結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病的生物標(biāo)志物

郭林紅，周 煒

肺間質(zhì)病(interstitial lung disease, ILD)是一組以肺泡單位炎癥和間質(zhì)纖維化為基本病變的彌漫性肺疾病。其臨床表現(xiàn)為活動后氣促與干咳，疾病進(jìn)展出現(xiàn)進(jìn)行性加重的呼吸困難；肺功能檢查出現(xiàn)彌散功能減低，晚期出現(xiàn)限制性通氣功能障礙；影像學(xué)檢查見雙肺彌漫性病變。引起ILD的病因多樣，包括環(huán)境因素、職業(yè)、藥物、免疫反應(yīng)等。其中結(jié)締組織病(connective tissue disease，CTD)是通過自身免疫反應(yīng)引起ILD的主要病因之一[1]。ILD也是CTD的常見并發(fā)癥，各種結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病(connective tissue disease-associated interstitial lung disease, CTD-ILD)的發(fā)生比例分別為：SSc 60%～100%、PM/DM 20%～50%、RA 10%～50%、SLE 3%～13%、pSS 10%～30%、MCTD 30%～85%。

參照2002年美國胸科協(xié)會和歐洲呼吸學(xué)會對特發(fā)性間質(zhì)性肺炎的分型標(biāo)準(zhǔn)， CTD-ILD的病理分型分為：普通型間質(zhì)性肺炎(usual interstitial pneumonia, UIP)、非特異性間質(zhì)性肺炎(nonspecific interstitial pneumonia, NSIP)、機(jī)化性肺炎(organizing pneumonia, OP)、彌漫性肺泡損傷(diffuse alveolar damage, DAD)、淋巴細(xì)胞性間質(zhì)性肺炎(1ymphocytic interstitial pneumonia, LIP)[2]，目前CTD-ILD研究常借用這個病例分型。

目前CTD-ILD的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、肺高分辨率CT(HRCT)及組織病理學(xué)檢查等；治療上主要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)聯(lián)合免疫抑制劑。繼發(fā)于不同CTD，以及不同病理類型的ILD的自然病程、治療反應(yīng)以及預(yù)后均不盡相同。尋找與CTD-ILD發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物，可能在疾病的早期診斷、判斷預(yù)后、預(yù)測治療反應(yīng)、監(jiān)控疾病進(jìn)展及探索治療靶點(diǎn)等方面發(fā)揮作用，具有重要臨床意義。目前CTD-ILD的發(fā)病機(jī)制研究主要涉及肺泡上皮細(xì)胞功能障礙、免疫調(diào)節(jié)異常、成纖維細(xì)胞活化/基質(zhì)重塑[3-4]。本文對參與上述CTD-ILD主要發(fā)病機(jī)制相關(guān)的生物標(biāo)志物進(jìn)行綜述。

1 肺泡上皮細(xì)胞功能障礙

1.1 肺泡表面蛋白

肺泡表面蛋白(surfactant proteins, SPs)是由肺泡Ⅱ型細(xì)胞合成并分泌的一種脂蛋白復(fù)合物，目前共發(fā)現(xiàn)四種蛋白，即表面蛋白A(SP-A)、表面蛋白B(SP-B)、表面蛋白C(SP-C)及表面蛋白D(SP-D)。它們的作用包括促進(jìn)肺表面活性物質(zhì)功能，降低肺泡表面張力、提高肺的順應(yīng)性、參與主動防御過程等。Takahashi等[5]通過ELISA法檢測42例SSc(包括30例SSc-ILD)患者和108例健康對照血清SP-A和SP-D的水平，結(jié)果SSc-ILD患者血清SP-A和SP-D明顯高于單純SSc患者及健康對照；SP-A和SP-D增高診斷SSc-ILD的敏感性分別為33%、77%，特異性分別為100%、83%；提示SP-A和SP-D可以作為診斷SSc-ILD的生物標(biāo)志物，且SP-D敏感性較SP-A高。 Yamakawa等[6]發(fā)現(xiàn)SSc/MCTD-ILD患者血清中高水平的SP-D與用力肺活量(forced vital capacity, FVC)的呈負(fù)相關(guān)，并可以作為預(yù)測FVC短期下降的生物標(biāo)志物。

