3D打印多孔材料應(yīng)用于骨缺損修復(fù)的研究進(jìn)展*

王進(jìn) 葛建飛** 郭開(kāi)今 鄭欣

（1.蘇州大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院骨科，江蘇蘇州 215600；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，江蘇徐州 221002）

3D 打印技術(shù)是一項(xiàng)新型數(shù)字化快速成型技術(shù)，也稱為增材制造技術(shù)，它是在計(jì)算機(jī)輔助下，以物體的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)（computer aided design,CAD）模型或CT掃描等數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用金屬粉末、陶瓷等原材料，通過(guò)“分層制造、逐層疊加”的方式快速構(gòu)造任意復(fù)雜結(jié)構(gòu)的物理模型[1,2]。骨科較常用的3D打印技術(shù)主要包括光固化立體打印、選擇性激光燒結(jié)、熔融沉積成型、金屬直接熔融、噴墨打印等[3]。

由高能量創(chuàng)傷、骨腫瘤切除、骨髓炎清創(chuàng)等原因造成的大段骨缺損，如何修復(fù)一直是臨床醫(yī)師面臨的巨大難題。傳統(tǒng)治療技術(shù)存在諸多弊端：自體骨移植被視為修復(fù)骨缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其取材有限，需進(jìn)行額外手術(shù)取骨而造成取骨區(qū)出血、疼痛、感染等并發(fā)癥；同種異體骨移植存在傳播疾病、誘發(fā)免疫反應(yīng)、骨愈合不良等缺陷[4,5]。近年來(lái)，隨著材料學(xué)、工程學(xué)、生命科學(xué)的快速發(fā)展，骨組織工程支架材料用于骨缺損修復(fù)的研究受到廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)制備工藝加工的多孔支架材料內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)不可控、外形與宿主骨缺損不完全匹配，很難滿足實(shí)際需求[6]。利用3D打印技術(shù)制備的多孔支架材料不僅可以構(gòu)建與缺損骨組織相匹配的復(fù)雜外形，還可以精確調(diào)控內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)，同時(shí)可攜帶生物活性因子及細(xì)胞進(jìn)行骨缺損部位的原位打印，從而獲得理想的骨修復(fù)效果[3,7,8]。本文就3D 打印技術(shù)制備的不同骨缺損修復(fù)多孔支架材料的研究進(jìn)展作一綜述。

1 常見(jiàn)的3D打印多孔材料

1.1 金屬材料

金屬因其良好的生物相容性、較強(qiáng)的耐疲勞性及優(yōu)異的力學(xué)性能而被廣泛應(yīng)用于骨組織工程，目前常見(jiàn)的金屬支架材料包括鈦及其合金、鈷、鎳合金、不銹鋼等。金屬熔融溫度較高，支架材料3D打印需要特定的高溫條件，無(wú)法同步涂層生物活性因子或細(xì)胞混合打印[9]。鈦及其合金是目前應(yīng)用最廣泛的金屬支架材料，Nune等[10]采用3D打印技術(shù)制備3種不同孔徑及孔隙率的多孔鈦（porous titanium,pTi）支架，平均孔徑分別為700、1000、1500 μm，孔隙率分別為76.1%、85.6%、90.3%，通過(guò)與前成骨細(xì)胞共培養(yǎng)檢測(cè)其生物學(xué)功能，結(jié)果顯示pTi支架均有利于前成骨細(xì)胞黏附、增殖、礦化及分化，不同孔徑鈦支架之間細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鄧威等[11]將3D 打印pTi 材料植入兔股骨髁缺損，術(shù)后第12周Micro-CT掃描及硬組織切片染色結(jié)果均顯示材料周?chē)翱紫秲?nèi)長(zhǎng)入大量新生骨組織，表明3D打印pTi材料具有優(yōu)異的骨修復(fù)性能。鉭、鈮金屬因其高容積孔隙率、低彈性模量及高表面摩擦性能，成為金屬材料研究的熱點(diǎn)。但是鉭、鈮材料價(jià)格昂貴，且具有強(qiáng)氧化性和高熔融溫度，使得3D打印純鉭、鈮多孔支架的研究受到極大限制，目前多將鉭、鈮金屬制作成涂層用于傳統(tǒng)金屬材料（如鈦合金、不銹鋼等）表面改性處理，以節(jié)約成本，并增強(qiáng)支架骨修復(fù)性能[12,13]。鈦、鉭、鈮等金屬因不具有生物可降解性，致使其研究受限，而鎂金屬作為一種新型可降解金屬材料，是今后的研究熱點(diǎn)，其植入體內(nèi)后可降解成無(wú)毒物質(zhì)排出體外，且降解過(guò)程中釋放鎂離子，可促進(jìn)成骨反應(yīng)。然而純鎂生理環(huán)境中降解太快，骨組織愈合之前就失去力學(xué)性能，且降解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生過(guò)多氫氣，超過(guò)宿主組織的處理能力，所以當(dāng)前鎂金屬的研究側(cè)重于制備鎂合金材料或構(gòu)建其他保護(hù)涂層以增強(qiáng)鎂金屬的抗腐蝕性能[14,15]。Yu等[16]采用激光打孔法制備多孔鎂合金支架，并構(gòu)建氟化鎂涂層以提高支架的抗腐蝕性能，通過(guò)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）共培養(yǎng)以探討支架的細(xì)胞相容性，結(jié)果表明氟化鎂涂層多孔鎂合金支架具有良好的生物相容性，并能促進(jìn)BMSCs的增殖活性。

