黑青稞根際促生菌篩選及其對種子萌發(fā)的影響

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(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院植物科學(xué)學(xué)院, 西藏 林芝 860000； 2.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院, 西藏 林芝 860000)

青稞起源于西藏，是藏族人民的主糧[1]。黑青稞含有多種有益人體健康的礦物質(zhì)如銅、鋅、鐵等，同時具有高維生素、高膳食纖維、高蛋白質(zhì)、高β-葡聚糖等特點，含有獨特的花青素類物質(zhì)，且原花青素和總黃酮含量較高，具有防癌、抗癌作用的微量元素硒，符合現(xiàn)代人所青睞的黑色健康食品的需求，同時作為西藏重要的特色資源而倍受關(guān)注[2-4]。西藏有特殊的地理位置、氣候類型和地質(zhì)歷史以及耕作習(xí)慣，從而造就了其獨特的土壤特征：N素少(全N 0.2～2 g/kg，速效N 20～80 mg/kg)，P 素缺(全P 0.22～1.42 g/kg，速效P 1～133 mg/kg)，K 素和微量元素比較豐富。這種土壤狀況制約了青稞的產(chǎn)量及質(zhì)量的提高[5-6]。雖然化學(xué)肥料的使用可以在一定程度上解決這一問題，卻使得生產(chǎn)成本增加、環(huán)境惡化。

植物根際促進菌(plant growth promoting rhizobacteria ，PGPR)可視為有益微生物，其生物種類多元，如固氮菌可減少氮肥的使用，可將空氣中的氮以nitrogenase催化銨態(tài)氮源，減少對氮肥的依賴。磷肥在使用后會流失在土壤中，大部分的磷元素與土壤中的鈣、鎂、鋁、鐵結(jié)合后呈現(xiàn)不溶形態(tài)的復(fù)合物，而PGPR中有許多物種可產(chǎn)生有機酸或離子嵌合劑，將土壤中存在的磷酸鋁、磷酸胺鎂、磷酸鈣及磷酸鐵等磷酸復(fù)合體溶解，經(jīng)由微生物轉(zhuǎn)化為有機磷，提供植物營養(yǎng)[7]。這些PGPR微生物常由健康植株中的土壤環(huán)境所篩選，并以其為原料研制而成的微生物肥料制劑在農(nóng)業(yè)中也被廣泛應(yīng)用。研究結(jié)果表明，施用微生物肥料不僅可以提高作用對象的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且還具有促進種子的萌發(fā)、提高發(fā)芽率和苗期成活率的作用[7-11]。

本試驗通過分離純化隆子縣黑青稞根際促生菌，篩選其中具有固氮、溶磷能力的菌株，發(fā)掘潛在的微生物資源，以減少青稞生產(chǎn)對化學(xué)肥料的依賴，為青稞可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材 料

1.1 供試土壤及青稞

土壤樣品采自西藏山南隆子縣青稞田，取0～20 cm土層的根系( 帶土) 樣品，保存于無菌紙袋中帶回實驗室。供試青稞種子為西藏山南隆子縣黑青稞。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

Ashby培養(yǎng)基： KH2PO40.2 g，CaCO35.0 g， MgSO4·7 H2O 0.2 g， Mannitol 10.0 g，NaCl 0.2 g，Agar 15 g，CaSO4·2 H2O 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0～7.5[12]。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0～ 7.2[12-13]。

無機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7 H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.03 g，MnSO4·4 H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25.0 g 蒸餾水1 000 mL，pH=7.0～ 7.2[14]。

蒙金娜培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7 H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.03 g，MnSO4·4 H2O 0.03 g，卵磷脂0.2 g，CaCO35.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0～ 7.5[14]。

以上培養(yǎng)基配制時均用蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌30 min，需要用固體培養(yǎng)基時，在此配方基礎(chǔ)上加20 g瓊脂。

