慢性腦低灌注致大鼠腸黏膜損傷及claudin-3表達變化的研究

張 棋，舒佳惠，歐陽夢琪，王慶松

慢性腦低灌注（CCH）是缺血性腦損害的重要病理生理基礎，也是引發(fā)血管性認知障礙等卒中后神經血管功能障礙的常見危險因素和病理生理機制[1-2]。腦血管病相關消化道癥狀臨床常見，半數以上卒中患者可出現吞咽困難、潰瘍、便秘或胃腸道出血等并發(fā)癥[3]；另一方面，腸道作為應激反應的中心器官之一，腸黏膜屏障及腸道功能改變在神經功能調節(jié)、炎性反應調控、機體功能維持中有重要意義[4-5]。雖然研究顯示腦血管病后急性期存在腸屏障損傷、腸通透性增加及緊密連接蛋白表達減少等病理生理變化[6]，但有關急性缺血性腦損害后CCH狀態(tài)對腸黏膜的持續(xù)性損害效應目前尚未見報道，而進一步探討CCH所致腸黏膜屏障及功能改變，有助于深入認識卒中相關神經血管功能障礙的相關機制、探尋有效防護措施。因此，本研究擬探討CCH致大鼠腸黏膜形態(tài)學改變及緊密連接蛋白claudin-3表達變化及其相關性，初步揭示CCH對實驗動物腸黏膜屏障及功能改變的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠 80 只[清潔級，體重（260±20）g]，購自成都市達碩實驗動物中心，動物合格證編號：SCXK（川）2015-030。適應性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為Sham組（32只）和CCH組（48只）。

1.2 CCH模型制備 在前期研究工作的基礎上，采用雙側頸總動脈永久結扎法（BCCAO）建立CCH模型[7]。Sham組方法同前，但雙側頸總動脈只分離而不結扎。造模后，Sham組大鼠無死亡，CCH組死亡10只。各組再按照觀察時間不同分為如下亞組：（1）Sham 1 w 組（n=8）；（2）Sham 4 w 組（n=8）；（3）Sham 12 w 組（n=8；（4）Sham 24 w 組（n=8）；（5）CCH 1 w組（n=10）；（6）CCH 4 w 組（n=9）；（7）CCH 12 w 組（n=10）；（8）CCH 24 w 組（n=9）。

1.3 腸組織標本的制備 各亞組在CCH建模后相應時點，麻醉大鼠，沿腹中線剪開，距回盲部5 cm處取回腸末段組織（長度1 cm），生理鹽水漂洗，4%多聚甲醛固定（24 h），制成厚度4 μm的石蠟標本、切片，用于HE染色及免疫熒光染色。

1.4 HE染色 腸標本切片脫蠟后，蘇木精染色，分色后伊紅染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學變化，Chiu腸黏膜損傷評分法進行病理損傷評估[8]。

1.5 免疫熒光染色觀察claudin-3 腸標本切片脫蠟后，使用枸櫞酸鈉緩沖液（pH=6.0）抗原修復；封閉 30 min后，直接滴加兔抗 claudin-3抗體（1∶100，ab15102，英國Abcam公司），4℃孵育過夜；PBS漂洗 5 min×3 次；滴加二抗（1:1000，美國 Invitrogen 公司），37 ℃恒溫箱孵育 1 h；PBS漂洗 5 min×3次；DAPI室溫染色5 min，PBS漂洗5 min×3次后封片。使用熒光顯微鏡結觀察及圖像采集，并使用Image J進行分析。

1.6 統計學方法 應用SPSS 23.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩變量相關性采用Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 回腸組織形態(tài)學變化 Sham組可見回腸黏膜結構完整，絨毛呈指狀且排列較整齊。而CCH組1 w時回腸絨毛變粗變鈍；隨時間延長，4 w、12 w時，黏膜下間隙擴大，絨毛頂端部分脫落；24 w時，腸絨毛縮短且增粗明顯，固有層及其血管暴露（圖1）。按照Chiu腸黏膜損傷評分，CCH組回腸黏膜較同時間 Sham組損傷明顯（P＜0.01），CCH組中，4 w、12 w及24 w 3個亞組間比較無統計學差異，但較1 w時損傷顯著加重（P＜0.01，表1）。

2.2 claudin-3免疫熒光染色結果 claudin-3完整分布于Sham組回腸黏膜上皮細胞間隙，CCH組上皮細胞間claudin-3明顯缺失（P＜0.01），1 w時最顯著，隨時間延長，CCH組claudin-3表達量逐漸升高，但均較同時間Sham組顯著減少（P＜0.01，表2）。

2.3 腸黏膜損傷程度與claudin-3表達強度相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，所有實驗大鼠回腸黏膜損傷程度與claudin-3表達強度呈負相關（r=-0.819,P＜0.05）。

圖1 各組回腸黏膜組織HE染色結果(100×)

表1 兩組不同時間回腸黏膜HE染色Chiu評分比較

3 討論

卒中會引起免疫抑制，導致腸屏障的破壞，影響腸道蠕動和滲透性，使機體易受細菌感染[9]，這可能與腸黏膜屏障完整性破壞密切相關。本研究發(fā)現，CCH組回腸黏膜存在明顯損傷，CCH后1 w腸絨毛開始變粗變鈍，隨后損傷加重，表明CCH可導致持續(xù)的腸黏膜損傷，4 w時最明顯，此后損傷不繼續(xù)加重，但持續(xù)長達至少24 w。Tascilar等[10]研究表明，急性缺血性卒中導致腸黏膜絨毛損傷、細菌移位，提示急性缺血性腦損害后的CCH狀態(tài)對腸黏膜的長時間持續(xù)性損傷可能會造成腸道通透性增加，誘發(fā)腸道炎癥反應及細菌移位，使機體其他組織系統易受感染而加重病情。

表2 兩組不同時間回腸黏膜熒光染色平均光密度比較

各種應激發(fā)生時，胃腸道最早發(fā)生缺血，易較早受損或衰竭，又最后得到恢復[11]，其中胃腸道黏膜屏障最易受到損傷。腸黏膜屏障能防止腸道內的有害物質如細菌和毒素進入生物體內其他組織、器官和血液循環(huán)系統，而完整的腸黏膜機械屏障是其發(fā)揮保護作用的結構基礎。緊密連接作為腸黏膜機械屏障的重要組成部分，以細胞-細胞黏附的方式連接腸黏膜上皮細胞發(fā)揮屏障作用[12]。Claudins家族是緊密連接最重要的蛋白質，claudin-3在人和大鼠的腸上皮連接處高度表達。本研究發(fā)現，CCH組claudin-3的表達顯著減少（P＜0.01），CCH后1 w時claudin-3表達減少最顯著，4 w、12 w后有所回升，24 w時較1 w雖明顯回升（P＜0.05），但仍低于同時間Sham組（P＜0.01），提示CCH可致長時間腸黏膜claudin-3表達減少，與Lu等[13]的研究結果一致，可能與腸黏膜的損傷有密切關系。相關性分析也顯示，回腸黏膜損傷程度與claudin-3表達強度呈負相關（P＜0.05），提示claudin-3可能被用作CCH引發(fā)的腸黏膜損傷標志物[14]。

綜上所述，CCH可引發(fā)大鼠回腸黏膜長達24 w的持續(xù)性損害，腸黏膜claudin-3表達明顯減少，且腸黏膜損傷程度與claudin-3的表達水平呈負相關，提示claudin-3表達水平或可成為CCH致腸黏膜損傷的重要病理標志。