食源性細(xì)菌關(guān)鍵小分子信號通路研究進(jìn)展

王飛飛，傅玲琳，鮑星月，劉長軍，張曉雙，王彥波,*

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江食品質(zhì)量安全工程研究院，浙江 杭州 310018；2.象山縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江 象山 315700）

研究表明細(xì)菌是引起食品腐敗變質(zhì)的重要原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約1/4的食品損失是由細(xì)菌等微生物單獨(dú)活動引起的[1]，其導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。自20世紀(jì)30年代以來，研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)大多食源性致病菌能形成生物被膜，可以存在于食品加工廠包括塑料、玻璃、金屬和木材等各種表面；也可以在食品運(yùn)輸和貯藏過程中形成，黏附在固體表面[2]。細(xì)菌在形成生物被膜后對化學(xué)殺菌劑和環(huán)境變化的敏感程度顯著降低，耐熱性也相應(yīng)增加，可引起顯著的食品安全問題，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題和經(jīng)濟(jì)損失[3]。

研究表明細(xì)菌有兩種關(guān)鍵的小分子信號通路，包括群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)和環(huán)二鳥苷酸（cyclic di-guanosine monophosphate，c-di-GMP）系統(tǒng)，其在多種細(xì)菌的一系列生理功能中都起著重要調(diào)控作用，包括胞外酶分泌、毒力調(diào)節(jié)、生物被膜形成和細(xì)胞運(yùn)動性等[4]。此外，近年來越來越多的研究報道了QS對食品腐敗的調(diào)控作用。QS通過自誘導(dǎo)物（autoinducers，AIs）的分泌、釋放、感應(yīng)來調(diào)控細(xì)胞密度依賴的基因表達(dá)，使細(xì)胞的基因表達(dá)從低細(xì)胞密度的個體生活方式轉(zhuǎn)換為協(xié)同的高細(xì)胞密度狀態(tài)[5]。c-di-GMP系統(tǒng)可以將包括分子氧、氨基酸、電子、光子等環(huán)境刺激轉(zhuǎn)化為c-di-GMP信號[6]，并由其效應(yīng)分子核糖開關(guān)或/和受體蛋白介導(dǎo)調(diào)控基因表達(dá)完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。食源性細(xì)菌通過胞外AIs和胞內(nèi)c-di-GMP這兩大類小分子信號來調(diào)控其生存狀態(tài)，從而影響食品的品質(zhì)和安全。目前，有關(guān)QS和c-di-GMP信號通路的研究主要集中在醫(yī)藥和生物防治領(lǐng)域，在食品領(lǐng)域仍待進(jìn)一步探究，鑒于此，本文綜述食源性細(xì)菌關(guān)鍵小分子信號通路研究進(jìn)展，旨在提供保障食品品質(zhì)和安全的控制靶點(diǎn)。

1 食源性細(xì)菌關(guān)鍵小分子信號通路概述

1.1 細(xì)菌QS概述

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌會通過細(xì)胞間的相互交流控制一系列的生命活動。細(xì)菌在生長過程中通過QS來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)以促使自身更好地適應(yīng)外界環(huán)境。QS依賴于被稱為AIs的信號分子的產(chǎn)生、分泌及應(yīng)答，信號分子隨著細(xì)菌的生長在一定基礎(chǔ)水平上繼續(xù)產(chǎn)生和分泌，從而使環(huán)境介質(zhì)中信號分子濃度達(dá)到一個閾值水平（即群體水平），并與細(xì)胞膜上或胞內(nèi)的受體結(jié)合進(jìn)而調(diào)控QS依賴的目的基因表達(dá)來誘導(dǎo)相應(yīng)表型[8]，這種細(xì)胞間的相互溝通方式被稱為QS。目前，可將已經(jīng)鑒定到的信號分子歸為4大類：一是酰基高絲氨酸內(nèi)酯（acylhomoserine lactone，AHL），其是一種脂肪酸的衍生物，被統(tǒng)一稱為AI-1，產(chǎn)生于革蘭氏陰性菌中，主要參與種內(nèi)信號交流；二是呋喃硼酸二酯，產(chǎn)生于S-腺苷高半胱氨酸到同型半胱氨酸的循環(huán)過程中，被統(tǒng)稱為AI-2，可同時由革蘭氏陰性菌和陽性菌產(chǎn)生，并參與種內(nèi)和種間的信號傳遞；三是AI-3，首次在腸出血性大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)，參與調(diào)控毒性因子的產(chǎn)生；四是自誘導(dǎo)多肽（autoinducing peptides，AIPs），存在于由革蘭氏陽性菌中[9]。細(xì)菌大多數(shù)QS調(diào)節(jié)的生理過程都是為了確保在一定環(huán)境下更高的存活率[10]。

