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    實時熒光定量PCR HBV-DNA檢測系統(tǒng)性能驗證方法的探討

    2019-01-02 06:11:42李艷梅江忠勇李志強
    西南國防醫(yī)藥 2018年12期
    關鍵詞:定值精密度廠家

    李艷梅,江忠勇,李志強

    目前在我國臨床分子診斷學中,診斷項目主要為感染性疾病病原體核酸的擴增檢測,如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)等,采用的方法基本上都是實時熒光定量PCR。雖然PCR技術(shù)在我國各個臨床實驗室的運用極其廣泛和成熟,但仍然不同于臨床生化、血液等其他學科在標準化管理上有一套普遍認可的完整的管理體系,這就使得各個實驗室的操作管理系統(tǒng)存在很大的差異,實驗結(jié)果也可能相差甚遠[1]。ISO15189和美國病理學家學會(CAP)認可要求中規(guī)定,在開展某一檢測項目前,需進行方法學性能驗證[2-3]。為了保證PCR實驗室結(jié)果的準確性,規(guī)范實驗室操作流程,本研究以血清HBV-DNA檢測為例,對PCR定量檢測系統(tǒng)的性能驗證方法進行分析,擬為建立有關性能驗證的SOP提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 標本 2017年1~12月臨床需要行HBV檢測患者的送檢全血標本,在采集后2 h內(nèi)分離血清,并于當天檢測或于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 儀器與試劑 Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR擴增儀,低速瞬離器、經(jīng)校準合格的各類加槍;HBV定量檢測試劑(湖南圣湘生物科技有限公司,批號2017020)及其配套的定值血清和質(zhì)控品。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 精密度 依據(jù)CLSI EP15-2,選擇HBVDNA濃度在廠家聲明檢測范圍內(nèi)的臨床送檢標本,每天1個分析批次、2個水平濃度,每一水平濃度重復測定3次,連續(xù)檢測5 d,每個水平濃度累計得到15個結(jié)果。分別計算兩個水平濃度的重復性精密度(CV批內(nèi))和中間精密度(CV批間)。 判讀標準:根據(jù)國家標準GB/T214中的規(guī)定,方法精密度的重復性限為CV<5%;以能力驗證/室間質(zhì)評評價界限(靶值的對數(shù)值±0.4)作為允許總誤差TEa,CV批內(nèi)<3/5TEa且CV批間<4/5TEa為符合要求。

    1.3.2 準確度 選擇代表方法可報告范圍中的高、低決定性濃度的廠家定值血清標本,每天各重復2次測定,檢測5 d,每個濃度測定累計得到10個檢測結(jié)果。判讀標準:|log檢測值-log定值|≤0.4(能力驗證/室間質(zhì)評)且 CV<5%(國家標準GB/T214中關于方法精密度的重復性限的規(guī)定)為合格。

    1.3.3 線性范圍 依據(jù)CLSI EP6文件,以HBVDNA濃度為4.6×106IU/ml的定值血清為母液,用HBV-DNA檢測陰性且外觀正常的血清進行10倍濃度梯度稀釋,直至低于廠家聲明線性下限的一個濃度梯度(4.6×10、4.6×102、4.6×103、4.6×104、4.6×105、4.6×106IU/ml),每個濃度檢測3次取均值。以理論值與實測值作線性回歸分析,得出相關系數(shù)和線性范圍,R2≥0.98為符合要求(廠家聲明)。

    1.3.4 檢測下限 以廠家提供的HBV-DNA陽性定值血清為母液,用正?;旌涎逑♂屩翉S家聲明的檢測下限后,重復檢測10次,以檢測出≥9次為符合要求。

    1.3.5 檢測下限灰區(qū)標本的非特異性擴增 在對HBV-DNA高值母液血清標本稀釋為10~100 IU/ml的標本中,選取兩份分別完成15次檢測。分析每次反應曲線的起跳情況,計算起跳率(需≥95%)。準確性判斷標準:|log靶值-log檢測值|<0.8,即判讀標準完成結(jié)果的正確性>50%。

    1.4 檢驗程序質(zhì)量保證

    1.4.1 人員 由取得PCR上崗證的操作人員進行操作。

    1.4.2 質(zhì)控和溯源性 試驗過程均跟陰陽對照、校準品及標準定值血清,根據(jù)Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法,判斷當次質(zhì)控結(jié)果是否在控,如失控則重新檢測。所用的標準定值血清為二級標準,溯源于國家一級標準品。本實驗室參加2017年原國家衛(wèi)計委臨床檢驗中心室間質(zhì)評,結(jié)果通過。