1.2 涎液化糖鏈抗原

涎液化糖鏈抗原(Krebs von den Lungen-6, KL-6)是一種高分子量的黏蛋白樣糖蛋白，由肺泡Ⅱ型細(xì)胞和支氣管細(xì)胞表達(dá)，屬于黏液素MUC1家族。多種肺部疾病均會出現(xiàn)血清和肺泡灌洗液中KL-6水平升高，可能反應(yīng)肺泡Ⅱ型細(xì)胞損傷。Chen等[7]在一項前瞻性研究中通過ELISA法檢測100例PM/DM患者(包括56例PM/DM-ILD)基線以及56例PM/DM-ILD患者治療2個月后血清KL-6、SP-A、SP-D和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的表達(dá)水平，研究發(fā)現(xiàn)PM/DM-ILD患者基線血清KL-6、SP-A、SP-D和MCP-1的表達(dá)水平明顯高于PM/DM患者，且PM/DM-ILD患者治療前后KL-6的表達(dá)水平與ILD的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；KL-6不但可以作為預(yù)測PM/DM-ILD的生物標(biāo)志物，也可以用來監(jiān)測ILD的治療反應(yīng)。在另一項前瞻性研究中證實了基線升高的血清KL-6可能可以預(yù)測輕度肺損傷的SSc-ILD患者的肺功能惡化[8]。肺間質(zhì)病變超聲檢查出現(xiàn)特征性的“B線”改變， Wang等[9]發(fā)現(xiàn)，肺部超聲B線與KL-6血清水平具有較好的一致性，兩者結(jié)合可以更好的監(jiān)測ILD的進(jìn)展。

2 免疫調(diào)節(jié)異常相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子

2.1 巨噬細(xì)胞活化

CD163是一種特異性表達(dá)于活化的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞表面的清道夫受體，在急性、慢性炎癥反應(yīng)時，CD163從活化的巨噬細(xì)胞表面以酶切的方式脫落，血中可溶性CD163(sCD163)是單核巨噬細(xì)胞的標(biāo)志。Enomoto等[10]在一項回顧性研究中，通過ELISA法測定48例PM/DM-ILD、10例PM/DM、20例健康者血清sCD163的表達(dá)水平，結(jié)果PM/DM-ILD患者血清sCD163水平明顯高于PM/DM組及健康組；并通過免疫組化及Cox回歸模型證明高水平的sCD163 PM/DM-ILD患者肺部病變嚴(yán)重、預(yù)后差；表明sCD163水平可能可以作為預(yù)測PM/DM-ILD患者肺部病變嚴(yán)重及不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。

2.2 趨化因子

CCL18又稱肺活化調(diào)節(jié)趨化因子(pulmonary and activation-regulated chemokine, PARC)，主要由Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-10和IL-13等激活，肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在肺中高水平表達(dá)。Kodera等[11]通過一項回顧性研究，比較SSc-ILD患者中血清CCL18與KL-6、SPD水平，結(jié)果表明SSc-ILD患者血清CCL18水平升高，與DLCO和VC呈負(fù)相關(guān)，且敏感性較KL-6、SP-D強(qiáng)。Hoffmann-Vold等[12]通過一項前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，SSc-ILD患者的血清中，CCL18血清水平越高每年FVC下降程度越快，肺纖維化進(jìn)展越重，可以作為預(yù)測SSc-ILD疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物。

CXCL10又稱為干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10(Interferon gamma-induced protein 10, IP-10)，通過干擾素γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生；通過結(jié)合趨化因子受體CXCR3趨化T細(xì)胞和單核細(xì)胞來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)；在Th1型慢性炎性疾病中起主要作用。Chen等[13]通過ELISA方法檢測中國RA隊列、獨(dú)立的美國RA隊列不同程度的肺間質(zhì)病患者血清CXCL10表達(dá)水平，研究結(jié)果示RA-ILD患者，無論病情輕重，血清CXCL10水平均顯著升高，可作為診斷RA-ILD的生物標(biāo)志物。

2.3 細(xì)胞因子

IL-18是一種Th1型細(xì)胞因子，主要是由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在Th1免疫反應(yīng)活化中發(fā)揮重要作用。Yang等[14]通過ELISA方法檢測49例DM/PM(包括33例DM，16例PM，其中含18例DM-ILD，6例PM-ILD)及20例健康者血清IL-18的表達(dá)水平，結(jié)果DM-ILD患者血清IL-18表達(dá)水平明顯高于DM組及健康對照組，表明IL-18可以作為診斷DM-ILD的生物標(biāo)志物。