大多數(shù)細(xì)菌利用兩種機(jī)制來檢測AIs并作出響應(yīng)，從而調(diào)控靶向基因的表達(dá)。第一種機(jī)制以依賴AHL的QS系統(tǒng)為代表，存在于革蘭氏陰性菌中，AHL由LuxI型AHL合成酶產(chǎn)生，其受體是LuxR家族轉(zhuǎn)錄因子。LuxR-AHL復(fù)合物是一個二聚物，與受QS調(diào)控的啟動子保守回文序列結(jié)合，包括luxI自身的啟動子，激活A(yù)HL的產(chǎn)生（自誘導(dǎo)）以及其他靶基因的表達(dá)。在另一種機(jī)制中，信號分子則由膜雙組分應(yīng)答調(diào)節(jié)系統(tǒng)檢測到，同時存在于革蘭氏陰/陽性菌中[11]，如葡萄球菌屬（Staphylococcus）產(chǎn)生的信號多肽AIP。在該系統(tǒng)中，信號分子由膜上的感應(yīng)器檢測并將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給胞內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)子，通過調(diào)節(jié)性RNAs和轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控靶基因表達(dá)[12]。哈氏弧菌（Vibrio harveyi）的QS系統(tǒng)卻同時具備革蘭氏陰性菌和陽性菌的特征，既可以像革蘭氏陰性菌那樣產(chǎn)生并應(yīng)答高絲氨酸內(nèi)酯，也可以像革蘭氏陽性菌那樣通過膜結(jié)合的組氨酸激酶來實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。

1.2 細(xì)菌c-di-GMP概述

細(xì)菌c-di-GMP最初作為木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinum）中纖維素合酶的變構(gòu)激活劑而被發(fā)現(xiàn)[13]。c-di-GMP由兩個三磷酸鳥苷分子在二鳥苷酸環(huán)化酶（diguanylate cyclase，DGC）作用下合成，DGC包含由大約170 個氨基酸組成的GGDEF結(jié)構(gòu)域[14]。相反地，c-di-GMP被特異性磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）降解，PDE包含由大約250 個氨基酸組成的EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域[15]。與QS機(jī)制不同的是，c-di-GMP有著多重信號通路，很多細(xì)菌都能編碼大量合成和降解c-di-GMP的蛋白，比如大腸桿菌K-12（Escherichia coli K-12）能編碼12 個含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的蛋白，10 個含有EAL結(jié)構(gòu)域的蛋白，以及7 個同時含有這兩個結(jié)構(gòu)域的蛋白[16]。其次，在細(xì)菌基因組中編碼GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的數(shù)量是高度可變的，從不編碼到編碼100多個蛋白不等。雖然這些結(jié)構(gòu)域都是保守的，每個蛋白都有其獨(dú)特的N-末端感知域用來接收外界不同信號[17]。