2 方 法

2.1 黑青稞根際土壤懸液的制備

抖落黑青稞根系上較大的土壤顆粒，把根系剪切成3 cm左右的根段并混合，然后稱取10 g置于含有90 mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩，即為黑青稞根際土壤懸液，將土壤懸液10 倍梯度稀釋，制成10-7～10-1土壤稀釋液[12]。

2.2 黑青稞根際促生菌初篩

分別取10-7～10-3土壤稀釋液1 mL于滅菌后的培養(yǎng)皿中，分別傾注Ashby培養(yǎng)基、無機磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機磷培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，選取透明圈較大的單菌落進行復(fù)篩[12]。

2.3 黑青稞根際促生菌復(fù)篩

2.3.1 解磷能力

將初篩菌株接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，按照1%的接種量分別接種到液體無機磷培養(yǎng)基、蒙金娜有機磷培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，4 ℃、18 000 r/min 離心5 min，采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量[15]。

2.3.2 固氮量

將初篩菌株接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，按照1%的接種量分別接種到液體Ashby培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，采用半微量凱氏定氮法測定含氮量[16]。

2.4 黑青稞根際促生菌菌株對黑青稞種子萌發(fā)的影響

將篩選的溶磷、固氮菌的菌株分別接種到蒙金娜液體培養(yǎng)基、無機磷液體培養(yǎng)基和Ashby液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)后期或穩(wěn)定期，用無菌水稀釋至菌液濃度約為108cfu/mL，備用[17]。

表1 黑青稞PGPR固氮及有效磷含量測定結(jié)果

固氮菌氨氮(N,mg/L)解無機磷菌株有效磷含量(mg/L)解有機磷菌株有效磷含量(mg/L)HQ3-2124.31±0.72aSR9-456.37±1.49eSR6-183.87±2.22eHQ3-3116.02±1.33cSR10-651.88±1.37fSR6-2162.00±2.31bHQ3-5120.82±2.14bSR15-171.63±2.15dSR7-377.13±2.32fHQ6-3101.15±1.54fSQ15-275.75±0.76cSR10-675.75±0.76fHQ7-2105.3±1.59eLQ14-292.13±1.6bSR11-279.50±1.38efHQ7-4112.20±1.91dHQ9-151.38±0.52fSR11-380.00±0.8efN59104.30±0.60eHQ36-158.75±1.18eSR17-283.88±2.12eN63101.85±1.02fHQ36-2122.37±2.34aSR19-192.13±0.93dN72105.34±0.61eSR20-2251.38±2.43aSR22-375.75±2.27fLQ3-3129.00±2.41cLQ14-276.62±2.03f

注：同列不同小寫字母分別表示處理間在0.05水平有顯著差異。下同。

選取飽滿、均勻一致的黑青稞種子50粒，移至75%乙醇中處理30 s，無菌水清洗4～5次后，再用7%的 NaClO溶液浸泡1 min，無菌水清洗4～5次，進行種子表面消毒。將消毒的黑青稞種子分別浸入菌液中，25 ℃ 吸附1 h，于無菌操作臺上風(fēng)干后，轉(zhuǎn)置于墊有潤濕濾紙的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d。以浸泡無菌水的黑青稞種子做陰性對照，以不接菌的培養(yǎng)液做陽性對照。培養(yǎng)結(jié)束后，測量各幼苗莖長、根長，計數(shù)側(cè)根數(shù)[17]。

計算各項發(fā)芽指標(biāo)：發(fā)芽勢(%)=(前3 d發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù))×100%；發(fā)芽率(%)=(7 d發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù))×100%；發(fā)芽指數(shù)(GI)=Gt/Dt。

式中：Gt為在t天內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽時間[17]。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2016軟件和SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 黑青稞根際促生菌的初篩及復(fù)篩結(jié)果

采用傾注培養(yǎng)基法，28 ℃培養(yǎng)，初步篩選出固氮細(xì)菌20株、解無機磷細(xì)菌28株、解有機磷細(xì)菌30株，經(jīng)多次傳代，最終選取長勢較好、溶磷圈較大的固氮細(xì)菌9株、解無機磷細(xì)菌12株、解有機磷細(xì)菌8株進行復(fù)篩。

