木糖濃度及補料發(fā)酵對樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵的影響

吳仁智，陳 東，黃 俊，陸 琦，蘆志龍，陳 英，陳小玲，黃日波*

（1.廣西科學(xué)院國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心 非糧生物質(zhì)酶解國家重點實驗室 廣西生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)化工程院廣西生物煉制重點實驗室，廣西 南寧 530007；2.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004）

木糖是自然界中第二豐富多聚糖—半纖維素的主要降解產(chǎn)物[1-2]，若能利用其轉(zhuǎn)化為燃料乙醇，意義重大。目前已知能利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的較為優(yōu)良的酵母菌種有管囊酵母（Pachysolen tannophilus）[3-4]、樹干畢赤酵母（Pichia stipits）[5]和休哈塔假絲酵母（Candida shehatae）[6-7]等。而以樹干畢赤酵母利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力最強[5，8]。為此，筆者曾以樹干畢赤酵母CICC1960作為原始菌株，通過60Co誘變，選育出一株較為優(yōu)良的突變菌株1K-9[9]。而為實現(xiàn)菌株高濃度酒精發(fā)酵，需進行高濃度糖（底物）發(fā)酵。實際上，在酵母酒精發(fā)酵過程中，底物濃度會對酵母發(fā)酵的結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。若底物濃度過低，則會被酵母細胞迅速耗盡，底物供應(yīng)的不足會造成酵母細胞過早地從指數(shù)生長期向平衡期轉(zhuǎn)變，發(fā)酵提前結(jié)束，乙醇濃度不高；反之，高濃度底物帶來高滲透壓，產(chǎn)生底物抑制作用，從而影響酵母細胞生長，生物量不足，影響發(fā)酵的進行，造成乙醇產(chǎn)量也不高。

補料發(fā)酵（fedbatchfermentation）對于解決底物不足以及實現(xiàn)高濃度酒精發(fā)酵等均具有重要的意義。其一般先在一定濃度的底物下進行發(fā)酵，經(jīng)過一定時期，消耗了一部分底物后，再補加一定濃度的底物繼續(xù)進行發(fā)酵，最終獲得高濃度的目標產(chǎn)物。1987年補料發(fā)酵就應(yīng)用在支鏈淀粉（pullulan）生產(chǎn)上，能解決高濃度底物對細胞生長的問題從而提高支鏈淀粉的產(chǎn)量[10]。除此之外，補料發(fā)酵已成功應(yīng)用在丙酮-丁醇-乙醇發(fā)酵[11]、纖維素酶[12]、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶[13]、木糖醇[14]、2,3-丁二醇[15]等的生產(chǎn)。不論是實驗室規(guī)模[16]，還是工業(yè)化生產(chǎn)[17]，采用補料發(fā)酵對于酒精發(fā)酵來說，效果均較為理想。鑒于此，本實驗首先第一輪發(fā)酵分別進行不同濃度木糖對菌株1K-9乙醇發(fā)酵的影響試驗，確定出一個對此菌株生長、發(fā)酵較為理想的木糖濃度，然后第二輪進行補料發(fā)酵：采用含有上述較為理想濃度的木糖培養(yǎng)基進行酒精發(fā)酵，一段時間后進行補料發(fā)酵，考察酒精發(fā)酵的酒度等一系列參數(shù)，然后進行比較，從而確定補料發(fā)酵是否有效，即通過探究不同濃度木糖以及補料發(fā)酵對優(yōu)良菌株1K-9發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的影響，旨在提高木糖乙醇發(fā)酵水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

木糖（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：英國OXOID公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylicacid，DNS）、四水合酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、苯酚、偏重亞硫酸鈉、乙腈（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 菌種

樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）1K-9菌株：本實驗室保存，由購買自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心的Pichia stipitis CICC 1960菌株經(jīng)60Co誘變選育[9]，其醪液酒精濃度比原始菌株的提高了10.05%。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸粉木糖（yeast peptone xylose，YPX）培養(yǎng)基：木糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%，121℃滅菌20 min，自然pH，固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基：分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%木糖培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N氣相色譜儀：美國安捷倫儀器公司；ECLIPSE80i顯微鏡（熒光）：日本尼康儀器有限公司；DU800分光光度計：美國貝克曼庫爾特有限公司；320R臺式超速離心機：德國赫提馳儀器有限公司；ZWY-240搖床：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將甘油或斜面保存的菌株在實驗前接種于YPX培養(yǎng)基，30℃、180 r/min培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接2次，同條件下培養(yǎng)菌數(shù)至2×108個/mL，4 ℃條件下保存，2 d內(nèi)使用。

