堿法破壁-酶法提取葡萄酒廢酵母細(xì)胞壁多糖的工藝研究

石豪磊，趙國(guó)正，孔祥君，欒俊家，孔國(guó)光，牌延惠，張麗君，許維娜，2*

（1.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（葡萄酒學(xué)院），山東 煙臺(tái) 264003；2.煙臺(tái)張?jiān)＜瘓F(tuán)有限公司 山東省葡萄酒微生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264001；3.煙臺(tái)邁百瑞國(guó)際生物醫(yī)藥有限公司，山東 煙臺(tái) 264006）

酵母泥作為葡萄酒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物之一，含量約占葡萄酒產(chǎn)量的4%～5%[1-2]，近幾年我國(guó)葡萄酒年產(chǎn)量均在10億L以上，隨之生成的廢酵母泥極為豐富。葡萄酒廢酵母中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、核酸、維生素、礦物質(zhì)等成分，在食品、醫(yī)藥、化工、飼料等工業(yè)應(yīng)用普遍[3-6]。對(duì)葡萄酒酵母泥進(jìn)行開發(fā)利用，不僅有利于企業(yè)提高經(jīng)濟(jì)效益，而且能防止環(huán)境污染，具有明顯的生態(tài)效益。

葡萄酒廢酵母細(xì)胞壁中含有豐富的多糖類物質(zhì)，約占細(xì)胞干質(zhì)量的25%～40%，主要成分是葡聚糖和甘露聚糖[2，7]。細(xì)胞壁多糖具有較高的生物性能，在人體的消化道中可作為膳食纖維發(fā)揮作用，并具有免疫調(diào)節(jié)、提高巨噬細(xì)胞活性、抗癌、抑制有害菌生長(zhǎng)、促進(jìn)有益菌繁殖等功能，加上酵母細(xì)胞壁多糖天然、安全、可靠，已作為抗生素替代品成為新的開發(fā)熱點(diǎn)[8-11]。

目前啤酒廢酵母的綜合利用研究較多[12-13]，葡萄酒廢酵母相關(guān)研究較少[14]。酵母多糖常用的提取技術(shù)有超聲波輔助提取法[15]、微波輔助提取法[16]、堿溶法[17]、酶法[18]、自溶法[19-20]等，其中超聲波輔助提取法和微波輔助提取法提取時(shí)間短，但其設(shè)備成本和能耗較高；堿溶法操作簡(jiǎn)單、成本低，但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、提取率低，且會(huì)造成一定的環(huán)境污染；酶法具有反應(yīng)條件溫和、選擇性強(qiáng)、設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)，但提取成本相對(duì)較高；自溶法成本低，但具有工藝過(guò)程復(fù)雜、提取率低等缺陷。

本研究以葡萄酒工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)生的廢酵母泥為材料，過(guò)篩法除去葡萄果皮、果籽等雜質(zhì)后，進(jìn)行堿（KOH）法細(xì)胞破壁和酶法提取細(xì)胞壁多糖，以破壁液中蛋白質(zhì)含量、多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化堿法破壁及酶法提取法多糖工藝條件，以期達(dá)到較高的多糖提取率，實(shí)現(xiàn)葡萄酒廢酵母的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒廢酵母泥：瑞楓奧賽斯（煙臺(tái)）葡萄酒莊園有限公司；KOH（分析純）、濃硫酸（分析純）、苯酚（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（純度≥98%）、木瓜蛋白酶（1000U/mg）、堿性蛋白酶（200U/mg）、中性蛋白酶（500U/mg）、蝸牛酶（破壁率＞90%）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KS50R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；DC-01低溫恒溫水浴鍋：北京市華瑞科學(xué)器材有限公司；KQ-500DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；G6860型紫外分光光度計(jì)：美國(guó)安捷倫科技公司；Milli-Q AdvantageA10超純水系統(tǒng)：默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 廢酵母泥過(guò)篩處理