采用半微量凱氏定氮法定量測定9株固氮菌有效氮含量，結(jié)果如表1。由表1可知，菌株HQ 3-2、HQ 3-3、HQ 3-5和HQ 7-4固氮量較高，有效氮含量均達110 mg/L以上。采用鉬銻抗比色法定量測定無機磷細(xì)菌和有機磷細(xì)菌的有效磷含量(表1)，結(jié)果表明，溶解有機磷菌株SR 20-2、SR 6-2、LQ 3-3和SR 19-1產(chǎn)有效磷較高，均達到92 mg/L以上，其中菌株SR 20-2產(chǎn)磷最高，有效磷含量達251.38 mg/L。8株解無機磷細(xì)菌中有效磷含量最高的為菌株HQ 36-2，達122.37 mg/L，其次為菌株LQ 14-2，達92.13 mg/L，再次是菌株SR 15-2和SR 15-1，有效磷含量達71 mg/L以上；有效磷含量最差的是菌株SR 10-6、HQ 9-1和HQ 36-1。

3.2 黑青稞根際促生菌菌株對黑青稞種子萌發(fā)的影響

3.2.1 PGPR對黑青稞種子萌發(fā)的影響

分別選取優(yōu)良固氮菌、無機磷溶解菌、有機磷溶解菌各4株進行黑青稞種子萌發(fā)實驗(表2)。由表2可知，除菌株HQ 3-2對青稞種子發(fā)芽具有抑制作用外，其余菌株對黑青稞種子發(fā)芽均有一定的促進作用。其中菌株HQ 3-3、HQ 7-4、SR 15-2、HQ 36-2和SR 6-2處理對黑青稞種子的萌發(fā)率效果較好，發(fā)芽率分別達到97.50%、92.50%、92.50%、91.67%和90.00%，與ck相比，發(fā)芽率分別增長了36.05%、29.07%、29.07%、27.91%和25.58%(表3)。

表2 黑青稞PGPR浸種對種子萌發(fā)的影響

菌株發(fā)芽率(%)發(fā)芽勢(%)發(fā)芽指數(shù)HQ3-222.5±2.50i14.17±2.89f3.75±0.65iHQ3-397.50±2.10a83.83±1.26a21.74±0.57aHQ3-585.00±2.80de71.50±1.32cd18.61±0.58cdHQ7-492.50±4.30b80.83±3.82a20.52±1.08bSR15-184.17±1.40de71.50±1.30cd18.44±0.36cdSQ15-292.50±2.30b80.17±2.25a20.52±0.63bLQ14-286.67±2.89cd73.17±1.61bc19.07±0.72cHQ36-291.67±1.44b78.50±1.23ab20.31±0.36bSR6-290.00±1.67bc71.67±1.41cd17.15±0.43efSR19-178.33±2.89fg73.33±2.21bc16.95±0.32efSR20-273.33±2.25h63.33±1.35e16.39±0.60fgLQ3-381.67±2.43ef66.67±1.89de17.85±0.12deck71.67±5.77h63.33±1.27e13.25±1.16hck172.50±2.50h62.50±1.50e15.98±0.50gck275.00±2.10gh71.67±1.44cd18.24±0.44cdck374.17±1.40gh64.17±1.80e16.68±0.54fg

注：ck為無菌水處理，ck 1為無機磷液體培養(yǎng)基處理，ck 2 為Ashby液體培養(yǎng)基處理，ck 3為蒙金娜液體培養(yǎng)基處理。下同。

由表2可知：菌株HQ 3-3、HQ 7-4、SR 15-2和HQ 36-2的發(fā)芽勢在75%以上，表3中菌株HQ 3-3、HQ 7-4、SR 15-2和HQ 36-2的發(fā)芽勢與ck相比，分別增長了32.37%、27.63%、26.58%和23.95%。同時菌株HQ 3-3、HQ 7-4、SR 15-2和HQ 36-2發(fā)芽指數(shù)在20以上，與ck對比提高了青稞種子的活力；不接菌的培養(yǎng)液對黑青稞種子萌發(fā)也有促進作用但效果不明顯。

