普通小麥貴紫麥1號染色體的FISH核型分析

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( 1.貴州大學農(nóng)學院，貴陽 550025； 2.國家小麥改良中心貴州分中心，貴州 貴陽 550025)

小麥在糧食作物中有著舉足輕重的地位，無論是栽培面積還是經(jīng)濟效益都不亞于水稻和玉米。中國是最早種植小麥的國家之一。普通小麥(Triticumaestivum，2 n=42)是異源六倍體，屬于禾本科(Triticeas)小麥族(Triticeas)小麥屬(Triticum)。研究認為，普通六倍體小麥的進化至少歷經(jīng)了兩次遠緣雜交與一次異源多倍體化，A基因組供體烏拉爾圖小麥(T.Urartu，2 n=14)與B基因組供體擬斯卑爾托山羊草(Ae.Speltodies，2 n=14)雜交形成二粒小麥(T.turgidum，2 n=28)，歷經(jīng)多年進化，又與D基因組供體粗山羊草(Ae.Tauschii，2 n=14)雜交，形成六倍體小麥并最終演變成普通小麥(AABBDD)[1-3]。多年來，在小麥的進化過程中，隨著不斷的雜交，自然及人工選擇，發(fā)生大量有利性狀的控制基因丟失，或受環(huán)境條件的影響使得原有的基因失效(如質(zhì)量、產(chǎn)量、抗病性、抗逆性等)，造成了普通小麥在這些方面的缺陷[4]。迫于如此情形下，選育產(chǎn)量高、品質(zhì)好、株型合適及抗性良好的新品種在小麥育種工作中已經(jīng)顯得刻不容緩。近些年，采用遠緣雜交、細胞工程育種、分子標記、基因克隆以及染色體工程等方法將不同種屬中含有的有利基因?qū)胫疗胀ㄐ←溁蚪M中，已成功育成諸多具備高產(chǎn)潛力、抗病、抗逆性優(yōu)良等的小麥新品種[5]。

細胞學鑒定發(fā)展至如今，無論是分帶鑒定技術(shù)還是核型分析方法，都能夠快速、有效且準確的對不同物種染色體的數(shù)目、組成與結(jié)構(gòu)進行判斷分析。采用熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)，待測染色體中的DNA與具熒光標記的探針(特異寡聚核苷酸片段)結(jié)合，從而檢測DNA序列在染色體上的位置。近年來，DNA重復(fù)序列被廣泛用于未知染色體鑒別、物種起源與進化及指紋圖譜構(gòu)建等，還能對遺傳物質(zhì)來源進行追溯鑒定。Pedersen等[6]利用來自節(jié)節(jié)麥的pAs 1探針及來自大麥且含有(GAA)8重復(fù)序列的pHvG 38探針有效鑒別了中國春3個基因組染色體。Cuadrado A等[7]利用5個高度重復(fù)序列pTa 71、pTa 794、pSc 34、pSc 74和pSc 119.2 探針對黑麥進行多次FISH分析，成功鑒別了A、B及R基因組染色體。Mukai等[8]利用pSc 119.2 及pAs 1 兩個重復(fù)序列探針，不僅有效鑒別并建立中國春的B、D基因組清晰的FISH核型，還成功識別其A基因組的1 A、4 A、5 A染色體。Tang等[9]利用重復(fù)序列pAs 1、pTa-535以及pSc 119.2為熒光標記探針，建立了普通小麥中國春3種基因組染色體FISH核型。本研究擬采用pAs 1與pSc 119.2-1 2種不同顏色的重復(fù)序列探針開展貴紫麥1號熒光原位雜交分析，構(gòu)建其FISH核型，明確各染色體對的信號分布特點，為該品種在小麥育種工程中的運用及后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為貴紫麥1號，由3個不同種屬材料節(jié)節(jié)麥/偏凸山羊草/硬粒小麥歷經(jīng)多年多代雜交而來，是貴州大學農(nóng)學院國家小麥改良中心貴州分中心自主創(chuàng)制的一個特色紫粒小麥品種(審定編號：黔審麥2015003號)。貴紫麥1號抗性優(yōu)良(抗病、抗逆、耐貧瘠等)、產(chǎn)量高、品質(zhì)好，其紫色籽粒含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，種皮還富含能預(yù)防人類癌癥及心腦血管病的花青苷黃酮類化合物。

