腦小血管病腦白質(zhì)損傷動(dòng)物模型

董成亞，王伊龍，2，劉向榮

腦小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）指包括位于腦實(shí)質(zhì)和蛛網(wǎng)膜下腔的所有血管結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變，引起的腦實(shí)質(zhì)缺血或出血性損傷[1]。CSVD影像學(xué)上表現(xiàn)為腔隙病灶、腦白質(zhì)高信號(hào)、腦微出血、近期皮層下小梗死灶及腦萎縮等異常信號(hào)。其中，腦白質(zhì)高信號(hào)，即腦白質(zhì)彌漫性損害是CSVD的標(biāo)志之一，臨床研究表明，腦白質(zhì)高信號(hào)常與患者認(rèn)知功能下降乃至血管性癡呆有關(guān)[2-3]。合適的動(dòng)物模型對(duì)CSVD相關(guān)腦白質(zhì)損傷的機(jī)制研究意義重大。本文主要描述具有腦白質(zhì)損傷的腦小血管病動(dòng)物模型的建立，旨在為CSVD腦白質(zhì)損傷相關(guān)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 單一型動(dòng)物模型

1.1 雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄動(dòng)物模型 通過手術(shù)在小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈周圍放置微彈簧圈可誘導(dǎo)慢性頸總動(dòng)脈狹窄動(dòng)物模型（bilateral common carotid artery stenosis，BCAS）。微彈簧圈的內(nèi)徑?jīng)Q定頸總動(dòng)脈狹窄的嚴(yán)重程度，通常用于BCAS的微彈簧圈內(nèi)徑為0.16～0.2 mm，內(nèi)徑越小，腦血流下降速度越快，同時(shí)小鼠因頸總動(dòng)脈急性收縮而死亡的比例越高[4]。BCAS能夠模擬人類因動(dòng)脈管腔狹窄、慢性低灌注等因素導(dǎo)致的CSVD，但缺乏CSVD腦小血管病理學(xué)改變?nèi)缋w維素樣壞死、玻璃樣變、淀粉樣物質(zhì)沉積等。

使用內(nèi)徑0.18 mm微彈簧圈制作的小鼠BCAS模型，與術(shù)前基礎(chǔ)值相比，術(shù)后2 h小鼠腦血流量減少60%～70%，但1～3個(gè)月后腦血流量可恢復(fù)80%～85%。微彈簧圈對(duì)血壓無明顯影響。術(shù)后3 d，觀察到BCAS小鼠血腦屏障通透性增加[5]；術(shù)后14 d，可見胼胝體白質(zhì)空泡化，免疫組化染色顯示髓磷脂堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）丟失[6-7]。BCAS小鼠還可表現(xiàn)出小膠質(zhì)細(xì)胞活化和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-2表達(dá)增加。有研究表明，MMP-2基因表達(dá)水平與腦白質(zhì)損傷的嚴(yán)重程度、血腦屏障破壞及神經(jīng)炎癥水平成正相關(guān)[8-9]。此外，隨著腦慢性低灌注時(shí)間延長(zhǎng)，BCAS小鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著下降；術(shù)后6個(gè)月時(shí)，海馬葡萄糖利用明顯降低；8個(gè)月時(shí)，可見海馬萎縮并伴有細(xì)胞固縮和凋亡[10]。

1.2 雙側(cè)頸總動(dòng)脈不對(duì)稱狹窄模型 雙側(cè)頸總動(dòng)脈不對(duì)稱狹窄模型是通過手術(shù)在小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈放置一個(gè)內(nèi)徑為0.5 mm的Ameroid慢性縮窄環(huán)，左側(cè)頸總動(dòng)脈周圍放置一個(gè)微線圈（內(nèi)徑為0.18 mm），造成雙側(cè)頸總動(dòng)脈不對(duì)稱狹窄模型（asymmetrical common carotid artery stenosis，ACAS）[11]。右側(cè)的Ameroid慢性縮窄環(huán)由于吸收周圍的組織液逐漸膨脹，導(dǎo)致被箍的右側(cè)頸總動(dòng)脈逐漸狹窄，大約在術(shù)后28 d發(fā)生閉塞[11-12]。左側(cè)的微線圈則導(dǎo)致同側(cè)半球腦血流量降低，術(shù)后1周可達(dá)平臺(tái)期。ACAS模型在術(shù)后2周和4周，右側(cè)（放置Ameroid縮窄環(huán)）皮質(zhì)和皮層下腦血流量均低于左側(cè)半球腦血流量。該模型相對(duì)于BCAS模型，避免了動(dòng)物因頸總動(dòng)脈急性收縮造成的死亡率過高問題，但同樣缺乏CSVD腦小血管病理學(xué)改變。