目前已確認(rèn)c-di-GMP在生物體內(nèi)主要通過效應(yīng)蛋白和mRNA核糖開關(guān)發(fā)揮作用。效應(yīng)蛋白包括含PilZ結(jié)構(gòu)域的蛋白，含有退化的GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域蛋白以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[18]。mRNA核糖開關(guān)指mRNA 5’非編碼區(qū)的特定保守序列折疊成一定的構(gòu)象，能專一性地與c-di-GMP結(jié)合并影響蛋白質(zhì)翻譯。在G. xylinum中發(fā)現(xiàn)c-di-GMP能激活BcsA-BcsB纖維素合酶復(fù)合體從而增加胞外多糖基質(zhì)的合成，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)c-di-GMP能與BcsA蛋白C末端的PilZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合，這也是第一個被實(shí)驗(yàn)證實(shí)的c-di-GMP受體蛋白。含PilZ結(jié)構(gòu)域的蛋白分布非常廣泛，例如E. coli中調(diào)節(jié)細(xì)菌運(yùn)動能力的YcgR和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中調(diào)節(jié)胞外藻酸鹽合成的AlgA。退化的GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域蛋白指含有與GGDEF、EAL或HD-GYP類似的結(jié)構(gòu)域，且不具有合成或降解c-di-GMP活性的蛋白，P. aeruginosa中發(fā)現(xiàn)的調(diào)控Pel多糖合成的內(nèi)膜蛋白PelD和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）中發(fā)現(xiàn)的調(diào)控生物被膜中胞外蛋白合成與分泌的LapD都屬于這類蛋白[7]。P. aeruginosa中的FleQ[19]和霍亂弧菌（Vibrio cholerae）中的FlrA[20]都是增強(qiáng)子結(jié)合蛋白，屬于c-di-GMP轉(zhuǎn)錄因子類型的效應(yīng)蛋白。c-di-GMP是重要的細(xì)菌第二信使，被認(rèn)為是各種生物體中形成和維持生物被膜的調(diào)節(jié)中心，控制著細(xì)胞在可運(yùn)動的單細(xì)胞狀態(tài)與黏附的多細(xì)胞狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換[17]。

2 食源性細(xì)菌關(guān)鍵小分子信號通路對食品腐敗的調(diào)控

近年來，關(guān)于QS對食品腐敗調(diào)控方面的研究越來越多，目前已在各類食品中檢測到QS信號分子，包括牛奶和乳制品、肉和肉制品、海鮮和水產(chǎn)品、水果和蔬菜等。此外，QS對食品腐敗的調(diào)控也在一些研究中得到驗(yàn)證。而細(xì)菌胞內(nèi)小分子信號c-di-GMP對食源性細(xì)菌腐敗特性的調(diào)控及其機(jī)制還鮮有研究。以下將圍繞QS與食品腐敗展開討論。