1.3.2 不同濃度木糖對酵母乙醇發(fā)酵的影響

活化的菌株接種至不同木糖含量（5%、10%、15%、20%、25%、30%）的發(fā)酵培養(yǎng)基，初始菌數(shù)2×108個/mL，裝液量100mL/250mL，30℃、130r/min進行乙醇發(fā)酵，定時取樣檢測乙醇含量、殘留木糖含量、菌數(shù)等指標。

1.3.3 補料發(fā)酵

同1.3.2，但先采用10%木糖培養(yǎng)基進行木糖乙醇發(fā)酵：裝液量50 mL/250 mL，30℃、130 r/min發(fā)酵36 h時補加等體積20%木糖培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，定時取樣檢測乙醇含量、殘留木糖含量、菌數(shù)等指標。

1.3.4 測定方法

菌數(shù)測定：取發(fā)酵醪液，即時進行菌數(shù)測定：樣品根據(jù)情況適當稀釋，利用血球計數(shù)板計數(shù)[18]。

乙醇含量測定：用氣相色譜法測定乙醇含量，乙腈作為內(nèi)標，參照文獻[16]的方法。

木糖含量測定：取培養(yǎng)基或發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min，吸取100 μL上清或上清的稀釋液后用3,5-二硝基水楊酸法測定，具體綜合參照美國能源部的方法[19]和GHOSE T K等[20]方法進行（測定吸光值OD520nm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基木糖含量對菌株生長、乙醇產(chǎn)量及木糖利用情況的影響

酵母菌株生長需要一定的培養(yǎng)條件，當糖濃度低時，酵母細胞會快速利用完糖，而當糖濃度過高，其面臨的滲透壓會增高，會抑制酵母細胞的生長。為此，分別采用了含有不同濃度木糖的培養(yǎng)基對菌株1K-9進行生長及產(chǎn)乙醇情況的比較，目的是為了考察不同濃度木糖對菌株1K-9生長及產(chǎn)乙醇的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1a可知，當培養(yǎng)基木糖含量為5%～10%時，木糖含量的增加有利于酵母的生長，且能快速促進酵母的生長。木糖含量較低（5%）時，菌數(shù)增長比較緩慢，36 h、48 h、60 h菌數(shù)分別為（6.29±0.55）×108個/mL、（8.62±1.76）×108個/mL和（9.97±0.44）×108個/mL。隨著木糖含量的增加，能快速促進酵母的生長，采用10%木糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，36 h時菌數(shù)為（13.62±1.60）×108個/mL，且能長時間維持在高菌數(shù)狀態(tài)（36～60 h），這對于酵母酒精發(fā)酵非常有利。但當木糖含量＞10%時，會表現(xiàn)出一定的抑制作用。采用15%木糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，36 h時菌數(shù)為（11.79±3.05）×108個/mL，比10%木糖培養(yǎng)基低。當培養(yǎng)基木糖含量＞15%時，菌株增殖速度較低濃度時變緩，20%木糖培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h時菌數(shù)僅為（7.57±0.62）×108個/mL，需要培養(yǎng)至84 h時菌數(shù)才達到最大值（13.88±0.13）×108個/mL。當木糖含量＞20%時，菌株的生長明顯受到抑制，且隨著木糖含量的增高抑制更明顯，木糖含量25%和30%培養(yǎng)36h時菌數(shù)分別只有（6.77±1.43）×108個/mL和（3.21±0.10）×108個/mL。因此，最有利于高產(chǎn)菌株1K-9生長的培養(yǎng)基木糖含量為10%。

由圖1b可知，5%、10%和15%木糖培養(yǎng)基醪液的乙醇含量分別于發(fā)酵36h、48h、108h達到最大值（2.56±0.03）%vol、（4.71±0.05）%vol和（6.20±0.13）%vol。而10%木糖培養(yǎng)基相對于其他5種培養(yǎng)基，酵母最能迅速發(fā)酵生成乙醇。培養(yǎng)基木糖含量為20%時，培養(yǎng)108h醪液的乙醇含量為（4.24±0.04）%；培養(yǎng)基木糖含量為25%和30%時，發(fā)酵醪液的乙醇含量較低，最高值分別為（1.81±0.03）%和（0.79±0.07）%。