ACAS模型中，左側(cè)（放置微線圈）腦部血流量減少較輕，可見明顯的白質(zhì)疏松和膠質(zhì)細(xì)胞增多；在右頸總動(dòng)脈縮窄環(huán)側(cè)，組織病理學(xué)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)有海馬區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)元丟失[13]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在右側(cè)皮層下區(qū)域，包括深部白質(zhì)和海馬區(qū)可見多發(fā)性梗死[13-14]。此外，通過Y迷宮測(cè)試，發(fā)現(xiàn)ACAS小鼠空間工作記憶和自發(fā)活動(dòng)受損明顯，術(shù)后28 d可出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙[11]。因此，ACAS適用于CSVD中出現(xiàn)的腦白質(zhì)梗死并伴有運(yùn)動(dòng)缺陷和癡呆的動(dòng)物模型的行為學(xué)評(píng)估。

1.3 腦淀粉樣血管病模型 腦淀粉樣血管?。╟erebral amyloid angiopathy，CAA）是指在大腦和軟腦膜血管壁出現(xiàn)淀粉樣纖維沉積，主要是β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ），導(dǎo)致繼發(fā)性血管退行性改變[15]。CAA主要表現(xiàn)為皮質(zhì)微出血相關(guān)的白質(zhì)改變和進(jìn)展性癡呆，是與年齡老化相關(guān)的一種腦血管病[16]。該模型適合于因Aβ沉積引起的CSVD中血管病變和腦白質(zhì)損害的發(fā)生機(jī)制研究。

CAA表型相關(guān)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型主要通過基因調(diào)控淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP），引起Aβ合成增加或發(fā)生突變。其中，一類是散發(fā)性CAA動(dòng)物模型，如野生型過表達(dá)Aβ的APP Swedish小鼠（APP/Sw，Tg2576和APP23小鼠）易發(fā)生腦淀粉樣血管病[17-18]。另一類動(dòng)物模型可模擬遺傳性CAA，如Dutch APP小鼠是APP中E693Q基因位點(diǎn)突變所致，該模型小鼠主要表現(xiàn)為腦血管病理改變，在腦實(shí)質(zhì)中幾乎不存在淀粉樣蛋白，伴發(fā)血管肌細(xì)胞變性、腦血管淀粉樣變、神經(jīng)炎癥和出血[19]。同樣，Aβ中Dutch E22Q和Iowa D23N基因突變導(dǎo)致遺傳性CAA，伴發(fā)大量淀粉樣斑塊沉積[20]。而含有Swedish K670N/M6711和血管性Dutch/Iowa E693Q/D694基因突變的Tg-SwDI小鼠，僅在大腦血管表現(xiàn)出纖維性Aβ沉積，該模型小鼠有腦小血管淀粉樣變、腦白質(zhì)病變及明顯的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，包括腦血管密度降低、腦血管細(xì)胞凋亡及反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增多和小膠質(zhì)細(xì)胞活化[21-22]。

1.4 Notch3轉(zhuǎn)基因小鼠模型 伴有皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病（cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL）是一種由Notch3基因突變?cè)斐傻膯位蜻z傳性腦小血管病[23]。該模型的特征性病理變化是在電鏡下可觀察到中小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表面有嗜鋨顆粒（granular osmiophilic material，GOM）沉積，導(dǎo)致中小動(dòng)脈退行性變和腦血流量下降[24]。CADASIL發(fā)病由Notch3單基因突變所致，Notch3是在成熟動(dòng)脈血管壁肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種大的跨膜受體。CADASIL Notch3轉(zhuǎn)基因小鼠模型可以模擬非高血壓缺血性CSVD的遺傳現(xiàn)象。

文獻(xiàn)報(bào)道有兩種CADASIL相關(guān)表型的基因工程小鼠模型，它們都是模擬患者中Notch3基因Arg169Cys位點(diǎn)替換導(dǎo)致的CADASIL。其中一種轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶表達(dá)Notch3類似物的人工染色體，可導(dǎo)致Notch3的R169C點(diǎn)突變[25-26]。5月齡Notch3R169C小鼠開始出現(xiàn)GOM沉積，12月齡開始出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，18～20月齡小鼠胼胝體、紋狀體、內(nèi)囊和海馬出現(xiàn)廣泛的腦白質(zhì)病變[25]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，Notch3R169C小鼠的腦白質(zhì)早期病變呈進(jìn)行性和節(jié)段性，以髓鞘內(nèi)微泡形成（直徑＜1 μm）和水腫為主，與局灶性髓磷脂降解有關(guān)；同時(shí)，在腦白質(zhì)病變部位發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞清除髓鞘碎片的能力下降[27]。

