利用猴頭菌發(fā)酵大果山楂汁的條件優(yōu)化研究

張 巧，陳春喜，吳天保

（1.賀州學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542899；2.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西 賀州 542899；3.廣西果蔬保鮮和深加工研究人才小高地，廣西 賀州 542899）

大果山楂（Crataegus pinnatifidaBge.var.major N.）又名烏蟬子（廣西苗語(yǔ)）、麻缺頓、墨雞屯（廣西壯語(yǔ)），是由小果南山楂經(jīng)選育嫁接而成的藥果兼用樹種，是廣西的特色農(nóng)產(chǎn)品之一[1]。與普通山楂相比，大果山楂果粒大，易加工與儲(chǔ)藏，鮮食味道可口且營(yíng)養(yǎng)豐富[2]。大果山楂醫(yī)用價(jià)值較高，具有開胃健胃、增強(qiáng)心肌收縮力、防止心率紊亂、降壓利尿和鎮(zhèn)靜等作用，在降血脂、降血糖、抑菌、抗腫瘤等方面均有一定的功效[3-5]。

猴頭菇（Hericium erinaceus）是一種珍貴的藥食兼用的大型真菌，具有抗衰老、降血脂、抗腸胃潰瘍、提高免疫力和抗腫瘤等作用，在治療胃潰瘍、慢性胃炎等胃部疾病方面效果明顯，其活性成分主要是猴頭菇多糖[6-8]。目前市面上的猴頭菇產(chǎn)品主要是以猴頭菇子實(shí)體為原料，制成猴頭菇餅干、猴頭菇飲料以及一些猴頭菇營(yíng)養(yǎng)湯料等[9]。這些產(chǎn)品雖然具有猴頭菇豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但野生猴頭菇資源有限，人工栽培周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低。而猴頭菌的液體發(fā)酵可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的菌絲體和發(fā)酵產(chǎn)物，且成本低，工藝簡(jiǎn)單，是一種獲取猴頭菇營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要手段[10]。

本研究結(jié)合大果山楂和猴頭菇豐富的營(yíng)養(yǎng)及保健價(jià)值，以大果山楂汁為主要培養(yǎng)基原料，對(duì)猴頭菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為大果山楂猴頭菇飲料的開發(fā)和生產(chǎn)提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菌：廣東省微生物菌種保藏中心；大果山楂：賀州市水果建材批發(fā)市場(chǎng)；果膠酶（酶活力3萬(wàn)U/g）、酸性纖維素酶（酶活力1萬(wàn)U/g）：山東蘇柯漢生物工程股份有限公司；硫胺素：上海源葉生物科技有限公司；濃硫酸：西隴化工股份有限公司；苯酚：成都市科龍化工試劑廠。所有實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextroseagar，PDA）：20%馬鈴薯汁1 L，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5g，硫胺素8mg，瓊脂20g，pH自然，115℃高壓滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

JYZ-D526九陽(yáng)榨汁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；KDC-40低速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；ZWYR-2012C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；DL-CJ-2N型超級(jí)潔凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；KRQ-250A人工氣候箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；722N可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；FJ200高速分散均質(zhì)機(jī)：上海標(biāo)本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

（1）菌種的活化

用接種鏟從猴頭菌斜面上切出1～2塊1 cm2的菌絲塊轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基的中間，菌絲朝上，于26℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)10～25 d，直至菌絲滿管?；罨?～3代，使菌株活力達(dá)到最強(qiáng)。

（2）種子液的制備

將活化后的猴頭菌接種至PDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26℃，培養(yǎng)時(shí)間為7～10 d，待用。

1.3.2 大果山楂汁的制備

挑選新鮮、無(wú)損傷的完整大果山楂，經(jīng)清洗瀝干后切塊去核，加入到0.3%的抗壞血酸溶液中進(jìn)行護(hù)色，其中山楂果肉∶護(hù)色液=1∶1.5（g∶mL），打成勻漿，分別加入勻漿質(zhì)量0.3%的果膠酶和纖維素酶，混勻后放入45℃的恒溫水浴鍋中攪拌酶解2.5 h，然后在沸水中加熱滅酶5 min，立即用冷水冷卻至室溫，過濾。在濾液中加入5 g/L的白砂糖，分裝，裝液量60 mL/250 mL，密封，于80℃的恒溫水浴鍋中保溫15 min進(jìn)行滅菌。

1.3.3 發(fā)酵液中多糖的提取及測(cè)定

第三，通過完善“互聯(lián)網(wǎng)+”的建設(shè)，使基礎(chǔ)信息數(shù)據(jù)具有整合性的特質(zhì)，從而保證數(shù)據(jù)的方向型傳輸。進(jìn)而使數(shù)據(jù)的收集、數(shù)據(jù)的運(yùn)用、數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存能在校園數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行整合、分析和處理。特別是需要根據(jù)“互聯(lián)網(wǎng)+”的功能分層做出相應(yīng)調(diào)研，使教學(xué)、管理和信息的傳遞功能不會(huì)因數(shù)據(jù)的混亂而造成整合發(fā)生偏差。

