胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)下胚軸組織培養(yǎng)再生體系的建立

，， ，

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010018； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081)

胡麻，即油用亞麻。5 000多年前就有栽培，作為油用、藥用和纖維用[1-2]，是我國(guó)干旱地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物[3]。胡麻的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值很高[4]，隨著生活水平的提高，胡麻已經(jīng)受到人們的重視[5]。但胡麻是高度自花授粉作物，常規(guī)育種耗時(shí)長(zhǎng)，優(yōu)良遺傳資源有限[6]，利用植物組培技術(shù)建立高效再生體系是基因工程技術(shù)順利實(shí)施的必要條件[7]。Link等[8]利用亞麻下胚軸在離體培養(yǎng)條件下分化出再生芽；Jordan等[9]以油用亞麻下胚軸為外植體，誘導(dǎo)獲得了愈傷組織；Nichterlein等[10]首次以亞麻花藥為外植體，誘導(dǎo)獲得了單倍體植株；苑志輝等[11]以亞麻下胚軸為外植體，誘導(dǎo)獲得了再生植株；Rutkowska-Krause等[12]以亞麻花藥為外植體，誘導(dǎo)獲得了再生植株；王玉富等研究表明，亞麻下胚軸可作為再生體系的外植體[13]。本試驗(yàn)以胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)下胚軸為外植體,研究不同植物激素的配比對(duì)胡麻植株再生的影響，旨在建立胡麻植株再生體系，為基因工程技術(shù)及新品種培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田收獲的胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)種子。

1.2 方 法

1.2.1 種子消毒及初代培養(yǎng)獲取無(wú)菌苗

以胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)種子作為試驗(yàn)材料，用自來(lái)水洗3 min，再用無(wú)菌水洗3次，然后在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇分別消毒1，3 min，無(wú)菌水洗3次，再用1 g/L的HgCl2分別處理0，3，6，9 min，無(wú)菌水洗6次，備用。將經(jīng)不同消毒處理的種子90粒接種到MS培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基接6個(gè)，15次重復(fù)。15 d后統(tǒng)計(jì)污染率和發(fā)芽率，研究不同消毒方法對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)種子消毒的影響。

污染率(%)=(污染的培養(yǎng)基數(shù)/總培養(yǎng)基數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(無(wú)菌苗數(shù)/接種種子個(gè)數(shù))×100%。

1.2.2 IAA和6-BA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選健壯的無(wú)菌苗，取其下胚軸切成0.5 cm左右為外植體，以MS(30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH=5.8)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度6-BA(1.0，2.0，3.0 mg/L)與IAA(0.25，0.50，1.00 mg/L)，將二者進(jìn)行正交試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)，共設(shè)置1) MS+1.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IAA，2) MS+1.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L IAA，3) MS+1.0 mg/L 6-BA+1.00 mg/L IAA，4) MS+2.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IAA，5) MS+2.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L IAA，6) MS+2.0 mg/L 6-BA+1.00 mg/L IAA，7) MS+3.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IAA，8) MS+3.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L IAA，9) MS+3.0 mg/L 6-BA+1.00 mg/L IAA 9種培養(yǎng)基處理組合，每種培養(yǎng)基每瓶接6個(gè)，重復(fù)10次。15 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況。

出愈率(%)=(愈傷組織數(shù)/無(wú)菌苗株數(shù))×100%。

1.2.3 IAA和6-BA對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)速率的影響

選生長(zhǎng)良好的愈傷組織切成小塊(質(zhì)量可以忽略不計(jì))接種到1.2.2項(xiàng)下的9種培養(yǎng)基上，每瓶接6塊，重復(fù)10次。分別在10，15，20 d時(shí)，取12塊愈傷組織在分析天平上稱重，研究愈傷組織生長(zhǎng)速率情況。

生長(zhǎng)速率(%)=(后1次重量-前1次重量)/2次稱量所差天數(shù)×100%。

1.2.4 IAA和6-BA對(duì)不定芽分化及增殖的影響

選生長(zhǎng)良好的愈傷組織為材料，MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度6-BA(1.0，1.5，2 mg/L)與IAA(0.2，0.5，1.0 mg/L)，將二者進(jìn)行正交試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)，共設(shè)置：1) MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA，2) MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA，3) MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA，4) MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA，5) MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA，6) MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA，7) MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA，8) MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA，9) MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA 9種培養(yǎng)基組合，每種每瓶接6塊，重復(fù)10次。30 d后觀察不定芽分化及增殖情況；再將生長(zhǎng)良好的不定芽，接種到以上分化出不定芽的4組培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽增殖情況。