1.2 染色體制片

選取10～20粒飽滿種子，常溫下用雙蒸水浸泡4～6 h，用鑷子取種子均勻擺放在鋪有干凈濕潤濾紙的塑料培養(yǎng)皿上25 ℃進行發(fā)芽，每天用雙蒸水進行3～5次沖洗，根長2～3 cm時，取根尖進行2 h笑氣(N2O)處理，90%冰乙酸冰上固定5 min，蒸餾水沖洗3遍，切取根尖分生區(qū)進行37 ℃纖維素酶果膠酶混合液酶解50 min，進行滴片。在顯微鏡下進行檢測，挑選含分裂相好及完整染色體數(shù)的細胞片子放置于4 ℃冰箱以備使用。

1.3 熒光原位雜交分析

FISH技術(shù)參見Han等[10]方法。選擇FISH效果好的細胞用Cellsens Standard攝像系統(tǒng)照相。為獲得準確可靠的結(jié)果，鏡檢挑選10個分裂相較好且經(jīng)熒光原位雜交后染色清晰的細胞用于構(gòu)建FISH核型圖及雜交信號分布特點分析。

2 結(jié)果與分析

該試驗利用pAs 1與pSc 119.2-1 2種具不同顏色的重復(fù)序列探針對普通小麥貴紫麥1號的根尖細胞染色體開展一次熒光原位雜交(圖1)并建立其FISH核型(圖2)。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貴紫麥1號包括21對染色體，探針pAs 1在D基因組上發(fā)現(xiàn)明顯的紅色雜交信號，在A基因組染色體上大部分存在明顯信號，在B基因組染色體上也存在微弱信號；而探針pSc 119.2-1于B基因組上發(fā)現(xiàn)明顯綠色雜交信號，于A基因組與D基因組上部分有明顯信號。結(jié)合染色體長度，及以上2種探針基本上可以對A、B基因組及D基因組完成準確辨別。

2.1 貴紫麥1號A基因組的FISH分析

貴紫麥1號的1 A染色體短臂的端部具有1對微弱的pAs 1信號。2 A染色體短臂端部具有明亮的pAs 1信號，其近著絲點處具有微弱的pAs 1信號；在長臂的端部具有1對微弱的pSc 119.2-1信號。3 A染色體短臂靠近著絲點處具有1對明亮的pAs 1信號。4 A長臂的端部具有1對微弱的pAs 1信號及1對微弱的pSc 119.2-1信號。5 A染色體長臂中間具有1對微弱的pAs 1 信號，在染色體短臂端部及靠近著絲點處各具有1對微弱的pSc 119.2-1信號。6 A染色體中有一條染色體長臂的端部發(fā)現(xiàn)非常微弱的pAs 1信號，而另一條卻未發(fā)現(xiàn)明顯的pAs 1信號，推測信號在雜交過程中丟失。7 A染色體在接近著絲點及長臂處具有若干微弱的pAs 1信號。

注：紅色為pAs 1雜交信號，綠色為pSc 119.2-1雜交信號，細胞經(jīng)DAPI染色呈藍色。下同。圖1 普通小麥貴紫麥1號染色體的熒光原位雜交圖

圖2 普通小麥(貴紫麥1號) 的A、B基因組和D基因組的FISH核型

2.2 貴紫麥1號B基因組的FISH分析

與A基因組相比，出現(xiàn)在B基因組中的pSc 119.2-1信號明顯較多且明亮。實驗結(jié)果表明，貴紫麥1號的1 B和6 B染色體含有隨體。貴紫麥1號的1 B染色體長臂末端具有1對較強的pSc 119.2-1信號，此外，其長臂中部還具有1對微弱的pSc 119.2-1信號以及1對微弱的pAs 1信號。2 B染色體長臂中部具有1對較強的pSc 119.2-1信號。3 B染色體短臂末端及長臂中間上各發(fā)現(xiàn)1對微弱的pAs 1信號，在其短臂端部還發(fā)現(xiàn)1對微弱的pSc 119.2-1信號。4 B染色體上發(fā)現(xiàn)較多且明亮的pSc 119.2-1信號，相比其它染色體來看較容易被區(qū)分出來，在其短臂末端、長臂中間與末端都顯示出了很明亮的探針pSc 119.2-1雜交信號。5 B染色體的短臂末端、中間與長臂中間處都顯示出較明亮的pSc 119.2-1雜交信號，在其短臂末端還具有1對微弱的pAs 1信號，但被同位置的pSc 119.2-1信號覆蓋。6 B染色體上2種探針信號都較為豐富，其短臂末端及接近著絲點處均具有微弱的pAs 1信號，長臂末端、中部和短臂末端都發(fā)現(xiàn)了較強的pSc 119.2-1信號。7 B染色體的兩末端均發(fā)現(xiàn)微弱的pAs 1信號，在長臂的末端、中部與短臂接近末端處也發(fā)現(xiàn)微弱的pSc 119.2-1信號。