多糖的提取[11]：取一定量的發(fā)酵液，使用高速分散均質(zhì)機(jī)（直徑12 cm，10 000 r/min）均質(zhì)5 min，使猴頭菌菌絲斷裂，在冰浴條件下進(jìn)行超聲波破碎菌絲（200 W，超聲1 s，停2 s，總時(shí)間30 min），離心（10 000 r/min，10 min），取10mL上清液，加入30mL的預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，4℃條件下放置過夜。離心（8000r/min，20min），沉淀用體積分?jǐn)?shù)為75%的預(yù)冷乙醇清洗表面，室溫放置1 h，待表面乙醇完全揮發(fā)，用2mL蒸餾水溶解均勻，離心（10 000 r/min，10 min），測(cè)定上清的多糖含量。

多糖含量的測(cè)定：采用苯酚-硫酸法[12]進(jìn)行測(cè)定。取稀釋樣液1 mL，加入0.5 mL的5%苯酚，搖勻后加入2.5 mL的濃硫酸，混合均勻，沸水中加熱20 min，立刻取出置于冷水中冷卻至室溫，測(cè)定其在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值。采用0～1.0 mg/mL的葡萄糖溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=1.432x-0.005，R2=0.999，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算發(fā)酵液中形成的多糖，其含量計(jì)算公式如下：

C=C1-C0

式中：C為發(fā)酵液中形成的多糖含量，mg/mL；C1為發(fā)酵液中的多糖含量，mg/mL；C0為初始大果山楂汁的多糖含量，mg/mL。

1.3.4 菌絲濕質(zhì)量的測(cè)定

將猴頭菌發(fā)酵液離心（8 000 r/min，20 min），去掉上清，將離心管室溫下倒置2h，待管壁周圍水分蒸發(fā)完全，稱質(zhì)量。

1.3.5 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

在酶解后的大果山楂汁中分別添加0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L的白砂糖，混勻后進(jìn)行分裝滅菌，分別接種2%、4%、6%、8%、10%的猴頭菌種子液，分別在22℃、24℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min的條件下發(fā)酵10 d，測(cè)定發(fā)酵液中形成的多糖含量和菌絲濕質(zhì)量。

1.3.6 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，從而確定猴頭菌發(fā)酵大果山楂汁的最優(yōu)條件。

表1 猴頭菌發(fā)酵條件正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization byHericium erinaceus

2 結(jié)果與分析

2.1 白砂糖添加量對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量的影響

山楂的營(yíng)養(yǎng)組成特點(diǎn)是酸高，而糖含量相對(duì)較低[13]。李宇偉等[14]研究果糖、蔗糖、乳糖、淀粉、葡萄糖、麥芽糖等碳源對(duì)猴頭菌液體培養(yǎng)產(chǎn)多糖的影響發(fā)現(xiàn)，蔗糖是最合適碳源。因白砂糖的主要成分是蔗糖，且經(jīng)濟(jì)易得，因此本研究選定白砂糖作為大果山楂汁中添加的碳源，以促進(jìn)猴頭菌的生長(zhǎng)。大果山楂汁中白砂糖的添加量對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量的影響見圖1所示。

圖1 白砂糖添加量對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of sugar addition on polysaccharide content and mycelium wet weight

由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，隨著白砂糖添加量的增加，發(fā)酵液中形成的多糖及菌絲不斷增加，當(dāng)白砂糖添加量達(dá)到10 g/L時(shí)，多糖含量與菌絲濕質(zhì)量最高，說明大果山楂汁中的白砂糖得到了很好的利用，促進(jìn)了猴頭菌的生長(zhǎng)及多糖的形成。當(dāng)白砂糖添加量＞10 g/L之后，多糖含量及菌絲濕質(zhì)量均開始下降，可能原因在于較高濃度的糖溶液，發(fā)酵液的滲透壓較大，對(duì)猴頭菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的抑制作用。因此，大果山楂汁中白砂糖的最適添加量為10 g/L。

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量的影響

菌體的生長(zhǎng)發(fā)育是一系列酶促反應(yīng)的結(jié)果，溫度能通過酶的活性調(diào)節(jié)、氧的溶解等因素影響發(fā)酵，因此溫度是影響猴頭菌發(fā)酵產(chǎn)多糖及形成菌絲的重要因素[15]。發(fā)酵溫度對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量的影響見圖2所示。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on polysaccharide content and mycelium wet weigh

由圖2可知，在22～26℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液中的多糖含量及菌絲濕質(zhì)量也不斷增加，提高溫度有利于促進(jìn)猴頭菌的生長(zhǎng)及多糖的形成。當(dāng)發(fā)酵溫度＞26℃之后，多糖含量和菌絲濕質(zhì)量均開始下降，因此，確定猴頭菌在大果山楂汁中進(jìn)行發(fā)酵的最適溫度為26℃。

