不同時期肢體缺血對缺血再灌注心肌PPARβ/δ表達的影響

任冰穩(wěn)，張寶和，連士杰，陳 洪，張 洋

心肌保護一直是心血管領(lǐng)域病變冠脈再通造成心肌缺血再灌注損傷的重要研究方向。遠隔缺血預(yù)處理(RIpreC)是指一個器官或組織的短暫缺血再灌注可對遠隔器官隨后發(fā)生的缺血產(chǎn)生保護作用。最早由Przyklent等于1993年提出，并在隨后的研究中得到證實。外周肢體骨骼肌的缺血處理由于簡便易行，是目前研究的熱點，并有研究將肢體缺血處理放在心肌缺血再灌注的不同時期進行[1-3]，但干預(yù)時機尚存在爭議。

過氧化物酶體增殖物激活受體 β/δ(PPARβ/δ)在心肌組織中表達豐富，屬于甾體類核受體超家族的成員，既往研究表明，其調(diào)控靶基因參與心肌細胞能量、凋亡、炎癥等多種病理生理過程[4-6]。本研究以雙下肢缺血作為遠隔缺血處理方法，在心肌缺血和再灌注不同時期間斷多次給予心肌缺血再灌注大鼠雙下肢非致死性缺血處理，檢測各組血清中心肌損傷 標(biāo)志物 CK-MB、cTnI含 量 和心 肌 PPARβ/δ mRNA和蛋白表達的變化，為心肌缺血再灌注損傷的防護提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 大鼠CK-MB、cTnI ELISA檢測試劑盒（美國Rapidbio公司）；RT-PCR檢測試劑盒（日本TaKaRa公司）；DNA marker（北京天根生化科技公司）； 羊抗鼠 PPARβ/δ一抗（美國 Santa Cruz公司）；兔抗羊辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（美國Santa Cruz公司）。

1.2 實驗動物及分組 健康雄性Wister大鼠40只(北京維通利華公司，合格證號:SCXK2012-0001)，體質(zhì)量280～300 g，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。飼養(yǎng)1 w后隨機分成4組，分別為單一心肌缺血再灌注對照組（MI-R組）、心肌缺血期遠隔處理組（RLIPerC組）、心肌缺血前遠隔處理組（RLIPreC組）、心肌缺血再灌注期遠隔處理組（RLIPostC組），每組10只。每組均行冠狀動脈前降支結(jié)扎30 min后再灌注2 h，并解剖出雙側(cè)股動脈。RLIPerC組、RLIPreC組、RLIPostC組以無損傷血管鉗夾閉雙側(cè)股動脈5 min開放5 min，共3個循環(huán)，但處理時間不同。RIPerC組與冠狀動脈前降支結(jié)扎同時進行，RIPreC組在冠狀動脈前降支結(jié)扎前30 min進行,RIPostC組在冠狀動脈前降支結(jié)扎結(jié)束后再灌注時進行。

1.3 缺血再灌注大鼠模型制備 參考文獻[6]方法，大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后，四肢連接心電圖機，監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖。氣管插管后連接動物呼吸機，參數(shù)設(shè)定通氣頻率70次/min，吸呼比1.25/1。開胸暴露心臟后，帶6-0線的眼科針在冠狀動脈根部下2 mm、肺動脈竇和左心耳之間穿過，線結(jié)內(nèi)墊一塑料管，收緊線結(jié)觀察到心肌組織顏色變暗，心電記錄ST段抬高。約30 min后，松開結(jié)扎線、拔出塑料管，再灌注（恢復(fù)冠狀動脈血供）2 h（成功標(biāo)志：局部組織充血，抬高的ST段相對降低＞1/2或高聳的T波下降）。再灌注結(jié)束后，留取血液標(biāo)本，迅速剪下心臟，在左心室前壁心梗相同位置留取心肌組織液氮冷凍，用以提取蛋白和RNA。

1.4 血清CK-MB和cTnI含量測定 實驗結(jié)束后，經(jīng)腹主動脈穿刺取血液標(biāo)本，離心分離血清后-80℃封存。按照試劑盒說明書檢測血清CK-MB和cTnI含量。

1.5 心肌PPARβ/δ mRNA含量測定 參考文獻[7]方法，用RT-PCR試劑盒檢測各組心肌組織PPARβ/δ mRNA含量。PPARβ/δ上游序列5'-AGC ACA TCT ACA ATG CCT ACC T-3'，下游序列 5'-TCT TGG CGA ACT CGG TGA-3'，產(chǎn)物大小為 258 bp；內(nèi)參照物GAPDH上游序列5'-CCA AGA AGG CTG GGG-3'，下游序列5'-CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC-3'，產(chǎn)物為196 bp。