圖1 HQ 3-5菌液處理與ck對比

表3 不同菌株菌液處理下發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)變化量

菌株發(fā)芽率變化量(%)發(fā)芽勢變化量(%)發(fā)芽指數(shù)變化量HQ3-2-68.60-77.63-71.69HQ3-336.0532.3764.09HQ3-518.6012.8940.51HQ7-429.0727.6354.93SR15-117.4412.8939.20SQ15-229.0726.5854.93LQ14-220.9315.5343.94HQ36-227.9123.9553.35SR6-225.5813.1629.49SR19-19.3015.7927.91SR20-22.33023.70LQ3-313.955.2634.75

注：與ck對比的變化量。

3.2.2 PGPR對黑青稞幼苗的促生作用

表4 PGPR浸種對黑青稞幼苗生長的影響

菌株莖粗(mm)芽長(cm)根長(cm)須根數(shù)(個)HQ3-21.82±0.05cd7.37±0.19h3.27±0.09g5.6±0.15abHQ3-31.49±0.04h8.52±0.23f4.33±0.12d5.5±0.14bcHQ3-51.63±0.05f11.91±0.36c6.91±0.21a5.4±0.16cdHQ7-41.84±0.02c12.28±0.12b6.8±0.07a5.5±0.06bcSR15-11.56±0.04g4.10±0.11j1.77±0.05j5.6±0.15abSQ15-21.71±0.06e7.79±0.24g3.38±0.11g5.1±0.13fgLQ14-21.74±0.02e9.36±0.1e3.86±0.04e5.5±0.05bcHQ36-21.71±0.04e11.07±0.22d5.02±0.1b5.7±0.11aSR6-22.04±0.03a11.79±0.21c4.95±0.09b5.6±0.1abSR19-11.92±0.02b12.56±0.13b4.52±0.05c5.3±0.07deSR20-21.91±0.06b11.73±0.35c4.25±0.13d5.2±0.16efLQ3-31.77±0.03de13.67±0.24a3.88±0.07e4.7±0.08hck1.58±0.02fg9.66±0.1e3.65±0.04f5.3±0.09deck11.53±0.02gh7.85±0.21g3.81±0.1ef5.0±0.13gck21.39±0.04i5.18±0.13i2.05±0.06i3.9±0.11jck31.56±0.04g5.06±0.14i2.76±0.07h4.4±0.12i

由表4可知，除菌株HQ 3-2、HQ 3-3、SR 15-1、SR 15-2和LQ 14-2外，其他菌株與ck對比差異顯著(p<0.05)，對青稞幼苗芽生長有促進作用。其中LQ 3-3菌液處理的芽長最長，為13.67 cm。菌株HQ 3-5、HQ 7-4、HQ 36-2、SR 6-2、SR 19-1、SR 20-2和LQ 3-3與ck對比(如表5)，芽長增加分別為23.29%、27.12%、14.60%、22.05%、30.02%、21.43%和41.55%。菌株HQ 3-5和HQ 7-4培養(yǎng)液處理的種子根長到達6.8 cm，分別比ck根長增加89.31%、86.30%(如圖1，圖2)。菌株SR 15-1菌液的處理對芽生長有抑制作用，同時對幼苗的地下部分有明顯的抑制作用，與ck對比(如表5)芽長及根長分別下降 57.56%和 51.60%。

由表5可知，各菌株菌液處理中對黑青稞幼苗的須根數(shù)有一定的促進作用但是效果不明顯。SR 6-2、SR 19-1和SR 20-2菌液處理中莖粗比ck增加20%以上，其中SR 6-2菌液處理莖粗達到2.04 mm；不接菌的培養(yǎng)液處理對青稞幼苗的芽長、根長、莖粗及須根數(shù)有抑制作用。