2.3 轉(zhuǎn)速對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量的影響

轉(zhuǎn)速大小與溶氧有一定的關(guān)系，在一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)速越高越利于改變?nèi)苎跣Ч?，從而影響發(fā)酵液中猴頭菌的生長(zhǎng)發(fā)育。轉(zhuǎn)速對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量的影響見圖3所示。

圖3 轉(zhuǎn)速對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of rotation speed on polysaccharide content and mycelium wet weigh

由圖3可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)，發(fā)酵液中的菌絲濕質(zhì)量及多糖含量較高。當(dāng)轉(zhuǎn)速＜160r/min之前，溶氧過少不利于猴頭菌的生長(zhǎng)；當(dāng)轉(zhuǎn)速＞160 r/min之后，子實(shí)體與菌絲容易結(jié)團(tuán)，抑制菌絲生長(zhǎng)[16]。因此，確定猴頭菌在大果山楂汁中進(jìn)行發(fā)酵的最適轉(zhuǎn)速為160 r/min。

2.4 接種量對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量的影響

種子液接種量也是影響猴頭菌發(fā)酵的重要因素，適量的接種量有利于促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)及猴頭菇多糖的形成。接種量對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量的影響見圖4所示。

圖4 接種量對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of inoculum on polysaccharide content and mycelium wet weigh

由圖4可知，接種量在0～6%范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，大果山楂汁發(fā)酵液中的多糖含量也隨之增加，當(dāng)接種量＞6%之后，多糖含量隨接種量增加反而下降，原因可能在于，接種量過高，猴頭菌對(duì)發(fā)酵液中多糖的消耗大于多糖的形成；此外，在0～10%范圍內(nèi)，接種量增加，猴頭菌菌絲濕質(zhì)量也隨之提高，當(dāng)接種量＜6%之前，增長(zhǎng)速率較快，當(dāng)接種量＞6%之后，增長(zhǎng)速率趨于平緩。因此，確定猴頭菌在大果山楂汁中進(jìn)行發(fā)酵的最適接種量為6%。

2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以白砂糖添加量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、接種量設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)L9（43），以發(fā)酵10 d后的多糖含量及菌絲濕質(zhì)量為考察指標(biāo)，確定猴頭菌在大果山楂汁中的最佳發(fā)酵工藝，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2的極差分析可知，以多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，各因素對(duì)多糖含量的影響大小是A＞D＞B＞C，即白砂糖添加量影響最大，接種量次之，然后是發(fā)酵溫度，最后是轉(zhuǎn)速，最優(yōu)組合是A2B2C2D3；以菌絲濕質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，各因素對(duì)猴頭菌絲濕質(zhì)量的影響大小是A＞D＞B＞C，即白砂糖添加量影響最大，接種量次之，然后是發(fā)酵溫度，最后是轉(zhuǎn)速，最優(yōu)組合是A2B2C1D3。由直觀分析可知，多糖含量及菌絲濕質(zhì)量最高的條件是A3B2C1D3，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3的方差分析結(jié)果表明，白砂糖添加量對(duì)多糖含量影響極顯著（P＜0.01），對(duì)菌絲濕質(zhì)量影響顯著（P＜0.05），而接種量對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量均有顯著的影響（P＜0.05）。此外，發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)多糖含量及菌絲濕質(zhì)量則無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

根據(jù)各因素的最優(yōu)水平，產(chǎn)多糖的最優(yōu)組合為A2B2C2D3，產(chǎn)猴頭菌菌絲的最優(yōu)組合為A2B2C1D3，直觀分析結(jié)果為A3B2C1D3，在這三個(gè)條件下進(jìn)行發(fā)酵組合驗(yàn)證試驗(yàn)，每組三個(gè)平行并計(jì)算平均值，驗(yàn)證結(jié)果確定猴頭菌在大果山楂汁中的發(fā)酵條件最優(yōu)組合是A2B2C2D3，即白砂糖添加量為10 g/L，發(fā)酵溫度為26℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為8%，此條件下，多糖含量達(dá)到5.91 mg/mL，菌絲濕質(zhì)量達(dá)到255.86 mg/mL。

3 結(jié)論

通過多個(gè)單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)猴頭菌在大果山楂汁中的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的發(fā)酵條件：大果山楂汁中白砂糖的添加量10 g/L，發(fā)酵溫度26℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，接種量8%。在此優(yōu)化條件下，猴頭菌發(fā)酵10d，發(fā)酵液中的多糖含量達(dá)到5.91 mg/mL，菌絲濕質(zhì)量達(dá)到255.86 g/mL。此研究確定了猴頭菌在以大果山楂汁為主要原料進(jìn)行發(fā)酵的工藝條件參數(shù)，為大果山楂猴頭菇發(fā)酵飲料的開發(fā)和生產(chǎn)提供重要的研究基礎(chǔ)。