1.2 生物陶瓷材料

生物陶瓷類(lèi)似于天然骨的無(wú)機(jī)成分，可提供優(yōu)良的骨傳導(dǎo)性能，并具有良好的生物相容性、生物降解性及較強(qiáng)的抗壓性能，部分抗壓強(qiáng)度可達(dá)到松質(zhì)骨生物力學(xué)要求。常用的生物陶瓷材料主要包括羥基磷灰石（hydroxyapatite,HA）、β-磷酸三鈣（β-trical?cium phosphate,β-TCP）、雙相磷酸鈣、磷酸鎂（magne?sium phosphate,MP）、氧化鋁、氧化鋯等。但生物陶瓷脆性大、韌性差、剪切應(yīng)力低，且降解不全，同樣需要特定的高溫條件進(jìn)行3D 打印，不能同步涂層生物活性因子或抗感染藥物[9]。Warnke 等[17]運(yùn)用3D 打印技術(shù)分別制備HA 及磷酸三鈣（tricalcium phosphate,TCP）多孔支架，并以商品化的骨替代材料Bio-Oss?作為對(duì)照，進(jìn)行材料的表征及生物相容性研究，細(xì)胞活力染色、MTT、LDH、WST 結(jié)果均顯示HA 多孔支架的生物相容性優(yōu)于Bio-Oss?材料，而B(niǎo)io-Oss?材料的生物相容性又優(yōu)于TCP 多孔支架。在材料表面制備類(lèi)似于骨小梁的微孔結(jié)構(gòu)，可以為骨組織的長(zhǎng)入提供條件，Kim等[18]采用3D打印結(jié)合自固化反應(yīng)及鹽析法制備表面具有微孔結(jié)構(gòu)的MP多孔支架，與表面無(wú)微孔結(jié)構(gòu)的MP多孔支架相比，其孔隙率、降解性能、骨生成及骨塑形能力大大增加。摻雜功能性元素的生物陶瓷3D 打印研究同樣受到廣泛關(guān)注，Deng 等[19]將含錳元素的β-TCP 通過(guò)3D 打印技術(shù)制備成有序大孔結(jié)構(gòu)的支架，錳元素的引入顯著提高支架的抗壓強(qiáng)度及致密度，且隨著支架的降解緩慢釋放錳離子，刺激軟骨生長(zhǎng)，加速軟骨下骨的修復(fù)。Tarafder等[20]應(yīng)用3D打印技術(shù)制備含鍶及鎂元素的TCP多孔支架，通過(guò)大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證同樣具有優(yōu)異的骨修復(fù)性能。然而，傳統(tǒng)3D 打印工藝制備的多孔支架多由實(shí)心基元堆疊而成，降低了材料的孔隙率；且多孔支架的孔隙呈階梯三維延伸狀，不是平直的管道狀，在流體力學(xué)方面存在較強(qiáng)的流體阻力，不利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散及細(xì)胞的長(zhǎng)入。Feng 等[21]受到自然界中蓮藕內(nèi)部平行多通道結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，采用3D 打印制備出空心管基元堆疊而成的仿生蓮藕支架，與傳統(tǒng)3D打印多孔支架相比，擁有更高的孔隙率，更有利于骨細(xì)胞黏附、增殖及骨組織再生，且該方法可用于多種生物陶瓷（鎂黃長(zhǎng)石、氧化鋁、氧化鋯）、金屬材料等制備仿生蓮藕支架，擁有廣闊的應(yīng)用前景。