IFN-γ也是一種Th1型細(xì)胞因子，主要由活化的CD4+Th1分泌，CD8+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞也可表達(dá)。Ishikawa等[15]通過ELISA檢測9例DM 并發(fā)快速進(jìn)行性ILD(rapidly progressive ILD,RP-ILD)的患者及10例DM和19例健康者多種細(xì)胞因子(IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-α,IFN-γ, TNF-α)的血清表達(dá)水平，結(jié)果DM RP-ILD患者血清IFNγ表達(dá)水平明顯高于DM及健康對照；免疫組化顯示DM RP-ILD患者肺組織以及肺門淋巴結(jié)有大量IFN-γ+細(xì)胞浸潤；表明IFN-γ參與了DM RP-ILD 的肺部病變。

3 成纖維細(xì)胞活化/基質(zhì)重塑

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一組鋅離子依賴性的蛋白水解酶家族，在生理狀態(tài)下參與胚胎形成、新生血管的形成及傷口的愈合；在病理狀態(tài)下參與關(guān)節(jié)炎、癌癥、心血管疾病、肺纖維化等；其在降解細(xì)胞外基質(zhì)作用上發(fā)揮主要作用。MMP1是一種間質(zhì)膠原酶，由肺泡Ⅱ型細(xì)胞表達(dá)，主要降解Ⅰ型和Ⅲ型纖維膠原分子，正常情況下很少表達(dá)[16]。Oka等[17]發(fā)現(xiàn)MMP1血清水平在RA并發(fā)急性彌漫性ILD患者中明顯增高。MMP7又稱溶素(matrilysin)，主要有黏膜上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌[18]。在動物模型中敲除MMP7后，博萊霉素引起的肺纖維化可以減輕[16]。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)在RA-ILD患者中血清MMP-7表達(dá)水平增高，與病變程度無關(guān)，可作為診斷RA-ILD的生物標(biāo)志物。MMP9又稱明膠酶B(gelatinase)，在動物實驗中發(fā)現(xiàn)其在肺組織重塑中發(fā)揮作用[19]。Andersen等[20]發(fā)現(xiàn)SSc-ILD患者肺泡灌洗液中MMP9水平較單純SSc及健康對照組明顯增高。MMP12又稱巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶(macrophage elastase)，可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)。Matutebello等[21]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)MMP12敲除的小鼠可免受Fas誘導(dǎo)的纖維化，提示MMP12可能是纖維化反應(yīng)的主導(dǎo)介質(zhì)。Manetti等[22]通過ELISA檢測，SSc-ILD患者血清MMP12水平明顯高于單純SSc患者，并與肺纖維化嚴(yán)重程度相關(guān)。

4 自身抗體

一些自身抗體可見于CTD-ILD，但是并不具有特異性，如抗SSA/Ro52、抗Scl-70，以及抗CCP。這些自身抗體在ILD患者中陽性率增高的原因還不清楚，是否可以成為生物標(biāo)志物還有待進(jìn)一步研究。因免疫耐受被打破，產(chǎn)生自身抗體，出現(xiàn)異常免疫反應(yīng)造成組織器官損傷是許多CTD的發(fā)病機(jī)制。近來陸續(xù)報道了多種CTD-ILD相關(guān)的自身抗體，可幫助CTD-ILD的診斷、預(yù)后判斷和治療決策。

4.1 黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5

黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5(melanoma differentiation．a(chǎn)ssociated gene 5, MDA5)又稱干擾素誘導(dǎo)的解螺旋酶C結(jié)構(gòu)域蛋白1(IFN induced with helicase C domain protein l, IFIHl)，是視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ相關(guān)受體(retinoic acid inducible gene Ⅰ like receptor, RIG-Ⅰ like receptor，RLRs)家族中的重要成員，能識別胞質(zhì)內(nèi)雙鏈RNA(dsRNA)并誘導(dǎo)炎性因子和細(xì)胞表面分子的產(chǎn)生。Sato等[23]通過ELISA研究發(fā)現(xiàn)抗MDA5抗體是DM-RPILD的獨(dú)立危險因素，且抗體滴度與疾病活動及嚴(yán)重程度相關(guān)，治療前抗體滴度水平高提示疾病活動、病變重，治療后抗體滴度水平下降提示疾病緩解。Li等[24]通過薈萃分析同樣證實了抗MDA5抗體與DM-ILD和DM-RPILD相關(guān)，并可以作為診斷DM-RPILD的生物標(biāo)志物。Chen 等[25]通過免疫印跡法證實PM/DM-ILD患者中，抗MDA5抗體陽性的患者肺部病變重，治療反應(yīng)差，預(yù)后差。但是也有文獻(xiàn)報道，在抗MDA5抗體陽性的ILD中，抗MDA5抗體治療前后的滴度改變并不能評估治療反應(yīng)，而血清鐵蛋白治療前后表達(dá)水平的變化可以評估治療反應(yīng)，可能的機(jī)制是巨噬細(xì)胞激活參與了抗MDA5抗體相關(guān)ILD的發(fā)生，鐵蛋白增高反映了巨噬細(xì)胞激活程度[26-27]。