分化率(%)=(叢生芽數(shù)/愈傷組織數(shù))×100%；

增殖系數(shù)=(不定芽數(shù)-起始不定芽數(shù))/起始不定芽數(shù)。

1.2.5 IAA和6-BA對(duì)不定芽生根的影響

將生長(zhǎng)較好，長(zhǎng)勢(shì)一致的不定芽接種到以下5種生根培養(yǎng)基中：1) 1/2 MS+0.01 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IAA；2) 1/2 MS+0.01 mg/L 6-BA+0.50 mg/L IAA；3) 1/2 MS+0.01 mg/L 6-BA+0.75 mg/L IAA；4) 1/2 MS+0.01 mg/L 6-BA+1.00 mg/L IAA；5) 1/2 MS+0.005 mg/L 6-BA+0.50 mg/L IAA。30 d后統(tǒng)計(jì)生根率及根生長(zhǎng)情況。

生根率(100%)=(生根的組培苗數(shù)/接種組培苗數(shù))×100%。

1.3 培養(yǎng)條件

1.3.1 無(wú)菌苗及愈傷組織的誘導(dǎo)條件

溫度(23±2)℃，光照強(qiáng)度為0。

1.3.2 不定芽分化及生根條件

溫度(23±2)℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光周期為光照16 h/黑暗8 h。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)種子消毒效果的比較

表1表明，用濃度為1 g/L的HgCl2溶液對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)的種子消毒具有重要的作用，隨著HgCl2消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率顯著降低，但發(fā)芽率也顯著下降。用75%乙醇分別處理1 min和3 min時(shí)，再用1 g/L的HgCl2消毒3 min的處理發(fā)芽率均最高，分別為92.2%和97.8%，但用75%乙醇消毒3 min處理的發(fā)芽率顯著高于1 min處理，且1 min處理有明顯的污染現(xiàn)象。結(jié)果表明，對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)進(jìn)行種子消毒，以75%乙醇處理3 min，再用1 g/L的HgCl2處理3 min效果最好。

表1 不同處理時(shí)間對(duì)內(nèi)亞7號(hào)胡麻種子消毒效果

處理處理種子數(shù)75%乙醇消毒時(shí)間(min)1g/LHgCl2的消毒時(shí)間(min)發(fā)芽率(%)污染率(%)1901054.4f100a2901392.2b33.3b3901686.7c16.7c4901974.4e05903397.8a06903682.2d07903973.3e0

注：不同小寫字母表示在p<0.05水平上差異顯著。下同。

2.2 IAA及6-BA配比對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表2表明，9種不同激素配比的培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷誘導(dǎo)率和最早出愈時(shí)間有差異。在培養(yǎng)基7中外植體的出愈率最高，為98.48%，但與培養(yǎng)基1、3、4的愈傷組織誘導(dǎo)率差異不顯著，出愈最早均為4 d。結(jié)果表明，不同濃度6-BA對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率和出愈時(shí)間影響不顯著，而不同濃度IAA的影響顯著。本試驗(yàn)以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IAA培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率及出愈時(shí)間為最佳。

2.3 IAA及6-BA配比對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)愈傷組織生長(zhǎng)速率的影響

圖1表明，在不同激素質(zhì)量濃度配比下胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)愈傷組織生長(zhǎng)速率有差異。培養(yǎng)基7在10 d和20 d愈傷組織的生長(zhǎng)速率均為最大，分別為9.23%和42.3%，且均與其他培養(yǎng)基差異顯著。在15 d時(shí)，培養(yǎng)基2的生長(zhǎng)速率最大，為21.02%，但與培養(yǎng)基7差異不顯著。由此表明，MS+3.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IAA培養(yǎng)基(培養(yǎng)基7)是胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)愈傷組織生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基。

表2 不同激素質(zhì)量濃度配比對(duì)內(nèi)亞7號(hào)胡麻愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(mg/L)6-BAIAA愈傷誘導(dǎo)率(%)最早出愈時(shí)間(d)110.2598.24a4210.5096.36b4311.0098.11a4420.2598.15a4520.5012.16f9621.0091.80c5730.2598.48a4830.5088.89d5931.0035.90e6

圖1 不同激素質(zhì)量濃度配比對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)愈傷組織生長(zhǎng)速率的影響

2.4 IAA及6-BA配比對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)不定芽分化及增殖的影響

表3表明，在9種不同配方的培養(yǎng)基中，只有4、5、7號(hào)和8號(hào)培養(yǎng)基中有不定芽分化，且分化率和增殖系數(shù)有差異。其它培養(yǎng)基無(wú)不定芽分化，其中包括IAA為1.0 mg/L的3個(gè)培養(yǎng)基。在8號(hào)培養(yǎng)基中，不定芽分化率和增殖系數(shù)均最大，分別為95.00%和7.67，且與其它培養(yǎng)基有顯著性差異。由此可見(jiàn)，MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA培養(yǎng)基是胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)不定芽分化及增殖的最佳培養(yǎng)基。