將葡萄酒酵母泥與蒸餾水按照料液比1∶1（g∶mL）混合均勻，平分為A、B、C、D四個(gè)樣品，分別過(guò)60、80、100、120目篩進(jìn)行除雜篩分，葡萄果皮、果籽等雜質(zhì)被篩網(wǎng)截留，酵母通過(guò)篩網(wǎng)后收集。以酵母泥的得率（OD600nm值）與過(guò)濾時(shí)間為考察指標(biāo)，篩選合適的篩目。過(guò)篩處理連續(xù)進(jìn)行2次，過(guò)篩酵母進(jìn)行離心（4 000 r/min、20 min）處理。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：酵母泥下層沉淀為白色，上層液體無(wú)色透明，除雜后的酵母泥105℃烘干至恒質(zhì)量。

1.3.2 堿法破壁處理

堿法進(jìn)行酵母細(xì)胞破壁時(shí)，選用超聲波法進(jìn)行輔助，超聲頻率采用80 kHz，功率500 W[2]。選擇KOH[17]質(zhì)量濃度（40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L）、堿處理溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）、堿處理時(shí)間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h）三個(gè)因素為變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，破壁液離心（13 000 r/min、20 min）后取上清，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定粗蛋白含量，考察各因素對(duì)廢酵母破壁效率的影響。

堿法破壁工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)的3個(gè)主要影響因素為：堿處理溫度（A）、堿質(zhì)量濃度（B）、堿處理時(shí)間（C），依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以破壁上清液中蛋白質(zhì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)衡量破壁效果，通過(guò)正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化破壁工藝條件。

1.3.3 酶法提取細(xì)胞壁多糖

破壁酵母液進(jìn)行離心，沉淀按料水比1∶5（g∶mL）加磷酸鹽緩沖液，分別對(duì)生物酶種類（木瓜蛋白酶、蝸牛酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶）、加酶量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、酶解溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）、酶解時(shí)間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h）和酶解初始pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。用苯酚-硫酸比色法[14]測(cè)定酶解液中的多糖含量，考察各影響因素對(duì)多糖提取效率的影響。

酶解法提取細(xì)胞壁多糖正交試驗(yàn)的4個(gè)主要影響因素為：酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）、酶添加量（C）及酶解初始pH值（D），依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果每個(gè)因素選取3個(gè)水平，通過(guò)正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化提取工藝條件，以獲得較高的多糖提取率。

1.3.4 分析檢測(cè)

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法；多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸比色法[14]，多糖提取率計(jì)算公式如下：

式中：C為上清液中多糖質(zhì)量濃度，mg/L；V為上清液的總體積，L；m為酵母泥干質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 廢酵母泥過(guò)篩處理

由表1可知，從時(shí)間角度考慮，60目篩兩次過(guò)篩時(shí)間分別為10 s、10 s，用時(shí)最短；從酵母得率角度考慮，80目篩過(guò)篩后酵母得率最高，OD600nm為4.247?？紤]到60目篩和80目篩的處理時(shí)間差別不大，選取80目篩為過(guò)篩除雜的最適目數(shù)。

表1 葡萄酒廢酵母的預(yù)處理?xiàng)l件與結(jié)果Table 1 Pretreatment conditions and results of spent yeast of wine

2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由圖1可知，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.0061x+0.0200；相關(guān)系數(shù)R2=0.999，表明二者線性關(guān)系良好。

圖1 牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

2.3 破壁工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 堿質(zhì)量濃度對(duì)廢酵母破壁的影響

由圖2可知，在堿處理溫度為60℃，處理時(shí)間為0.5h時(shí)，隨著堿質(zhì)量濃度在40～70 g/L范圍內(nèi)的增加，蛋白質(zhì)含量由76.86 mg/L提高到148.05 mg/L，即廢酵母破壁效率不斷提高；當(dāng)堿質(zhì)量濃度為70 g/L時(shí)，蛋白質(zhì)含量最高，破壁效率最好；當(dāng)堿質(zhì)量濃度＞70 g/L之后，廢酵母破壁效率快速下降。因此，最佳堿（KOH）質(zhì)量濃度為70 g/L。