1.3 聚合材料

聚合材料可分為人工合成聚合材料和天然聚合材料。人工合成聚合材料主要有聚乳酸[poly（lactic acid）,PLA]、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯（polycaprolactone,PCL）、聚乙二醇、聚乳酸羥基乙酸共聚物[poly（lac?tic-co-glycolic acid）,PLGA]等，這類(lèi)材料來(lái)源廣泛，具有良好的生物相容性及生物降解性，且可按需定制，優(yōu)化其化學(xué)和生物力學(xué)性能。然而人工合成聚合材料多難溶于水，常需氯仿等有機(jī)溶劑作為黏結(jié)劑，但氯仿難以完全去除易導(dǎo)致毒性反應(yīng)；人工合成聚合材料降解產(chǎn)生酸性產(chǎn)物，易引起炎癥反應(yīng)；局部環(huán)境低pH 可加速材料降解，影響支架的機(jī)械強(qiáng)度[9]。單一3D 打印人工合成聚合材料各有優(yōu)缺點(diǎn)，Danilevicius 等[22]采用3D 打印技術(shù)制備4 種不同孔隙率及孔徑的多孔PLA支架，孔隙率分別為70%、82%、86%及90%，孔徑分別為25 μm、50 μm、70 μm及110 μm，研究多孔支架孔隙率對(duì)前成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，結(jié)果顯示孔隙率為70%的多孔支架未見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)入，孔隙率為86%的多孔支架最有利于細(xì)胞黏附生長(zhǎng)。Park等[23]運(yùn)用3D打印技術(shù)分別制備多孔PCL支架、多孔PLGA 支架，體外實(shí)驗(yàn)表明兩種支架材料均具有良好的生物相容性，通過(guò)12 周兔體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明兩種支架材料均可不同程度的促進(jìn)骨再生，但PLGA支架降解過(guò)快，不能提供足夠的力學(xué)支撐，從而導(dǎo)致PLGA支架的骨修復(fù)性能弱于PCL支架。兩種人工合成聚合材料制備復(fù)合支架的研究也備受關(guān)注，Kim和Cho[24]以PCL、PLGA為原材料，應(yīng)用新型多頭沉積技術(shù)制備PCL/PLGA多孔支架，該支架具有600 μm的均一孔徑和69.6%的孔隙率，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的生物相容性。局部氧化可提高人工合成聚合材料的性能，有研究表明隨著氧化程度的增加，聚乙烯醇多孔支架的降解程度及蛋白釋放特性均顯著增強(qiáng)[25]。天然聚合材料常見(jiàn)的有膠原、殼聚糖（chitosan,CS）、絲素蛋白、海藻酸鹽、透明質(zhì)酸、脫鈣骨基質(zhì)等，這類(lèi)材料具有良好的生物相容性、生物降解性，并具有天然多孔結(jié)構(gòu)及優(yōu)異的親水性能，有利于細(xì)胞黏附、增殖及分化。天然聚合材料均可用于骨修復(fù)多孔支架的3D打印，但他們難以大量獲取，且降解速率過(guò)快并缺乏一定的生物力學(xué)強(qiáng)度，較少單獨(dú)用作組織工程支架材料，常作為生物活性材料應(yīng)用于復(fù)合多孔支架的制備[2,26]。

1.4 復(fù)合材料

復(fù)合材料由兩種或更多種不同的材料如金屬與生物陶瓷、聚合材料與生物陶瓷等構(gòu)建而成，可綜合各種材料的優(yōu)點(diǎn)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，以更大程度滿足組織工程多孔支架的需求。3D打印技術(shù)制備的金屬多孔支架表面構(gòu)建生物陶瓷或聚合材料涂層，即將金屬多孔支架的優(yōu)異力學(xué)性能與生物陶瓷、聚合材料的優(yōu)異生物學(xué)性能有機(jī)結(jié)合，是金屬多孔支架復(fù)合材料研究的熱點(diǎn)。Ma等[26]應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)在3D打印制備的pTi支架表面成功構(gòu)建CS/HA涂層，該復(fù)合支架的生物力學(xué)性能與自然骨相匹配，較未涂層pTi支架更適合成骨細(xì)胞的黏附、增殖，是一種理想的負(fù)重部位骨修復(fù)材料。Li等[7]借助仿生技術(shù)成功制備HA/聚多巴胺涂層3D打印pTi支架，與未涂層pTi支架相比，細(xì)胞黏附增殖及成骨活性顯著增強(qiáng)；通過(guò)將復(fù)合涂層pTi支架植入兔股骨髁骨缺損模型中，發(fā)現(xiàn)HA/聚多巴胺涂層改性處理可以顯著提高pTi支架的骨修復(fù)及骨整合能力。