牛奶中腐敗菌Pseudomonas spp.、Serratia spp.、腸桿菌屬（Enterobacter spp.）和Hafnia alvei的致腐能力與QS有關(guān)[21]。從包裝鱈魚片中檢出的N-（3-羥基）-L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-(3-hydroxyoctanoyl)-L-homoserine lactone，3-OH-C8-HSL）能夠調(diào)節(jié)明亮發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）和氣單胞菌屬（Aeromonas spp.）的幾丁質(zhì)酶活性，表明AHL型QS系統(tǒng)可能在甲殼類動物的腐敗中發(fā)揮作用[22]。從熏制鮭魚里分離出來的變形斑沙雷氏菌（Serratia proteamaculans）B5a菌株，其胞外酶活性受AHL信號分子調(diào)節(jié)[23]。同樣地，N-丁?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-butanoyl-L-homoserine lactone，C4-HSL）能增加嗜冷假單胞菌（Pseudomonas psychrophila）PSPF19菌株胞外酶的產(chǎn)量并提高其在冷藏淡水魚中的致腐能力[24]。另外，豆芽的細(xì)菌性腐敗也受QS系統(tǒng)影響[25]。從生鮮蔬菜加工線分離的樸立茅次沙雷菌（Serratia plymouthica）RVH1菌株中的LuxI的同系物SplI，負(fù)責(zé)調(diào)控C4-HSL、N-己酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-hexanoyl-L-homoserine lactone，C6-HSL）和N-（3-O-己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone，3-oxo-C6-HSL）的產(chǎn)生。S. plymouthica胞外幾丁質(zhì)酶、核酸酶以及蛋白酶的產(chǎn)生與SplI型的QS系統(tǒng)有關(guān)[26]。在S. plymouthica RVH1菌株的SplI突變體中，這些胞外酶的產(chǎn)量減少，只有通過添加C6-HSL或3-oxo-C6-HSL才能恢復(fù)[27]。在與黃瓜腐病相關(guān)的黏質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）MG1菌株和沙雷氏菌（Serratia sp.）ATCC 39006菌株中，其與腐敗有關(guān)的胞外酶的分泌分別受SwrI/SwrR QS系統(tǒng)及其同源物質(zhì)C4-HSL、SmaI/SmaR QS系統(tǒng)及其同源物質(zhì)C4-HSL和C6-HSL的調(diào)節(jié)[26,28-29]。最近，一系列環(huán)二肽分子（diketopiperazines，DKPs）在多種革蘭氏陰性菌中被檢出，且被報道具有調(diào)控AHL型QS能力[30]。研究發(fā)現(xiàn)DKPs能促進(jìn)腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）和/或波羅地海希瓦氏菌（Shewanella baltica）生物被膜的形成[31-32]、氧化三甲胺還原酶（trimethylamine N-oxide reductase A，torA）和鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）的基因表達(dá)[32]，以及揮發(fā)性鹽基氮、三甲胺、腐胺和胞外蛋白酶的產(chǎn)生[31-33]。因此，DKPs被認(rèn)為是新型QS信號分子[34]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，S. baltica中DKPs能與LuxR型受體直接結(jié)合從而調(diào)控氧化三甲胺還原酶調(diào)節(jié)蛋白TorS，誘導(dǎo)型鳥氨酸脫羧酶SpeF和鞭毛馬達(dá)蛋白PomA的表達(dá)，進(jìn)而影響三甲胺、腐胺和生物被膜的形成。上述研究初步確認(rèn)了QS系統(tǒng)對食品腐敗菌致腐能力的調(diào)控作用，但QS調(diào)控腐敗菌致腐能力以及生物被膜形成能力的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

3 食源性細(xì)菌關(guān)鍵小分子信號通路對生物被膜的調(diào)控

由食源性疾病引發(fā)的食品問題已成為我國目前主要的食品安全問題，其中，微生物是主要食源性疾病病原。食源性致病菌形成復(fù)雜和多層結(jié)構(gòu)的生物被膜有助于細(xì)菌群落在靜止和安全的環(huán)境中生存而不容易被徹底清除，從而使其得到擴(kuò)散蔓延，影響食品安全。

3.1 細(xì)菌QS與生物被膜形成

研究表明無法合成N-（3-O-十二?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone，3-oxo-C12-HSL）的P. aeruginosa lasI突變株只能形成平坦、未分化的生物被膜，并且對十二烷基硫酸鈉的分散作用更敏感[35]，該研究首次將QS與生物被膜形成聯(lián)系起來。目前普遍認(rèn)為QS在食源性細(xì)菌生物被膜形成中起著重要作用。