    1.5 統(tǒng)計學方法 所有檢測濃度先行以10為底的log轉(zhuǎn)換后,應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。一致性檢驗采用配對t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 精密度 HBV-DNA定量檢測低、高值的CV批內(nèi)分別為 1.47%和 0.79%,CV批間分別為 2.09%和0.995%,精密度驗證通過(表1)。

    2.2 準確度 HBV-DNA定量低、高值的定值血清標本檢測結(jié)果中,CV值分別為3.59%和1.58%,準確度驗證通過(表2)。

    2.3 線性范圍 本試驗6個濃度梯度的線性回歸分析R2=0.9623(P<0.98),去掉最低濃度梯度后,回歸方程為:y=1.005x-0.2633,R2=0.9991 (P>0.98),證實檢測系統(tǒng)在(4.6×102~4.6×106)IU/ml范圍內(nèi)呈線性關系(圖 1),在廠家聲明的線性范圍(1×102~5×109IU/ml)內(nèi)。

    圖1 線性范圍驗證回歸曲線

    2.4 檢測下限 廠家聲明的HBV-DNA檢測下限為100 IU/ml,在此濃度10例標本全部檢出,大于最低要求的9例,檢測下限驗證符合廠家聲明。

    2.5 檢測下限灰區(qū)標本的非特異性擴增 在兩份灰區(qū)標本共計30次檢測結(jié)果中,所有反應均起跳,起跳率100%(>95%),正確性符合率分別為53.33%和66.67%(>50%),未在兩份稀釋血清標本中檢測到非特異性擴增。

    表1 HBV-DNA檢測精密度評價結(jié)果

    表2 HBV-DNA檢測準確度評價結(jié)果

    3 討論

    本研究參照文獻方法及相關管理體系文件的建議[4-8],設計了本實驗。對定量的分子檢測技術(shù)而言,目前尚沒有統(tǒng)一的國際參考標準來確定什么樣的精密度是可被臨床診斷實驗室所普遍接受的,一般試劑盒廠家所聲明的范圍,是本實驗室工作參照的最低標準。在此基礎之上,可以參照國內(nèi)外相關的其他權(quán)威標準,以此運用于自己的實驗室。

    根據(jù)《臨床檢驗方法確認與性能驗證》中“如何驗證廠家的聲明”的相關方案[10],本實驗參照能力驗證/室間質(zhì)評評價標準來評價正確度。在方法“1.3.2”中,本研究在正確度的試驗結(jié)果上,加入精密度的判斷標準以完成對準確度的判讀??梢?,準確度包括正確度和精密度。

    分子檢測技術(shù)的分析測量范圍是一個鑒別實時定量PCR效率的重要指標,目前還沒有一個標準化的方法來鑒別。最常用的方法是成倍或?qū)?shù)梯度稀釋參考物或已知陽性的靶核酸標本,核酸的梯度最少應有5個以上的測定梯度點來確定。由于高濃度臨床標本較難獲得,本試驗選用廠家提供的高濃度定值血清為母液,進行多梯度點的稀釋。通過各個梯度點實測值與理論值的線性回歸分析,以證明該PCR檢測技術(shù)符合驗證實驗所達到的設計要求。對HB-DNA定量檢測而言,是否檢出核酸是判斷HBV是否處于復制狀態(tài)的一項指標,所以,定量檢出下限的驗證也是性能驗證中不可缺少的一項。本實驗增加了對檢測下限灰區(qū)標本的擴增情況分析,結(jié)果表明,本系統(tǒng)所用試劑盒在灰區(qū)濃度的檢測具有較好的靈敏性和穩(wěn)定性。

    關于分子檢測系統(tǒng)的性能驗證內(nèi)容,其他參考文獻還提到分析靈敏度、特異性(交叉反應性和抗干擾能力)、分子檢測方法臨床驗證、核酸提取效率(完整性、產(chǎn)率與純度)等[11]。本實驗的核酸擴增效率均在90%~110%之間,但由于設備、試劑成本等多因素的限制,未能進行上述所有項目的驗證,而所完成的項目是在諸多PCR熒光定量性能驗證相關文獻報道的基礎上設計的。結(jié)果證明,本實驗設計方案可以運用于臨床檢驗工作中,能滿足預期臨床檢測要求,也可為本實驗室建立有關性能驗證SOP提供依據(jù)。

    綜上所述,本實驗室HBV-DNA檢測系統(tǒng)性能符合要求,設計的性能驗證方法可行性好,可為建立有關系統(tǒng)性能驗證的標準化操作規(guī)程(SOP)提供參考依據(jù)。

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