聚合材料與生物陶瓷的結(jié)合，如同骨組織中有機(jī)成分與無(wú)機(jī)成分的結(jié)合，更接近真實(shí)的骨基質(zhì)環(huán)境，被廣泛用于骨組織工程研究。低溫3D打印技術(shù)可以保留聚合材料與生物陶瓷材料的自然屬性，是近年來(lái)3D打印研究的新突破。Lin等[2]利用低溫3D打印技術(shù)構(gòu)建基于膠原/HA的仿生多孔支架，該支架具有三維交聯(lián)的多孔結(jié)構(gòu)并基本保留了原材料本身的特性，與非打印支架相比，可以顯著提高細(xì)胞黏附及促成骨作用。Jakus等[27]將90%HA與10%PCL（或10%PLGA）混合，作為3D打印墨水，室溫下制備成超彈性多孔支架，這種支架表現(xiàn)出良好的彈性及韌性，在受到擠壓時(shí)可迅速?gòu)?fù)原，且支持細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，并可誘導(dǎo)成骨分化；通過(guò)將支架植入大鼠脊柱融合模型及猴顱骨缺損模型中發(fā)現(xiàn)，該超彈性多孔支架可與周?chē)M織快速整合，并可促進(jìn)血管生成及骨再生。金屬功能性元素也可摻雜于復(fù)合材料中，Li等[28]應(yīng)用低溫3D打印技術(shù)將具有促成骨活性的金屬鎂均勻復(fù)合入PLGA/TCP可降解多孔支架中，該復(fù)合支架具有極高的孔隙連通性和理想的仿生多孔結(jié)構(gòu)，在體外研究中，表現(xiàn)出優(yōu)異的骨傳導(dǎo)及骨誘導(dǎo)活性，可促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)。

在復(fù)合支架的研究中還可以根據(jù)需要添加生物活性分子，使得支架具有更強(qiáng)的骨再生能力。淫羊藿苷是一種具有促成骨活性的天然植物小分子，Lai等[29]將淫羊藿苷與PLGA/TCP 材料均勻混合，應(yīng)用低溫3D 打印技術(shù)制備成多孔復(fù)合支架，該多孔支架具有優(yōu)異的骨傳導(dǎo)特性能力，復(fù)合的淫羊藿苷可以在植入部位穩(wěn)定釋放活性成分，原位促進(jìn)植入部位的新骨再生。軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白1 因其特有的促軟骨形成的作用而受到廣泛關(guān)注，徐燕等[30]利用3D 打印技術(shù)制備PCL/HA支架，借助多巴胺表面修飾，將軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白1負(fù)載于支架上，體外與人BMSCs共培養(yǎng)，可明顯促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖及成軟骨分化。

2 3D細(xì)胞或組織打印

3D 打印的細(xì)胞或組織打印技術(shù)是將細(xì)胞、生長(zhǎng)因子與支架材料同時(shí)打印，制備出帶有生命的“活”的支架。其優(yōu)勢(shì)在于：①相比于在已成型的支架中接種細(xì)胞，其可以獲得更高的細(xì)胞密度；②可精確調(diào)控細(xì)胞的空間分布，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞間、細(xì)胞與支架材料間的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞最終形成功能活性組織[9]。目前，3D細(xì)胞和組織打印主要是基于攜帶細(xì)胞的水凝膠3D 沉積技術(shù)，尤其在軟骨組織工程支架的構(gòu)建中應(yīng)用最為廣泛。聚合材料是最常見(jiàn)的打印墨水，Markstedt 等[31]將納米纖維素、藻酸鹽混合作為打印墨水與人軟骨細(xì)胞一起進(jìn)行3D 打印，以軟骨組織的CT掃描數(shù)據(jù)為模板，打印出半月板及人耳，經(jīng)過(guò)7 d的培養(yǎng)后，該復(fù)合物仍表現(xiàn)出86%的細(xì)胞活性。Kun?du 等[32]將PCL 和封裝軟骨細(xì)胞的藻酸鹽通過(guò)多頭沉積技術(shù)進(jìn)行3D 打印構(gòu)建軟骨組織支架，通過(guò)裸鼠皮下種植可見(jiàn)軟骨細(xì)胞分化良好。生物陶瓷材料也可用于3D 細(xì)胞或組織打印，Gao 等[33]將人BMSCs 與生物活性玻璃（bioactive glass,BG）及HA納米?；旌瞎餐蛴?，經(jīng)過(guò)21 d的培養(yǎng)，細(xì)胞活性及復(fù)合物的彈性模量均明顯增強(qiáng)。然而，大多數(shù)生物打印墨水難以模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)雜環(huán)境，無(wú)法完美重建細(xì)胞的形態(tài)及功能。Pati等[34]以脫細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)作為打印墨水，裝載細(xì)胞后打印，能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供一個(gè)優(yōu)異的微環(huán)境，且這種方法具有多樣性及靈活性，可用于軟骨、脂肪及心臟組織的打印。