2.3 貴紫麥1號D基因組的FISH分析

相比A基因組和B基因組，探針pAs 1在D基因組上不僅信號豐富且明亮，還可有效地對D基因組進行準確區(qū)分。貴紫麥1號在1 D染色體短臂末端以及長臂中部分別發(fā)現(xiàn)較強的pAs 1信號，其短臂末端還發(fā)現(xiàn)1個較明亮的pSc 119.2-1信號。2 D染色體的短臂末端與長臂均發(fā)現(xiàn)豐富且較強的pAs 1信號，其短臂末端還發(fā)現(xiàn)1對微弱的pSc 119.2-1信號。3 D染色體的短臂末端具有強且大的pAs 1信號，同位置還具有1個較為明亮的pSc 119.2-1信號，在其長臂端部還具有1對明亮的pAs 1信號。4 D染色體的長臂中部與接近近著絲點處均具有面積大且略為強的pAs 1信號。5 D染色體的pAs 1信號較為豐富，其長臂分布著多個明亮的pAs 1信號，在短臂末端與接近著絲點處都具有較強的pAs 1信號。6 D染色體的兩端分別具有較強較大的pAs 1信號，在長臂近著絲點處也具有明亮的pAs 1信號。7 D染色體兩端也分布著較強較大的pAs 1信號。

2.4 貴紫麥1號與硬粒小麥(AABB)的FISH核型比較分析

將貴紫麥1號與陳星灼等[11]報道的硬粒小麥的A、B組染色體的雜交信號分布特點進行比較分析。結(jié)果表明，貴紫麥1號的2 A染色體長臂端部較硬粒小麥要多出1對微弱的pSc 119.2-1信號。貴紫麥1號的5 A染色體短臂末端及長臂接近著絲點處均較硬粒小麥要多出1對微弱的pSc 119.2-1信號。硬粒小麥的2 B染色體長臂末端具有1對明亮的pSc 119.2-1信號，而貴紫麥1號在相同位置卻沒有顯示出pSc 119.2-1信號。貴紫麥1號3 B染色體的短臂末端僅有1對微弱的pSc 119.2-1信號，硬粒小麥在相同位置卻顯示出2對明亮的pSc 119.2-1信號。貴紫麥1號的5 B染色體長臂近著絲點發(fā)現(xiàn)1對微弱的pSc 119.2-1信號，而在硬粒小麥中未曾發(fā)現(xiàn)任何信號。

2.5 貴紫麥1號與節(jié)節(jié)麥(DD)的FISH核型比較分析

貴紫麥1號跟HuaKun Zhang等[12]所研究的節(jié)節(jié)麥D組染色體的FISH結(jié)果進行對比。結(jié)果表明，兩者的pAs 1信號基本相似，僅在1 D染色體上節(jié)節(jié)麥的長臂端部比貴紫麥1號多出1對明顯的pAs 1信號。兩者的pSc 119.2-1信號分布則表現(xiàn)出了部分差異，貴紫麥1號的1 D染色體的短臂末端較節(jié)節(jié)麥多出1個明亮的pSc 119.2-1信號，節(jié)節(jié)麥的4 D短臂末端與5 D短臂末端均比貴紫麥1號多出1對pSc 119.2-1 信號。

2.6 貴紫麥1號與中國春(AABBDD)的FISH核型比較分析

貴紫麥1號與Tang等[9]報道的pAs 1、pSc 119.2-1探針在中國春A、B基因組及D基因組染色體上的雜交信號基本相似，卻又存在部分雜交信號差異。發(fā)現(xiàn)貴紫麥1號的2 A染色體的長臂末端以及5 A長臂靠近著絲點位置均比中國春多具有1對pSc 119.2-1信號。貴紫麥1號的6 B染色體短臂末端較中國春多出1對pSc 119.2-1信號。貴紫麥1號的7 B染色體長臂末端發(fā)現(xiàn)1對pSc119.2-1信號，而中國春上并沒有。貴紫麥1號的1 D染色體短臂末端較中國春要多出1個pSc 119.2-1信號。