Cloak等在從牛奶和雞湯中分離出來的空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）中檢出了AI-2，并在其基因組中找到了編碼AI-2合成酶的基因luxS[36]。研究發(fā)現(xiàn)C. jejuni的luxS突變株與野生株相比生物被膜形成減少，添加野生株的無菌24 h培養(yǎng)上清液促進(jìn)了生物被膜的形成[37]。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）AHL合成酶ahyI突變株由于不能合成C4-HSL，不能形成成熟的生物被膜。此外，在A. hydrophila中發(fā)現(xiàn)了一個LuxR型受體能與AHL結(jié)合從而調(diào)控ahyR突變株生物被膜的形成，這說明QS能調(diào)控A. hydrophila的生物被膜形成[38]。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）QS系統(tǒng)包括LuxR型受體PlcR和LuxS/AI-2系統(tǒng)，plcR突變株形成的生物被膜比野生株多約4 倍[39]。外源添加AI-2降低了B. cereus野生株生物被膜的形成，添加AI-2到B. cereus已形成的生物被膜中導(dǎo)致被膜分散[40]。因此，PapR和AI-2對B. cereus生物被膜的形成具有負(fù)調(diào)控作用。單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）具有LuxS/AI-2系統(tǒng)，其luxS突變株形成的生物被膜比野生株厚4 倍，故AI-2對L. monocytogenes生物被膜形成具有負(fù)調(diào)控作用[41]。E. coli QS系統(tǒng)包括LuxS/AI-2系統(tǒng)和LuxR型受體SdiA，外源添加AI-2增加了E. coli K-12野生株的生物被膜形成[42]，SdiA突變株的生物被膜形成比野生株增加好幾倍，外源添加的AHL通過與SdiA受體結(jié)合從而抑制生物被膜形成[43]。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）也有LuxS/AI-2系統(tǒng)，luxS突變株不能形成成熟的生物被膜，當(dāng)進(jìn)行l(wèi)uxS基因回補(bǔ)時其生物被膜得以恢復(fù)[44]。V. cholerae在高細(xì)胞密度時的生物被膜形成主要受LuxR型轉(zhuǎn)錄因子HapR調(diào)控，hapR突變株生物被膜形成增加[45]。創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）luxR型基因smcR突變株的生物被膜形成比野生株增加了大約5 倍[46]。P. aeruginosa有2 套LuxR/LuxI系統(tǒng)，即LasR/LasI和RhlR/RhlI，lasI和rhlI突變株形成的生物被膜較野生株顯著減少[47]，lasI和rhlI突變株中控制基質(zhì)胞外多糖合成的pel操縱子的轉(zhuǎn)錄受到了抑制[48]。此外，6-姜酚可以通過與P. aeruginosa中的3-oxo-C12-HSL競爭結(jié)合LasR受體從而減少生物被膜的形成[49]。以上研究均在一定程度上說明了QS對細(xì)菌生物被膜形成的調(diào)控作用，包括正調(diào)控和負(fù)調(diào)控。但是有關(guān)QS對食品腐敗菌生物被膜形成的調(diào)控研究仍停留在表型，需要進(jìn)一步挖掘其調(diào)控分子機(jī)制，為消除腐敗菌生物被膜和開發(fā)新型食品保鮮劑提供新思路。

3.2 細(xì)菌c-di-GMP與生物被膜形成

細(xì)菌c-di-GMP在生物被膜形成中的作用首次在2002年由2 個團(tuán)隊(duì)分別提出，Boles[50]和D’Argenio[51]等分別在副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和P. aeruginosa中通過突變或/和過表達(dá)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了影響生物被膜形成的GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域蛋白。目前，胞內(nèi)c-di-GMP濃度與生物被膜形成和細(xì)胞運(yùn)動性之間的相關(guān)性已在多種細(xì)菌中被證明，如E. coli、P. aeruginosa、V. cholerae、A. hydrophila等，這些細(xì)菌也是食品中常見的致病菌，極易造成食品污染并給消費(fèi)者帶來不同程度的危害。細(xì)菌c-di-GMP普遍抑制細(xì)菌運(yùn)動性并刺激生物被膜形成，刺激細(xì)菌黏附素和細(xì)胞外基質(zhì)組分的合成，此外，參與某些致病菌急性感染的毒力基因表達(dá)被c-di-GMP下調(diào)，而慢性感染通常與高c-di-GMP水平和生物被膜形成相關(guān)[52]。本文圍繞擁有典型c-di-GMP通路的E. coli、P. aeruginosa和V. cholerae展開討論。