圖2 堿質(zhì)量濃度對(duì)廢酵母破壁的影響Fig.2 Effects of alkali concentration on cell wall-breaking of spent yeast

2.3.2 堿處理溫度對(duì)廢酵母破壁的影響

由圖3可知，在堿質(zhì)量濃度為70 g/L，處理時(shí)間為0.5 h時(shí)，隨著堿處理溫度由30～60℃范圍內(nèi)的升高，蛋白質(zhì)含量由52.86 mg/L提高到78.09 mg/L，即廢酵母的破壁效率不斷提高，堿處理溫度為60℃時(shí)，蛋白質(zhì)含量最高，破壁效率最好；堿處理溫度＞60℃之后，蛋白質(zhì)含量略有下降。因此，最佳堿處理溫度為60℃。

圖3 堿處理溫度對(duì)廢酵母破壁的影響Fig.3 Effects of treatment temperature of alkali on cell wall-breaking of spent yeast

2.3.3 堿處理時(shí)間對(duì)廢酵母破壁的影響

由圖4可知，在堿液質(zhì)量濃度為70 g/L，堿處理溫度為60℃時(shí)，堿處理時(shí)間在0.5～1.0 h范圍內(nèi)的升高，蛋白質(zhì)含量由77.28 mg/L提高到91.24 mg/L，即廢酵母破壁效率有較大提高，堿處理時(shí)間為1.0 h時(shí)，蛋白質(zhì)含量最高。堿處理時(shí)間＞1.0 h后，蛋白質(zhì)含量略有下降，酵母破壁效率基本穩(wěn)定。因此，最佳堿處理時(shí)間為1.0h。

圖4 堿處理時(shí)間對(duì)廢酵母破壁效率的影響Fig.4 Effect of treatment time of alkali on cell wall-breaking of spent yeast

2.4 堿法破壁工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取堿處理溫度（A）、堿質(zhì)量濃度（B）、堿處理時(shí)間（C）3個(gè)影響因素，以破壁上清液中蛋白質(zhì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化破壁工藝條件，結(jié)果與分析見表2。由表2可知，3個(gè)因素對(duì)破壁效率的影響由大到小排序?yàn)閴A質(zhì)量濃度＞處理溫度＞處理時(shí)間。最佳破壁工藝條件組合為A2B2C3，即堿處理溫度60℃，堿液質(zhì)量濃度70 g/L，破壁時(shí)間1.5 h。在此最佳破壁工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的蛋白質(zhì)含量為163.21 mg/L。

表2 廢酵母破壁工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for technology optimization of cell wall-breaking of spent yeast

2.5 多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。由圖5可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.0274x+0.0013；相關(guān)系數(shù)R2=0.998，表明二者線性關(guān)系良好。

圖5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of glucose

2.6 酶法提取細(xì)胞壁多糖工藝優(yōu)化

2.6.1 酶種類對(duì)多糖提取率的影響

由圖6可知，在酶添加量為0.2%，pH值為6.0，溫度50℃，酶解時(shí)間1.0 h的條件下，采用中性蛋白酶的多糖提取率最高，為19.56%。因此，確定最適酶為中性蛋白酶。

圖6 酶的種類對(duì)酵母多糖提取率的影響Fig.6 Effect of enzyme types on extraction rate of yeast polysaccharides

2.6.2 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由圖7可知，在酶添加量為0.2%，pH值為6.0，酶解溫度為50℃的條件下，酶解時(shí)間在0.5～1.5 h范圍內(nèi)，多糖提取率由12.52%逐漸增加到19.69%；酶解時(shí)間為1.5 h時(shí)，達(dá)到最高多糖提取率；酶解時(shí)間＞1.5 h之后，多糖提取率有所下降。因此，最佳酶解時(shí)間為1.5 h。