3 討 論

建立植物染色體核型在植物遠緣雜交育種中具有十分重要的意義，不僅可以對其染色體數(shù)目及形態(tài)結(jié)構(gòu)變異進行研究，還能更深一步的探尋物種起源與進化的關(guān)系[13]。Linc等[14]利用pSc 119.2與Afa family 2個mcFISH探針不僅成功辨別長穗偃麥草E基因組所有染色體，還建立了詳細FISH核型模式圖，此外還將11個中國春-偃麥草二體附加系完成明確鑒定。BADAEVA 等[15]利用pAs 1及pSc 119.2兩個重復(fù)序列作探針，成功創(chuàng)立4套單芒山羊草的FISH核型。劉成等[16]先利用多聚核苷酸探針Oligo- pTa 535-1和Oligo- pSc 119.2-1成功辨別中國春-智利大麥雙二倍體的42條染色體，再結(jié)合(GAA)8探針有效鑒別出智利大麥染色體同源群。董磊等[17]運用2個寡核苷酸探針Oligo-pTa 535及Oligo-pSc 119.2，對5份不同來源擬斯卑爾脫山羊草開展熒光原位雜交研究，成功鑒別所有染色體且構(gòu)建出各相應(yīng)材料清晰FISH核型圖；并通過比較發(fā)現(xiàn)，Oligo-pSc 119.2雜交信號在這些材料上的分布特征不僅與在小麥B基因組上的分布有顯著差異，在不同來源的斯卑爾脫山羊草材料間也表現(xiàn)出信號分布差異，說明高度重復(fù)序列Oligo-pSc 119.2探針在不同材料間表現(xiàn)出遺傳多樣性。宮文萍等[18]采用Oligo-pTa 535-1及Oligo-pSc 119.2-1兩個多聚核苷酸探針成功建立7份濟麥系列小麥的標準FISH核型圖，發(fā)現(xiàn)其信號分布特點與中國春大部分相似，但在染色體4 A、6 B、7 B和7 D上卻出現(xiàn)信號分布差異；此外還發(fā)現(xiàn)7份材料間的FISH信號變異位點相似，猜測可能是由于濟麥系列小麥的遺傳基礎(chǔ)較為狹小所導(dǎo)致。王丹蕊等[19]開發(fā)了包含pAs 1-1、pAs 1-3、AFA-4、(GAA)10和pSc 119.2-1共5個探針的寡核苷酸探針套，并利用該套探針對18份不同的中國春小麥非整倍體材料及5份親緣物種材料進行一次熒光原位雜交(FISH)，不僅成功鑒別出相應(yīng)的中國春端體、中國春缺體及中國春四體材料，還能有效識別出不同物種材料，建立了相應(yīng)材料的清晰FISH核型圖，說明該套探針在不同材料間具有多態(tài)性，為后續(xù)研究應(yīng)用提供參考。

本研究利用pAs 1與pSc 119.2-1兩個不同顏色的重復(fù)序列探針對貴紫麥1號進行1次熒光原位雜交分析，準確辨別了其全部21對染色體，并建立貴紫麥1號的清晰FISH核型圖。貴紫麥1號染色體中的pAs 1信號相對要多些，并且在部分染色體上雜交信號面積大且較強；pSc 119.2-1信號則相對要少且弱。通過對比發(fā)現(xiàn)，貴紫麥1號的FISH核型與陳星灼等[11]報道的硬粒小麥A、B基因組染色體的FISH信號分布特點、HuaKun Zhang等[12]報道的節(jié)節(jié)麥的D組染色體的FISH信號分布特點及Tang等[9]報道的pAs 1、pSc 119.2-1探針在中國春A、B基因組及D基因組各對染色體上分布的雜交信號基本相似，卻又存在部分雜交信號差異；可能是因為DNA重復(fù)序列在各個小麥材料間存在遺傳差異及多態(tài)性而顯示出的部分雜交信號差異。貴紫麥1號是從節(jié)節(jié)麥/偏凸山羊草/硬粒小麥遠緣雜交后代中自主創(chuàng)制的紫粒小麥新品種，不排除在該材料形成過程中有其他外源基因的進入，亦可能是該材料在形成過程中經(jīng)歷過幾次染色體的組成與結(jié)構(gòu)變異現(xiàn)象，由此引起了染色體重復(fù)序列的改變，表現(xiàn)出了FISH雜交信號分布的多態(tài)性[20]。通過建立貴紫麥1號的FISH核型，為該材料下一步在細胞遺傳學和分子遺傳學研究上將相關(guān)優(yōu)良性狀定位在染色體上具有重要的意義。