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖等成分組成，具有抗腫瘤、抗衰老、降血脂、抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[1,2]。有研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方茯苓多糖口服液有抑制小鼠 S180 和 H22 腫瘤生長(zhǎng)的作用，對(duì)實(shí)體瘤有顯著抑制作用，能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)荷瘤小鼠免疫功能[3]。有研究表明，羧甲基茯苓多糖能夠有效逆轉(zhuǎn) TNF-α調(diào)控的體外 Caco-2 細(xì)胞系生物學(xué)特性，有可能是治療炎癥性腸病的潛在有效藥物[4]。DNA加合物(DNA adducts)是親電性的化合物或其代謝產(chǎn)物與生物體內(nèi)DNA形成的共價(jià)結(jié)合產(chǎn)物，是DNA化學(xué)損傷最重要和最普遍的形式。目前認(rèn)為，外源化合物與DNA發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成的結(jié)合物一旦逃避自身的修復(fù)，就可能導(dǎo)致某些特異位點(diǎn)的基因突變，因此DNA加合物的形成被認(rèn)為是致腫瘤過(guò)程的一個(gè)重要階段。它既可以作為分子水平暴露生物標(biāo)志物來(lái)反映毒物到達(dá)靶部位的接觸劑量，又可以作為一種效應(yīng)標(biāo)志物，反映DNA受到有毒化學(xué)物質(zhì)損傷的效應(yīng)程度。因此，抑制DNA加合物形成，對(duì)預(yù)防腫瘤的發(fā)生、保護(hù)機(jī)體健康有積極的效應(yīng)。為進(jìn)一步挖掘茯苓的藥用價(jià)值，本研究用ELISA法分析茯苓多糖對(duì)甲醛誘導(dǎo)小鼠DNA加合物含量的影響，以探討茯苓多糖的抗遺傳損傷效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑及儀器 茯苓多糖提取物(西安開來(lái)生物工程有限公司，茯苓多糖含量63.5%，臨用前用生理鹽水溶解稀釋至所需濃度)；甲醛(分析純，臨用前用生理鹽水配制成所需濃度)；DNA加合物檢測(cè)ELISA試劑盒(上海易利生物科技有限公司)；RT-6000酶標(biāo)分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)；TD24-WS低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只成年健康昆明種雄性小鼠由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)為SCXK(湘)2009-0002，合格證號(hào)20-011]，體重20 g左右。用隨機(jī)方法將其分成陽(yáng)性對(duì)照組(甲醛染毒)、茯苓多糖低劑量組(甲醛+2 g/L茯苓多糖)、茯苓多糖中劑量組(甲醛+4 g/L茯苓多糖)和茯苓多糖高劑量組(甲醛+8 g/L茯苓多糖)共4組，每組10只。

1.2方法 小鼠先在通風(fēng)及光照良好的實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)，普通飼料，自由飲食及攝水，實(shí)驗(yàn)室溫度為18～24℃，濕度為30%～40%，每晚7點(diǎn)喂食一次，每?jī)扇崭鼡Q一次飲水與墊料，飼養(yǎng)4 d后用于實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照組小鼠灌胃0.4 ml濃度為0.5 g/L的甲醛溶液，各茯苓多糖組小鼠灌胃0.2 ml濃度為1.0 g/L的甲醛溶液和0.2 ml不同濃度的茯苓多糖溶液(低劑量組2.0 g/L，中劑量組4.0 g/L，高劑量組8.0 g/L)，各組小鼠每次灌胃量均為0.4 ml，持續(xù)灌胃7 d后(陽(yáng)性對(duì)照組死亡2只，茯苓多糖低劑量組死亡1只)摘眼球取血，1 500 r/min離心3 min分離血清，用ELISA法測(cè)定各組小鼠血清DNA加合物含量。

ELISA法(試劑盒)操作主要流程：①標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。②加樣：分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測(cè)樣品10 μl(樣品最終稀釋度為5倍)。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。③溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。④配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。⑤洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。⑥加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔除外。⑦溫育與洗滌：操作同前。⑧顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min。⑨終止：每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。⑩測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。 測(cè)定在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

茯苓多糖對(duì)小鼠血清DNA加合物濃度有影響，4組間DNA加合物濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Kruskal Wallis Test，H=28.354，P<0.01)。茯苓多糖可減少DNA加合物的形成，且有劑量-效應(yīng)關(guān)系，茯苓多糖劑量越高，DNA加合物濃度越低，小鼠血清DNA加合物濃度與茯苓多糖劑量呈負(fù)相關(guān)(Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)rs=-0.869，P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

DNA加合物是近年來(lái)備受關(guān)注的除DPC(DNA蛋白交聯(lián)物)之外的另一類生物大分子的重要遺傳損害標(biāo)記物，是環(huán)境理化因素對(duì)生物大分子物質(zhì)的一種重要遺傳損害，它的形成可影響基因的表達(dá)，破壞染色體的正常結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA復(fù)制過(guò)程中某些重要遺傳信息的改變和丟失，如果DNA加合物在細(xì)胞復(fù)制前沒(méi)有被修復(fù)或被錯(cuò)誤地修復(fù)，則可導(dǎo)致基因突變，引起不可逆的基因損傷，進(jìn)而誘發(fā)突變及腫瘤?？梢?jiàn)，DNA加合物的形成與致癌作用之間存在著一定的因果關(guān)系，是反映化學(xué)致癌進(jìn)程中一個(gè)早期的可探測(cè)的生物標(biāo)志物。

GroupsnDNA adductPositive control group8155.26±33.98Low dose of pachymaran9134.93±21.77Middle dose of pachymaran1079.53±11.051)High dose of pachymaran1063.75±14.671)

Note：Compared with positive control group，1)P<0.01.

甲醛是確定的人類致癌物，廣泛存在于環(huán)境污染物中，如住宅裝修所用人造板材(大芯板、復(fù)合地板)、油漆及卷煙煙氣會(huì)導(dǎo)致室內(nèi)空氣甲醛污染[5]。活潑的醛基不需要經(jīng)過(guò)機(jī)體代謝就能夠直接攻擊生物體內(nèi)的親核基團(tuán)，如核酸中的鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶，可與DNA分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合形成醛類DNA加合物，屬堿基修飾類DNA損傷[6]。本研究中用甲醛染毒，確保實(shí)驗(yàn)小鼠血清中有可供檢測(cè)的DNA加合物。

研究結(jié)果表明，當(dāng)劑量高于2.0 g/L時(shí)，茯苓多糖具有較好的抑制DNA加合物形成作用，且存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，劑量越大，抑制效應(yīng)越明顯，說(shuō)明茯苓多糖具有較好的抗遺傳損傷作用。

可見(jiàn)，茯苓多糖作為天然免疫多糖，不僅能促進(jìn)細(xì)胞免疫功能，還有明顯的抗遺傳損傷效應(yīng)，值得開發(fā)應(yīng)用。