表5 不同菌株菌液處理下莖粗、芽長、根長及須根數(shù)變化量

菌株莖粗變化量(%)芽長變化量(%)根長變化量(%)須根數(shù)變化量(%)HQ3-214.98-23.71-10.415.66HQ3-3-5.91-11.8018.633.84HQ3-52.9623.2989.321.89HQ7-416.4627.1286.303.84SR15-1-1.27-57.56-51.605.66SQ15-28.44-19.32-7.49-3.77LQ14-210.13-3.075.753.84HQ36-28.2314.6037.537.55SR6-229.1122.0535.625.72SR19-121.5230.0223.840SR20-221.0921.4316.44-1.89LQ3-312.0341.556.30-11.26

注：與ck對比的變化量。

4 結(jié)論與討論

1) 試驗結(jié)果表明：通過初篩和復(fù)篩，篩選出了活性較高的固氮菌、溶解無機磷細(xì)菌和溶解有機磷細(xì)菌各4株，固氮菌分別為菌株HQ 3-2、HQ 3-3、HQ 3-5和HQ 7-4，無機磷溶解細(xì)菌分別為菌株SR 20-2、SR 6-2、LQ 3-3和SR 19-1，有機磷細(xì)菌分別為菌株HQ 36-2、LQ 14-2、SR 15-2和SR 15-1。分別用以上菌株100倍菌液對黑青稞種子進行浸種處理，結(jié)果表明：不同菌株對青稞種子及幼苗的促生作用不同。菌株HQ 3-3、HQ 7-4和SR 15-2對黑青稞種子發(fā)芽促進作用顯著，與對照相比發(fā)芽率分別增長了36.05%、29.07%和29.07%；菌株SR 19-1和LQ 3-3對青稞種子芽生長有顯著的促進作用，分別較對照增加了30.02%和41.55%。菌株HQ 3-5和HQ 7-4對青稞幼苗地下部分生長有顯著的促進作用，分別較對照顯著增加了89.31%和86.30%。本試驗也篩選出了同時對青稞種子萌發(fā)及幼苗生長都有促進作用的菌株固氮菌HQ 7-4、解有機磷菌株HQ 36-2、解無機磷菌株SR 6-2和SR 19-1，為青稞微生物菌肥的研制提供了功能菌株。

圖2 HQ 7-4菌液處理與ck對比

2) 近年來，探尋新肥源 (微生物菌肥)以替代或部分替代化肥的研究越來越受到重視，而PGPR的促進植物生長，改良土壤其對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類等功能，是微生物菌肥良好的原料之一[18-21]。PGPR菌肥研究取得研究成果較多，邱勤等[22]使用PGPR菌劑對新墾地土壤接種，顯著提高了土壤的各項基本化學(xué)肥力指標(biāo)。韓光等用復(fù)合型PGPR對土壤培肥效果研究表明，PGPR處理后，土壤有機質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、有效磷和速效鉀的分別提高了42.2%、58.8%、8%、12.6%、37.2%和 40.2%[23]。逄煥成等[24]用解鉀細(xì)菌和芽孢桿菌的菌劑處理土壤，土壤中的有機質(zhì)、全氮、有效磷和速效鉀分別提高了55.9%、50.2%、71.4%和 28.9%。本研究篩選的功能細(xì)菌，有望研制出提高西藏土壤肥力的PGPR菌肥。

3) 作物種子的萌發(fā)受到許多外在和內(nèi)在因素的影響，萌發(fā)狀態(tài)影響著成苗率和幼苗質(zhì)量，而成苗率和幼苗質(zhì)量是播種質(zhì)量的重要因素，也是提高田間植株質(zhì)量的關(guān)鍵因素[25]。本研究用固氮、溶磷菌液處理黑青稞種子，通過發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)來說明種子活力的高低；以幼苗的莖粗、芽長、根長、須根數(shù)來說明菌液對幼苗的作用。

由于本試驗所篩細(xì)菌具有多種促生能力，將這些細(xì)菌進行組合后，有望在西藏較為貧瘠的土壤上收到明顯效果并得到應(yīng)用。當(dāng)然，需要進行菌株組合及溫室盆栽試驗，進一步研究證實。