3.2.1 E. coli生物被膜形成機(jī)制

YhjH是E. coli的一個具有高效PDE活性的蛋白，與DGC活性蛋白YegE和YedQ共同控制E. coli整體c-di-GMP水平，主要負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動性[53]。在生長對數(shù)期，YhjH通過保持低水平的c-di-GMP來維持鞭毛運(yùn)動性，進(jìn)入穩(wěn)定期后，由于YhjH的表達(dá)下調(diào)，c-di-GMP水平增加[54]，使得c-di-GMP效應(yīng)蛋白YcgR活化并與鞭毛馬達(dá)相互作用抑制其活性[53,55]。因此，在生長的大腸桿菌細(xì)胞中，YhjH通過保持細(xì)胞c-di-GMP的濃度低于能夠激活YcgR的閾值水平而在維持細(xì)胞運(yùn)動性方面起著核心作用。另一個c-di-GMP調(diào)節(jié)體系由DGC活性蛋白YdaM和PDE活性蛋白YciR組成，ydaM和yciR基因缺失株嚴(yán)重影響csgD轉(zhuǎn)錄，即影響關(guān)鍵生物被膜形成調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，從而影響卷曲菌毛合成而不影響細(xì)胞運(yùn)動性，這與yegE和yhjH基因缺失株的表型相反[54]。研究表明，YegE/YhjH和YdaM/YciR以級聯(lián)的方式運(yùn)作共同決定c-di-GMP水平，YciR作為具有雙功能的觸發(fā)酶，其降解c-di-GMP的酶活性功能與通過互作直接抑制YdaM功能相互干涉。因此，當(dāng)胞內(nèi)c-di-GMP水平較高時，YciR顯示PDE活性從而減輕對YdaM的抑制作用，使其能發(fā)揮DGC活性產(chǎn)生c-di-GMP，同時YdaM作為雙功能蛋白通過與轉(zhuǎn)錄因子MlrA直接互作，從而促使csgD轉(zhuǎn)錄，影響生物被膜形成[56]。

3.2.2 P. aeruginosa生物被膜形成機(jī)制

在P. aeruginosa中，至少有5 個DGC活性蛋白可以調(diào)控細(xì)胞從可運(yùn)動狀態(tài)到生物被膜形成，分別為WspR、SadC、RoeA、SiaD和YfiN。相反，DGC活性蛋白GcbA和NicD以及PDE活性蛋白DipA、RbdA和NbdA與生物被膜分散有關(guān)[57]。關(guān)于DGC活性蛋白的第一個生化特征研究源自于GGDEF蛋白WspR，WspR通過調(diào)節(jié)胞外多糖的合成來控制生物被膜形成。WspR發(fā)揮作用經(jīng)歷3 個過程：首先，當(dāng)感應(yīng)到表面黏附生長時，Wsp信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物使WspR磷酸化并觸發(fā)c-di-GMP的合成[58]；接著，WspR磷酸化觸發(fā)亞細(xì)胞WspR寡聚成簇，進(jìn)一步增加了DGC的活性[59]；最后，WspR的活性受到c-di-GMP的反饋抑制。除了WspR，另外一個DGC活性蛋白YfiN作為膜錨定蛋白也能促進(jìn)胞外多糖pel和psl操縱子的表達(dá)[60]。在P. aeruginosa中，很多轉(zhuǎn)錄因子被確認(rèn)為c-di-GMP受體，即能檢測細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平，并將此信息轉(zhuǎn)化，使特定細(xì)胞應(yīng)答/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活。當(dāng)胞內(nèi)c-di-GMP水平較低時，F(xiàn)leQ作為增強(qiáng)子結(jié)合蛋白是鞭毛基因表達(dá)的主要激活因子[19]，當(dāng)c-di-GMP水平上升時，c-di-GMP與FleQ的結(jié)合將其作為參與產(chǎn)生胞外多糖和黏附素的pel、psl和cdr基因的阻遏物轉(zhuǎn)化為激活劑，從而促進(jìn)生物被膜的形成[61]。另一個響應(yīng)c-di-GMP的轉(zhuǎn)錄因子是BrlR，BrlR可以通過上調(diào)編碼多藥外排泵基因的表達(dá)從而增加生物膜細(xì)胞對抗菌劑的抗性[62]。此外，BrlR對c-di-GMP的結(jié)合親和力比FleQ要強(qiáng)，與FleQ相比，BrlR在較低的c-di-GMP水平和生物被膜發(fā)育過程的較早階段發(fā)揮作用[63]。