另一種CADASIL小鼠模型是利用基因敲入系統(tǒng)將正常小鼠Notch基因替代為Notch3Arg170Cys，即Notch3基因的等位突變[28]。此方法構(gòu)建的Notch3Arg170Cys株小鼠在9月齡時(shí)開始出現(xiàn)GOM沉積，之后，出現(xiàn)一些卒中樣病變的癥狀。Notch3Arg170Cys株小鼠的大腦動(dòng)脈和外周動(dòng)脈（如尾動(dòng)脈）均可發(fā)生退行性病變。組織病理學(xué)分析顯示，該模型存在微出血、血栓形成、纖維膠質(zhì)細(xì)胞增多癥和微梗死。此外，在有些個(gè)體中，自13月齡起小鼠運(yùn)動(dòng)功能發(fā)生障礙，主要表現(xiàn)為肢體輕癱和步態(tài)不穩(wěn)[29]。

1.5 自發(fā)性高血壓大鼠模型及易卒中亞型大鼠模型 自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）是對(duì)成年高血壓Wistar大鼠進(jìn)行培育而獲得的[30]。SHR能夠模擬臨床患者高血壓引起的CSVD早期發(fā)病階段。而自發(fā)性高血壓易卒中大鼠（spontaneously hypertensive stroke-prone rats，SHRSP）是在SHR基礎(chǔ)上培育出的亞系，壽命較SHR短，卒中發(fā)生率高達(dá)80%以上。組織病理學(xué)證實(shí)，SHRSP的血管病變與人類CSVD類似，是目前較理想的CSVD模型[31]。但是，SHR及其易卒中亞型均缺乏嚴(yán)格的正常血壓對(duì)照，使得SHR和SHRSP在高血壓遺傳背景相關(guān)研究中受到限制[32]。

Daniel Kaiser等[33]對(duì)比研究了SHR和非高血壓Wistar Kyoto（WKY）大鼠認(rèn)知功能和神經(jīng)炎癥，發(fā)現(xiàn)在SHR生命里的前三分之一即存在血腦屏障功能受損、腦白質(zhì)損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞活化。SHR還表現(xiàn)為全腦萎縮、皮層下病變、皮層梗死出血，血管周圍間隙增大等[34]。該模型可表現(xiàn)出與腦白質(zhì)損傷有關(guān)的空間工作記憶和注意力等執(zhí)行功能缺陷，以及由于腦容量減少而導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙[35]。相比較SHR，SHRSP中腦白質(zhì)病變更為常見，且隨著鼠齡的增長(zhǎng)白質(zhì)損傷范圍增大，20周齡時(shí)，胼胝體、內(nèi)囊和尾狀核出現(xiàn)早期白質(zhì)病變；24周時(shí)，白質(zhì)疏松呈囊狀，尤其是在富含有髓纖維的內(nèi)囊區(qū)，可見明顯的空泡形成[36]。

1.6 易卒中型腎血管性高血壓大鼠模型 易卒中型腎血管性高血壓大鼠模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRSP）是我國(guó)學(xué)者曾進(jìn)勝應(yīng)用內(nèi)徑為0.3 mm的銀夾夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈誘導(dǎo)的穩(wěn)定高血壓大鼠模型[37]。SD大鼠在行雙腎雙夾術(shù)后血壓緩慢升高，至12周達(dá)到峰值，此后維持在200 mm Hg左右。該模型能夠模擬CSVD高危因素高血壓及相應(yīng)的腦小血管病理學(xué)改變。

RHRSP表現(xiàn)出的腦白質(zhì)病變與人類慢性高血壓性腦白質(zhì)病變發(fā)病過程相似。病理染色顯示腦白質(zhì)疏松、膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)纖維纏結(jié)或缺失。其中，病變最明顯的部位在胼胝體。腦小血管HE染色可見小血管玻璃樣變、管壁結(jié)構(gòu)消失和管腔狹窄。此外，在RHRSP中可觀察到血腦屏障破壞及大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力下降[38]。