1.6 Western blot法檢測心肌PPARβ/δ蛋白含量測定 稱取心肌組織100 mg，制作蛋白樣品，測定蛋白濃度，計算各樣品上樣量。采用BIO-RAD電泳系統(tǒng)以60 V電壓進行SDS-PAGE垂直電泳，40 V的電壓轉(zhuǎn)膜3 h，含5%脫脂奶粉TBST封閉1.5 h，置于羊抗鼠PPARβ/δ一抗中4℃過夜，TBST洗膜后加入兔抗羊二抗，室溫下孵育2 h。TBST洗膜后加入發(fā)光液進行曝光。將PPARβ/δ與GAPDH條帶的灰度值與面積的乘積之比，作為PPARβ/δ蛋白的相對含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清CK-MB、cTnI含量比較 再灌注2 h后，與MI-R組相比，另外3組CK-MB和cTnI水平比較均顯著降低(P＜0.05)，且3組間無明顯差異(P＞0.05)。 見表 1。

表1 各組血清CK-MB和cTnl含量比較(n=10)

2.2 各組心肌PPARβ/δ mRNA含量比較 再灌注2 h后，與MI-R組相比，另外3組心肌PPARβ/δ mRNA表達水平顯著升高(P＜0.05)，且3組間含量比較無明顯差異(P＞0.05)。見圖和表2。

表2 各組心肌PPARβ/δ mRNA和蛋白含量比較(n=10)

2.3 各組PPARβ/δ蛋白含量比較 再灌注2 h后，與MI-R組相比，另外3組心肌PPARβ/δ mRNA表達水平顯著升高(P＜0.05)，且3組間比較無明顯差異(P＞0.05)。見圖2和表2。

圖1 RT-PCR檢測各組大鼠心肌PPARβ/δ的mRNA表達

圖2 Western blot檢測各組大鼠心肌PPARβ/δ蛋白表達

3 討論

盡可能減輕血管再通后心肌缺血再灌注損傷一直是人們努力的目標(biāo)。Gao等[8]對包括540例患者的9個臨床試驗的meta分析表明，ST段抬高的心肌梗死患者PCI術(shù)冠脈開通前后不同時期給予肢體缺血再灌注處理，均可使術(shù)后72 h內(nèi)的CK-MB峰值和曲線下面積下降，ST段回落改善。但并不是所有的研究均表明，遠端肢體缺血處理可有效減輕缺血心肌血管再通導(dǎo)致的再次心肌損傷，并且在心肌缺血再灌注不同時期給予肢體缺血處理，對心肌損傷的影響是否存在差異尚需進一步探討。本研究在大鼠心肌缺血前、心肌缺血時和心肌缺血再灌注后3個不同時期給予雙下肢股動脈5 min夾閉5 min再灌注共3個循環(huán)的缺血處理，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，均可降低心肌損傷標(biāo)志物CK-MB和cTnI水平。

PPARβ/δ在心臟表達量比較高，環(huán)前列腺素、某些脂肪酸、視黃酸是PPARβ/δ的天然激動劑，GW50151、GW0742、LBX001、L-165041 是人工合成的PPARβ/δ強激動劑，但均尚未應(yīng)用于臨床。既往研究表明，心肌IR損傷的機制涉及多個方面，與心肌能量代謝、氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡、電生理等多種因素有關(guān)[9-10]。而PPARβ/δ可通過多個途徑發(fā)揮心肌保護作用：（1）促進心肌細胞再生：心肌再生能力很低，Park等[11]研究表明，專一性過表達 PPARβ/δ的心肌細胞增生能力增強，心臟專一性過表達PPARβ/δ 小鼠心梗面積減小，心功能改善。PPARβ/δ激動劑也有相同的作用。（2）抑制心肌細胞凋亡：研究表明，PPARβ/δ激動劑GW501516可減少脂多糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，并呈劑量依賴關(guān)系，與增加bcl 2/bax比值、抑制核因子NF κB的轉(zhuǎn)運有關(guān)[12]。（3）改善心肌重構(gòu)：Chang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦通過增加PPARβ/δ表達，改善糖尿病大鼠心肌細胞纖維化。（4）改善心肌能量代謝：PPARβ/δ可通過調(diào)節(jié)心肌細胞葡萄糖和脂肪酸的利用，改善心功能，減輕心肌肥厚、心力衰竭、心肌炎癥反應(yīng)[14]。（5）降低局部炎癥反應(yīng)：PPARβ/δ激動劑GW501516在體內(nèi)外可通過抑制NF-κB活化，降低炎癥因子TNF、MCP-1、IL-6 表達[15]。 本研究發(fā)現(xiàn)，與單一心肌缺 血 再 灌 注 大 鼠 相 比 較 ，RLIPerC、RLIPreC、RLIPostC組大鼠心肌PPARβ/δ mRNA和蛋白表達均顯著升高，提示不同時期遠隔肢體缺血處理誘導(dǎo)心肌PPARβ/δmRNA和蛋白表達增加，可能通過上述多種途徑對再灌注心肌發(fā)揮保護作用。

總之，無論是在心肌缺血前、心肌缺血同時，還是在心肌缺血再灌注后給予遠隔肢體缺血處理，均可減輕心肌損傷，且無明顯差異。心肌PPARβ/δ mRNA和蛋白表達升高可能與遠隔肢體缺血處理的心肌保護有關(guān)，未來PPARβ/δ激動劑可考慮應(yīng)用于冠心病PCI患者，以減輕心肌缺血再灌注損傷。