3.2.3 V. cholerae生物被膜形成機(jī)制

在V. cholerae中，c-di-GMP主要通過抑制細(xì)胞運(yùn)動并促進(jìn)生物被膜基質(zhì)產(chǎn)生來控制生物被膜的形成，總的來說，c-di-GMP隨著細(xì)胞密度增加而減少。系統(tǒng)研究表明，缺失DGC活性蛋白CdgD（VCA0697）、CdgH（VC1067）、CdgK（VC1104）或CdgL（VC2285）可以增強(qiáng)其運(yùn)動性[64]；相反，缺失PDE活性蛋白RocS（VC0653）或CdgJ（VC0137）抑制其運(yùn)動性[64-65]；而缺失DGC活性蛋白CdgA（VCA0074）、CdgH、CdgK、CdgL、CdgM（VC1376）和VpvC以及PDE活性蛋白RocS、CdpA（VC0130）、CdgJ、MbaA（VC0703）、CdgC（VCA0785）和VC1851的突變株通過影響多聚糖基因vps的表達(dá)來調(diào)節(jié)生物被膜的形成[66-67]。c-di-GMP在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控鞭毛相關(guān)基因，F(xiàn)lrA作為P. aeruginosa中FleQ的同源蛋白，是V. cholerae決定細(xì)胞運(yùn)動性的鞭毛生物合成操縱子flrBC的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)其與c-di-GMP結(jié)合后其活性受損，從而使細(xì)胞運(yùn)動性減弱[20]。另外，MshA亞基聚合形成的菌毛控制V. cholerae的表面附著能力，亞基聚合需要由ATP酶MshE提供能量，而MshE的激活需要c-di-GMP的結(jié)合，mshE或mshA基因缺失會使細(xì)菌喪失初始表面附著能力，表明c-di-GMP介導(dǎo)的MshA菌毛的合成是生物被膜形成的關(guān)鍵早期步驟[68-70]。c-di-GMP還可以通過與VpsR（VC0665）和VpsT（VCA0952）結(jié)合在轉(zhuǎn)錄水平上激活VPS的生物合成以及其他生物被膜基質(zhì)蛋白的表達(dá)[71]。

4 細(xì)菌QS與c-di-GMP調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

細(xì)菌QS和c-di-GMP信號通路在細(xì)菌中具有廣泛的保守性，而且在生物被膜形成、毒力因子合成以及其他相關(guān)生理過程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這暗示著這兩條信號通路之間存在某種聯(lián)系。V. cholerae作為一種食源性細(xì)菌，是研究QS和c-di-GMP的典型菌株，目前對V. cholerae中QS和c-di-GMP通路之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究也比較透徹，鑒于此，本文以V. cholerae為代表討論QS和c-di-GMP通路之間的調(diào)控關(guān)系。