3 3D打印載藥材料

載藥的3D打印多孔支架通常是在傳統(tǒng)多孔支架的基礎(chǔ)上，以其為基底，再經(jīng)過(guò)不同技術(shù)處理以載入相應(yīng)抗菌、抗結(jié)核等藥物。Han等[35]運(yùn)用電沉積技術(shù)在3D打印制備的多孔鈷鉻支架表面構(gòu)建絲素蛋白-慶大霉素復(fù)合涂層，結(jié)果顯示金屬支架的力學(xué)強(qiáng)度沒(méi)有受到電化學(xué)腐蝕的影響，同時(shí)涂層改善了支架材料的生物活性并具有良好的抗菌性能。銀及納米粒子因具有良好的抗菌活性而受到廣泛關(guān)注，Zhang等[36]首先制備3D打印β-TCP多孔支架，然后應(yīng)用浸漬法構(gòu)建載銀納米氧化石墨烯復(fù)合涂層，通過(guò)革蘭陰性菌的抑菌實(shí)驗(yàn)評(píng)估，該復(fù)合支架表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌活性，通過(guò)與兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可顯著提高堿性磷酸酶活性及成骨相關(guān)基因的表達(dá)。骨關(guān)節(jié)結(jié)核治療中，為避免長(zhǎng)期抗結(jié)核藥物治療帶來(lái)的耐藥性及全身毒副作用，有研究通過(guò)前期化學(xué)改性處理的BG和二氧化硅納米粒為基材負(fù)載異煙肼和利福平，運(yùn)用3D打印技術(shù)制備分層多孔復(fù)合支架，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，與商品磷酸鈣載藥支架相比，該復(fù)合支架具有優(yōu)異的抗結(jié)核藥物緩釋特性，且可維持體內(nèi)有效殺菌濃度達(dá)12周之久[37]。除了可以有效抗結(jié)核治療外，該復(fù)合支架還具有良好的骨缺損修復(fù)性能。這種結(jié)合優(yōu)異抗菌、抗結(jié)核活性與良好成骨性能于一體的雙功能多孔復(fù)合支架在感染性骨缺損的修復(fù)重建及骨關(guān)節(jié)結(jié)核的治療中擁有廣闊的應(yīng)用前景。

4 總結(jié)與展望

雖然3D打印多孔材料具有個(gè)性化及多樣化的優(yōu)勢(shì)，但其研發(fā)仍然存在一些不可回避的問(wèn)題：①目前對(duì)于可以維持細(xì)胞活性及其功能的生物活性材料的研究還處于實(shí)驗(yàn)階段；②3D打印多孔組織工程支架的最適參數(shù)尚無(wú)定論[3,38]，如支架的最適孔徑、孔隙率、降解速率等。目前3D打印機(jī)的分辨率較低，遠(yuǎn)達(dá)不到骨組織納米級(jí)的超微結(jié)構(gòu)水平，故還需提高打印設(shè)備的分辨率來(lái)增強(qiáng)支架的性能；③人體骨組織是由蛋白質(zhì)、鈣等多種物質(zhì)組成，其力學(xué)性能適應(yīng)人體需求，而傳統(tǒng)3D打印多孔支架通常局限于單一材料，支架性能與骨修復(fù)需求不吻合，綜合多種材料的優(yōu)點(diǎn)來(lái)構(gòu)建骨組織工程復(fù)合支架的研究還較少；④在細(xì)胞或組織打印方面，目前只能運(yùn)用單一活性細(xì)胞進(jìn)行打印，無(wú)法同時(shí)構(gòu)建神經(jīng)、血管網(wǎng)等精細(xì)結(jié)構(gòu)，不能重現(xiàn)人體組織、器官功能的復(fù)雜多樣性；⑤載藥3D打印多孔支架的研究還處于初級(jí)起步階段，對(duì)于藥物釋放特性及支架的成骨性能、降解性能還不能完全匹配。

目前，4D打印的理念[39,40]已被提出，即在3D打印三維的基礎(chǔ)上加入了時(shí)間的維度，使打印的物體可以隨時(shí)間發(fā)生動(dòng)態(tài)改變，不再是靜止、無(wú)生命的，增加了打印物體結(jié)構(gòu)和功能的可設(shè)計(jì)性，但仍需更深入的研究，以滿足不同患者的臨床需求。