由圖1c可知，5%木糖培養(yǎng)基發(fā)酵36 h時醪液中殘留木糖為（15.72±0.23）g/L，72 h利用完木糖；10%木糖培養(yǎng)基發(fā)酵72 h時醪液中殘留木糖為（4.03±0.03）g/L，84 h利用完木糖；15%木糖培養(yǎng)基發(fā)酵108 h時醪液中殘留木糖為（4.73±0.62）g/L；而含高濃度糖的培養(yǎng)基，20%、25%、30%木糖培養(yǎng)基發(fā)酵132 h醪液中殘留木糖仍很高，分別為（48.93±1.16）g/L、（158.66±1.21）g/L和（209.47±0.43）g/L，后兩種有大量的糖殘留。利用低濃度木糖發(fā)酵，菌株能快速代謝木糖，而高濃度糖發(fā)酵，菌株受到一定的抑制造成大量的木糖殘留。酒精發(fā)酵一般要求達到一定的酒度（酒度太低，能耗高，一般采用高濃度乙醇發(fā)酵）且殘留糖含量越低越好。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基中木糖含量對菌株1K-9生長（a）、乙醇產(chǎn)量（b）及木糖利用情況（c）的影響Fig.1 Effect of xylose concentration on growth(a),ethanol production(b)and xylose utilization(c)of strain 1K-9 in fermentation medium

綜合分析可知，10%木糖濃度酵母能迅速生長且能維持高菌數(shù)的時間較長（36～60 h）、最能迅速發(fā)酵生成乙醇。因此，最有利于菌株1K-9發(fā)酵的培養(yǎng)基木糖含量為10%。

2.2 補料發(fā)酵

10%木糖培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h時酵母能迅速生長至一較高的菌數(shù)值。為此，菌株1K-9先采用10%木糖進行乙醇發(fā)酵，即菌株經(jīng)活化3次后，種子液以10%接種量、50 mL10%木糖培養(yǎng)基，發(fā)酵36 h補加等體積的20%木糖培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，整個發(fā)酵過程菌數(shù)變化、醪液乙醇產(chǎn)量和殘?zhí)呛恳妶D2。

圖2 補料發(fā)酵過程中菌株1K-9生長、乙醇產(chǎn)量及木糖利用情況Fig.2 Growth,ethanol production and xylose utilization of strain 1K-9 during fed-batch fermentation

由圖2可知，補料發(fā)酵60 h時，菌數(shù)含量達到最高值（12.62±0.27）×108個/mL，其后續(xù)的發(fā)酵菌數(shù)仍能保持較高菌數(shù)，發(fā)酵至108h時菌數(shù)也達到了（12.16±0.07）×108個/mL，較未補料發(fā)酵時有所提高；發(fā)酵108 h時醪液中殘留的木糖含量為（1.03±0.02）g/L較未補料發(fā)酵時有所降低；乙醇含量達到了6.56%vol，較未補料時提高了1.85%vol。因此，采用10%木糖培養(yǎng)基發(fā)酵36 h后立即添加20%木糖培養(yǎng)基進行補料繼續(xù)發(fā)酵，是十分有效的。

3 討論

補料發(fā)酵過程一般先采用低濃度底物進行發(fā)酵，一定時期補加相應(yīng)濃度底物繼續(xù)發(fā)酵，既能解決菌種生長的問題，又能解決底物富足進行發(fā)酵從而達到研究者們所期望的目標產(chǎn)物濃度的問題，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在發(fā)酵領(lǐng)域，并成功實現(xiàn)了諸多發(fā)酵產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)。不論是實驗室規(guī)模[16]，還是工業(yè)化生產(chǎn)[17]，采用補料發(fā)酵對于酒精發(fā)酵來說，效果均較為理想。曾開展了糖蜜乙醇發(fā)酵，先采用20°Bx糖蜜培養(yǎng)酵母菌數(shù)至2×108個/mL后，補加等體積高糖度糖蜜（55 °Bx）繼續(xù)發(fā)酵[16]，效果顯著。此外，甘蔗糖蜜酒精高產(chǎn)酵母菌株MF1001實行高濃發(fā)酵生產(chǎn)試驗也是類似的方法，采用低濃度罐發(fā)酵待菌數(shù)繁殖至一定濃度（一般是2×108個/mL左右）后，再混合高濃度罐發(fā)酵，也就是低高濃度糖蜜罐混合發(fā)酵[17]。

4 結(jié)論

菌株1K-9先采用10%木糖培養(yǎng)基進行乙醇發(fā)酵，36h補加等體積的20%木糖培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵至108 h時菌數(shù)達到了（12.16±0.07）×108個/mL，較未補料發(fā)酵時有所提高；發(fā)酵108h時醪液中殘留的木糖含量為（1.03±0.02）g/L，較未補料發(fā)酵時有所降低；乙醇含量達到了6.56%vol，較未補料時提高了1.85%vol。為此，補料發(fā)酵是有效的。