圖7 中性蛋白酶的酶解時(shí)間對(duì)酵母多糖提取率的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis time of neutral protease on extraction rate of yeast polysaccharides

2.6.3 酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響

由圖8可知，在酶添加量為0.2%，pH值為6.0，酶解時(shí)間為1.0 h的條件下，酶解溫度在30～50℃范圍內(nèi)，多糖提取率由13.51%增加到19.53%；酶解溫度為50℃時(shí)，多糖提取率最高；酶解溫度＞50℃之后，多糖提取率有所下降。因此，最佳酶解溫度為50℃。

圖8 中性蛋白酶的酶解溫度對(duì)酵母多糖提取率的影響Fig.8 Effect of enzymatic hydrolysis temperature of neutral protease on extraction rate of yeast polysaccharides

2.6.4 酶添加量對(duì)多糖提取率的影響

由圖9可知，在酶處理pH為6.0，酶解時(shí)間1.0 h，酶處理溫度50℃的條件下，酶添加量在0.1%～0.3%范圍內(nèi)，多糖提取率由16.75%增加到20.16%；酶添加量為0.3%時(shí)，多糖提取率最高；酶添加量＞0.3%之后，多糖提取率有所下降。因此，最佳酶添加量為0.3%。

圖9 中性蛋白酶添加量對(duì)酵母多糖提取率的影響Fig.9 Effect of neutral protease addition on extraction rate of yeast polysaccharides

2.6.5 初始pH值對(duì)多糖提取率的影響

由圖10可知，在酶添加量為0.2%，酶處理溫度為50℃，酶處理時(shí)間為1.0 h的條件下，初始pH值在4.0～6.0范圍內(nèi)，多糖提取率由13.35%增加到19.15%；初始pH值為6.0時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大；初始pH值＞6.0之后，多糖提取率有所下降。因此，最佳酶解初始pH值為6.0。

圖10 中性蛋白酶的酶解pH對(duì)酵母多糖提取率的影響Fig.10 Effect of enzymatic hydrolysis pH of neutral protease on extraction rate of yeast polysaccharides

2.7 酶法提取細(xì)胞壁多糖工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）、酶添加量（C）及酶解初始pH值（D）4個(gè)影響因素，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化多糖提取工藝條件，結(jié)果與分析見表3。

表3 酶法提取多糖工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for enzyme extraction technology optimization of polysaccharides

由表3可知，4個(gè)影響因素對(duì)多糖提取率的影響由高到低順序?yàn)槊附鉁囟龋久柑砑恿浚久附鈖H值＞酶解時(shí)間。最佳多糖提取工藝條件組合為A2B2C2D3，即酶解溫度50℃，酶解時(shí)間1.5 h，酶添加量0.3%，初始pH值7.0。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的多糖提取率為21.08%。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)除雜條件、超聲輔助-堿法破壁-酶法提取細(xì)胞壁多糖的工藝進(jìn)行探索，確定的最佳破壁工藝條件為：80目篩過(guò)篩除雜；細(xì)胞破壁采用70 g/L KOH，60℃下處理1.5 h，80 kHz超聲輔助；酶法提取多糖選用中性蛋白酶，最佳提取工藝條件為酶添加量0.3%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間1.5 h，初始pH值為7.0；酵母細(xì)胞壁多糖提取率可達(dá)21.08%。研究結(jié)果證明，超聲輔助-堿-酶復(fù)合方法用于酵母細(xì)胞破壁和細(xì)胞壁多糖提取時(shí)，多糖得率較單一方法更高，工業(yè)化前景更廣闊。本研究結(jié)果可為葡萄酒廢酵母附加價(jià)值的開發(fā)利用提供技術(shù)參考。