在V. cholerae中，QS對c-di-GMP的調(diào)控體現(xiàn)在多個水平。具有QS調(diào)節(jié)活性的同源（quorum regulatory，Qrr）sRNA可以直接促進(jìn)編碼DGC活性蛋白VCA0939的mRNA翻譯，而不依賴于中心調(diào)節(jié)子HapR。Qrr sRNA對VCA0939的誘導(dǎo)作用與低細(xì)胞密度下更高的c-di-GMP水平相符，但VCA0939缺失株的生物被膜形成情況較野生株無明顯變化，因?yàn)閮H一個DGC活性蛋白的缺失并不能對一個復(fù)雜的c-di-GMP信號通路造成很大的影響[72]，對于VCA0939的活性還有待進(jìn)一步研究。Qrr sRNA的下游分子也能影響c-di-GMP的產(chǎn)生，高細(xì)胞密度時HapR的表達(dá)控制著14個GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白和4個HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致細(xì)胞c-di-GMP水平下降，從而使vps表達(dá)下降[73-74]。相反，hapR基因突變導(dǎo)致c-di-GMP水平上升，使菌落形態(tài)發(fā)生從光滑到多皺的轉(zhuǎn)變[74]。低細(xì)胞密度時AphA也控制著一系列DGC活性蛋白和PDE活性蛋白的表達(dá)[75]。除了在多層面上對c-di-GMP產(chǎn)生的直接調(diào)控，QS和c-di-GMP信號通路能共同合作控制V. cholerae中2 個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子AphA和VpsT的表達(dá)。c-di-GMP可以通過與受體VpsR結(jié)合形成復(fù)合物從而激活aphA的轉(zhuǎn)錄[76]，由于AphA是低細(xì)胞密度下QS的主要轉(zhuǎn)錄因子，而低細(xì)胞密度時c-di-GMP水平較高，因此這條通路具有實(shí)際意義。研究發(fā)現(xiàn)在aphA的啟動子中有HapR和VpsR的重疊結(jié)合位點(diǎn)，而且兩者的結(jié)合是相互排斥的[77]，這很好地解釋了aphA在低細(xì)胞密度時能被c-di-GMP激活，而在高細(xì)胞密度時被HapR抑制的情況，從而共同確保AphA在低細(xì)胞密度中的表達(dá)。與aphA類似，vpsT的表達(dá)也同時受HapR和VpsR的調(diào)控，在vpsT的啟動子中發(fā)現(xiàn)了HapR和VpsR的重疊結(jié)合位點(diǎn)[74,76]。由此可知，V. cholerae整合QS和c-di-GMP兩個信號通路形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而將多個環(huán)境信號轉(zhuǎn)化成vpsT和aphA的表達(dá)。

除了V. cholerae，QS和c-di-GMP的聯(lián)系在其他食源性細(xì)菌中也有相關(guān)闡述。P. aeruginosa中的酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，TpbA）可以對GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白TpbB進(jìn)行去磷酸化，從而抑制其活性，減少生物被膜形成。TpbA受Las-QS系統(tǒng)調(diào)控，因此，QS對c-di-GMP的產(chǎn)生具有負(fù)調(diào)控作用[78]。在A. hydrophila中，過表達(dá)DGC活性蛋白對生物被膜形成的誘導(dǎo)依賴于完整的AI-2 QS系統(tǒng)[79]，食源性細(xì)菌中QS與c-di-GMP這兩個關(guān)鍵小分子信號分子之間的調(diào)控關(guān)系見圖1，但是這2 個通路是如何互作從而影響生物表型還有待進(jìn)一步研究。

圖1 食源性細(xì)菌關(guān)鍵小分子信號通路QS與c-di-GMP調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Regulatory network between QS and c-di-GMP signaling pathways in foodborne bacteria

5 結(jié) 語

細(xì)菌活動是引起食品品質(zhì)變化與安全問題的重要原因。雖然在很多變質(zhì)的食物（肉、奶、魚、果蔬等）中檢測到了QS信號分子，意味著QS在調(diào)控食品變質(zhì)中發(fā)揮一定作用，但它們在食物變質(zhì)中所起的確切作用目前尚不明確。對于食源性細(xì)菌中QS和c-di-GMP系統(tǒng)在食品腐敗和生物被膜形成方面的作用及其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。有研究表明，早前涉及細(xì)菌致病機(jī)制的QS系統(tǒng)也可能在食品腐敗中發(fā)揮作用，這為研究基于QS的食品腐敗提供一定的參考。對于c-di-GMP通路，在食源性腐敗菌中還鮮有研究，但是在很多食品腐敗菌的基因組中同樣存在著編碼DGC和PDE活性蛋白的基因序列，這意味著食品腐敗菌的相關(guān)生理特性也可能受c-di-GMP通路調(diào)控，甚至QS與c-di-GMP通路形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同決定腐敗菌的致腐能力及生物被膜形成。了解食物生態(tài)系統(tǒng)中的QS和c-di-GMP通路以及兩個信號通路之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于進(jìn)行關(guān)鍵基因的靶向控制，即充分利用現(xiàn)有技術(shù)不斷發(fā)現(xiàn)或合成QS及c-di-GMP調(diào)控劑，從而高效特異地抑制目標(biāo)食源性細(xì)菌的致腐和致病能力，解決食物品質(zhì)與安全問題。