2.5 IAA及6-BA配比對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)不定芽生根的影響

圖2、圖3表明，培養(yǎng)基3中，不定芽誘導(dǎo)生根率和平均根長(zhǎng)均最大，分別為52.26%和4.98 cm，均顯著高于其它培養(yǎng)基?？梢?jiàn)，1/2 MS+0.01 mg/L 6-BA+0.75 mg/L IAA培養(yǎng)基是胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)最佳生根培養(yǎng)基。

表3 不同激素質(zhì)量濃度配比對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)不定芽誘導(dǎo)及增殖的影響

培養(yǎng)基植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(mg/L)6-BAIAA不定芽分化率(%)最早分化時(shí)間(d)增殖系數(shù)11.00.20——21.00.50——31.01.00——41.50.216.67c120.43c51.50.558.34b103.74b61.51.00——72.00.214.29d121.08c82.00.595.00a97.67a92.01.00——

圖2 不同激素質(zhì)量濃度配比對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)不定芽生根率的影響

圖3 不同激素質(zhì)量濃度配比對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)不定芽根長(zhǎng)的影響

3 討 論

無(wú)菌苗的獲取是進(jìn)行組織培養(yǎng)的第一步，利用乙醇溶液浸泡后再經(jīng)HgCl2溶液消毒是胡麻種子消毒的一種常用方法。本研究結(jié)果表明，75%乙醇消毒是必須的；為了保證種子出苗率，應(yīng)在徹底消毒的基礎(chǔ)上盡量縮短HgCl2溶液消毒時(shí)間。

在組織培養(yǎng)中，常用的植物激素有IAA、NAA、6-BA、KT、IBA、2，4-D等[14]，不同濃度的激素配比對(duì)胡麻愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)速率、不定芽的分化及增殖、不定芽的生根均有影響。培養(yǎng)基中IAA和6-BA的配合使用及其濃度配比對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)、不定芽分化和根的誘導(dǎo)起著重要作用。因此，配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)協(xié)調(diào)植物激素間的濃度及配比，才能使植物在組織培養(yǎng)中得到相應(yīng)的預(yù)期效果。

本試驗(yàn)條件下，愈傷組織的生長(zhǎng)速率在6-BA的濃度保持一定時(shí)，隨著IAA濃度的增加呈下降趨勢(shì)，而在IAA濃度保持一定時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)速率隨6-BA濃度增加呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。當(dāng)IAA濃度為0.25 mg/L時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)速率隨6-BA濃度的增加呈先降后升的變化趨勢(shì)(圖1)，而當(dāng)IAA濃度為0.5 mg/L和1 mg/L時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)速率則隨著6-BA濃度的增加呈下降趨勢(shì)，且當(dāng)IAA濃度為1.0 mg/L時(shí),不定芽的分化率均為0(表3)，由此說(shuō)明，高濃度的IAA對(duì)不定芽的分化具有強(qiáng)烈的抑制作用。

不同基因型胡麻愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽的生根所需的激素配比有所差異，愈傷組織誘導(dǎo)率也不盡相同。苑志輝等以7309優(yōu)良品種進(jìn)行研究，結(jié)果表明，下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)92.3%，生根率在改良后的培養(yǎng)基中達(dá)90%[11]；趙瑋等對(duì)隴亞10號(hào)胡麻品種進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%，但生根率僅有3.5%[15]；孫上峰等以04-94-S-266油用亞麻品種進(jìn)行研究，結(jié)果顯示愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為72%，再生植株的誘導(dǎo)率最高為 48.6%[16]。本試驗(yàn)對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)下胚軸進(jìn)行組織培養(yǎng)，其愈傷組織誘導(dǎo)率最高為98.48%，生根率最高為52.26%。但本試驗(yàn)未能得到移栽成活苗，主要是因?yàn)橛鷤M織的存在阻斷了根基與再生植株之間的聯(lián)系,使再生植株不能直接從根部吸收營(yíng)養(yǎng)成分[15]。因此，誘導(dǎo)芽的生根培養(yǎng)仍然需要進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)下胚軸進(jìn)行組織培養(yǎng)，探討了不同消毒方法對(duì)種子消毒及不同濃度的激素配比對(duì)愈傷組織、不定芽以及根誘導(dǎo)的影響，從中篩選出最佳組織培養(yǎng)條件，建立了胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)下胚軸組織培養(yǎng)體系，為基因工程技術(shù)及新品種培育奠定了良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)種子消毒的最佳方法是用75%乙醇處理3 min，再用1 g/L的HgCl2溶液處理3 min，其效果最好。胡麻品種內(nèi)亞7號(hào)，誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS+3.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IAA，其下胚軸出愈率為98.48%，最早出愈時(shí)間為4 d；愈傷組織生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IAA；不定芽分化和增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA，其不定芽分化率為95%，最早分化時(shí)間為9 d，不定芽增殖系數(shù)為7.67；不定芽生根的最佳培養(yǎng)基為MS+0.01 mg/L 6-BA+0.75 mg/L IAA，其不定芽平均生根率為52.26%，平均根長(zhǎng)為4.98 cm。