4.2 抗氨酰基-tRNA合成酶

抗氨?；?tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase, ARS)屬于催化氨基酸與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA結(jié)合的胞質(zhì)酶家族，是PM/DM特異的自身抗體，主要包括抗Jo-1(組氨酰)、抗PL-7(蘇氨?；?、抗PL-12(丙氨酰)、抗EJ(甘氨酰)、抗OJ(異亮氨酰)、抗ZO(苯丙氨酰)、抗KS(天冬氨酰基)和抗Ha(酪氨?；?8種，其中抗Jo-1最常見，20%～30% PM、2～10% DM可以檢測到，抗PL-7、抗PL-12僅在3%～4%的PM/DM患者中檢測到，而其他抗體檢出率小于2%[28]。此類抗體陽性的患者具有一組特殊的臨床癥候群，被稱為抗體綜合征，如肌炎、肺間質(zhì)病變、對稱性多關(guān)節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、技工手、急性發(fā)熱等，其中肺間質(zhì)病變是其主要癥狀，其中抗Jo-1對肌炎相關(guān)的ILD預(yù)測能力最強(qiáng)[28-29]。Chen 等[25]研究發(fā)現(xiàn)抗ARS陽性的PM/DM-ILD患者也可出現(xiàn)RPILD，但發(fā)生率較抗MDA5陽性患者低，而對免疫抑制劑治療反應(yīng)好的比例高、預(yù)后好。

4.3 鉀離子通道調(diào)節(jié)蛋白

鉀離子通道調(diào)節(jié)蛋白(potassium channel regulator,KCNRG)是鉀離子四聚化結(jié)構(gòu)域蛋白(potassium channel tetramerization domain-containing protein，KCTD)成員之一，可以通過四聚化T1結(jié)構(gòu)域形成多聚體，對電壓門控鉀離子通道hKv1.1和hKv1.4產(chǎn)生作用，減少鉀離子內(nèi)流[30]。有文獻(xiàn)報道KCNRG蛋白主要分布在小氣道上皮細(xì)胞，并在Ⅰ型自身免疫性多內(nèi)分泌腺病綜合征(Autoim-mune Polyglandular Syndrome Type 1, APS-1)并發(fā)肺部疾病患者的血清中檢測到了針對該蛋白的自身抗體，提示KCNRG可能是自身免疫性肺損傷的肺組織特異性抗原[31]。但是在另一篇文獻(xiàn)中，APS-1并發(fā)肺部疾病的患者中并未檢測到抗KCNRG抗體[32]。因此，KCNRG是否為自身免疫性肺病相關(guān)的自身抗原需要更多研究。

4.4 殺菌/滲透增強(qiáng)蛋白B1

殺菌/滲透增強(qiáng)蛋白B1(bactericidal/permeability-increasing fold containing B1, BPIFB1)是長片段PLUNC(palate, lung and nasal epithelium clone)的成員之一，含有484個氨基酸，又稱為LPLUNC1,主要在肺部表達(dá)，可能對呼吸道起天然防護(hù)作用[33]。Bingle等[34]發(fā)現(xiàn)BPIFB1在囊性纖維化肺病患者小氣道上皮的杯狀細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增多。Shum等[32,35]在Ⅰ型自身免疫性多內(nèi)分泌腺病綜合征(Autoimmune Polyglandular Syndrome Type 1, APS-1) 患者及與其相關(guān)的自身免疫病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)BPIFB1與ILD相關(guān)，并在特發(fā)性ILD和CTD-ILD患者血清中檢測到了抗BPIFB1抗體,提示抗BPIFB1抗體是肺部自身免疫疾病的特異標(biāo)志物。

總體上說，生物標(biāo)志物客觀計量，簡單易行，具有一定的敏感性和特異性，不僅可以作為CTD-ILD的早期診斷指標(biāo)，也可以監(jiān)測CTD-ILD的病情變化、判斷患者預(yù)后。近年來，對CTD-ILD發(fā)病機(jī)制的研究取得了進(jìn)展，許多潛在的生物學(xué)標(biāo)志物被認(rèn)識到。但是目前多為小樣本和單中心的研究，且集中于硬皮病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肌炎相關(guān)的肺間質(zhì)病變，對其他CTD-ILD研究不足。因此需要多中心大樣本隊列研究驗證報道的生物學(xué)標(biāo)記物的臨床意義，才能更有效的指導(dǎo)臨床實踐。