1.7 高血壓靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型 非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物有著較大的多腦回大腦、豐富的腦白質(zhì)，以及與人類認(rèn)知類似的復(fù)雜行為，是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域非常珍貴的一種實(shí)驗(yàn)物種[39]。有學(xué)者以獼猴為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，成功建立胸主動(dòng)脈狹窄所致高血壓模型猴，其神經(jīng)病理學(xué)上最主要的損傷是：形狀不規(guī)則的微梗死（直徑＜500 μm），伴有局部膠質(zhì)細(xì)胞增生，散布于大腦皮層灰質(zhì)和白質(zhì)、腦干及小腦，尤其是前額葉白質(zhì)[40]。在該模型猴中，除局部小膠質(zhì)細(xì)胞活化外，未見其他血管病變。在手術(shù)后12個(gè)月左右，出現(xiàn)認(rèn)知功能下降[41]。動(dòng)物認(rèn)知功能障礙的嚴(yán)重程度與收縮壓和舒張壓的升高有關(guān)。

2 復(fù)合型動(dòng)物模型

2.1 自發(fā)性高血壓大鼠/雙側(cè)頸總動(dòng)脈漸進(jìn)性狹窄模型 Akihiro Kitamura等[42]將Ameroid收縮環(huán)套在自發(fā)性高血壓大鼠左、右側(cè)頸總動(dòng)脈上，造成雙側(cè)頸動(dòng)脈逐漸閉塞的慢性高血壓伴發(fā)腦灌注不足CSVD動(dòng)物模型（SHRs subjected to the bilateral CCA gradual occlusion，SHR-2VGO）。術(shù)后7 d，SHR-2VGO大鼠腦血流逐漸下降，達(dá)到基線水平的68%。術(shù)后28 d，SHR-2VGO大鼠表現(xiàn)出緩慢進(jìn)展的腦白質(zhì)病變和空間工作記憶受損；組織染色顯示腦白質(zhì)中有脫髓鞘改變、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增多。該模型克服了同時(shí)結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈出現(xiàn)的腦血流急劇下降導(dǎo)致的死亡率過高的問題，能夠較好地模擬CSVD中高血壓和慢性腦低灌注引起的腦小血管病理學(xué)改變和白質(zhì)損傷。

2.2 易卒中型腎性高血壓大鼠/改良的雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄動(dòng)物模型 林晶等[43]通過先行雙腎雙夾術(shù)制作RHRSP模型，12周后間隔1周先后進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉術(shù)，制作易卒中型腎性高血壓大鼠/改良的2VO模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat/modified 2 vessel occlusion，RHRSP/Modified 2VO）。RHRSP/Modified 2VO具有高血壓及腦小血管病理改變，能較好地模擬CSVD腦白質(zhì)病理改變。術(shù)后12周，RHRSP/Modified 2VO表現(xiàn)出腦小動(dòng)脈管壁增厚、血腦屏障破壞，免疫組化染色顯示I型和IV型膠原沉積在腦小靜脈[44]。此外，RHRSP/Modified 2VO大鼠還表現(xiàn)出髓磷脂堿性蛋白表達(dá)減少和腦白質(zhì)損傷分級(jí)增加，Morries水迷宮測(cè)試中出現(xiàn)明顯空間記憶功能受損[43]。

2.3 高脂血癥/雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄動(dòng)物模型Eek-Sung Lee等[45]在載脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈周圍放置微彈簧圈，建立高脂血癥合并慢性頸總動(dòng)脈狹窄動(dòng)物模型。造模后，組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)模型組小鼠有腦白質(zhì)損傷、多發(fā)性微梗死和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生；腦微循環(huán)研究發(fā)現(xiàn)模型小鼠腦微血管密度下降，血腦屏障破壞；此外，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該模型動(dòng)物空間工作記憶和自發(fā)運(yùn)動(dòng)功能下降，認(rèn)知功能也明顯受損。該小鼠動(dòng)物模型可用于探究高脂血癥引起的慢性低灌注性CSVD的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)。

具有白質(zhì)損傷的腦小血管病動(dòng)物模型不僅可以用來研究白質(zhì)改變和CSVD之間的關(guān)系，而且也可用來研究不同發(fā)病機(jī)制、治療藥物與CSVD疾病嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，對(duì)于疾病的預(yù)防、診斷及治療有著重要的作用。動(dòng)物模型制作的方法多樣，沒有統(tǒng)一的衡量標(biāo)準(zhǔn)，各種不同模型制備方法也各有其優(yōu)缺點(diǎn)，需要根據(jù)不同的研究目的來選擇和制備合適的CSVD動(dòng)物模型。

【點(diǎn)睛】本文總結(jié)了經(jīng)由頸總動(dòng)脈狹窄、高血壓、腦淀粉樣血管病、Notch3轉(zhuǎn)基因等方法建立腦小血管病白質(zhì)損傷動(dòng)物模型制作的方法及其在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。