酉州烏羊精液不同保存方法對(duì)羔羊卵母細(xì)胞體外受精效果的影響

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(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 400015；2.重慶市山羊工程技術(shù)研究中心，重慶 榮昌 402460)

0 引言

酉州烏羊?yàn)跗ぐ妆幻?，?dú)具特色，具有“藥羊”的美稱，是珍稀的國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源，但目前資源調(diào)查顯示該品種已瀕臨滅絕，急需采取有效的措施來增加種群數(shù)量[1]。人工授精是加速優(yōu)秀種畜繁育的關(guān)鍵技術(shù)之一。目前筆者的研究團(tuán)隊(duì)已在酉州烏羊配子資源方面進(jìn)行了一些研究，包括精液保存[2]，卵母細(xì)胞體外發(fā)育[3]等，本研究以酉州烏羊羔羊羔羊卵母細(xì)胞為材料，研究了3種不同精液的保存方法對(duì)羔羊卵母細(xì)胞體外受精效果的影響，為挖掘利用這一獨(dú)特資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 卵母細(xì)胞

來自酉州烏羊幼羊體外成熟的卵母細(xì)胞。

1.2 精液

來自酉州烏羊資源保護(hù)場(chǎng)種公羊。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為3組，鮮精組、低溫保存組和凍精組，分別為采集的新鮮精液、低溫保存的精液和采用細(xì)管法冷凍保存的精液。

2.2 精液采集及處理方法

對(duì)同一只酉州烏羊種公羊采用假陰道法獲取精液，鏡下檢測(cè)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。鮮精組處理方法是根據(jù)密度用精液稀釋液進(jìn)行3～5倍稀釋后立刻使用；低溫組處理方法是精液稀釋后放到冰箱冷藏室4℃保存過夜，使用時(shí)放在水浴鍋中37℃升溫30 s；冷凍組處理方法是從液氮中取出細(xì)管凍精立即放入38℃水浴鍋內(nèi)，升溫15 s。

2.3 精子獲能

先在離心管中39℃水浴鍋中預(yù)熱2 mL受精液，然后將200 μL稀釋后的鮮精、低溫保存精液或解凍后凍精用移液器緩慢注入管子底部，靜置30 min收集上清液，然后置于39℃的CO2培養(yǎng)箱中待用。

2.4 體外受精

將體外培養(yǎng)成熟的COCs檢出，置于HSOF操作液中，用移液槍進(jìn)行吹打脫除部分顆粒細(xì)胞和精子，先在HSOF操作液中洗三次，HSOF操作液組成為：HSOF+3 mg/mL BSA，再在受精液中洗3次，受精液組成為：mSOF+10 μg/mL肝素+0.2 μm/L青霉胺+0.1 μm/L亞牛磺酸+10%EGS。然后移入40 μL的受精液滴中，每個(gè)液滴放入15枚左右的成熟COCs，再加入密度為1×106個(gè)/mL的獲能精子，置于5%CO2、飽和濕度和38.5℃的CO2培養(yǎng)箱中共孵育18 h。

2.5 胚胎體外發(fā)育

將受精18 h后的卵置于HSOF操作液中，用移液槍吹打脫除精子和顆粒細(xì)胞，依次在HSOF操作液、胚胎發(fā)育液中洗滌3次，放入發(fā)育液中，其中每個(gè)40 μL的小液滴中移入受精卵15枚左右，然后置于5%CO2、飽和濕度和38.5℃的CO2培養(yǎng)箱體外發(fā)育，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行卵裂情況檢查。

3 結(jié)果

檢測(cè)鮮精組、凍精組和低溫保存組，IVF后統(tǒng)計(jì)各組48 h卵裂率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明冷凍組的卵裂率(42.64%)低于鮮精和低溫保存組，但不同精液保存法的體外受精后卵裂率(42.64%、48.31%、45.13%)差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。(見表1)。

表1 精液不同保存方法對(duì)羔羊卵母細(xì)胞體外受精效果影響

注:同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

4 討論

酉州烏羊長(zhǎng)期以來生長(zhǎng)在封閉的環(huán)境中，以放牧為主,飼養(yǎng)管理相對(duì)粗放，主要通過自然交配的方式進(jìn)行繁殖。酉州烏羊新鮮精液的采集使用經(jīng)常受到時(shí)間地點(diǎn)的限制，在夏季及冬季山羊乏情季節(jié)不能保證采集精液的質(zhì)量，另外資源保護(hù)場(chǎng)與實(shí)驗(yàn)室相隔也較遠(yuǎn)，前期本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)酉州烏羊種公羊的精液品質(zhì)特性和生產(chǎn)水平進(jìn)行了鑒定和評(píng)估[2], 后續(xù)實(shí)驗(yàn)制作了酉州烏羊細(xì)管凍精[4],通過冷凍等方法，積極探索酉州烏羊種質(zhì)資源的利用途徑。

陳曉勇[5]比較了精液保存方法對(duì)羔綿羊卵母細(xì)胞體外受精效果影響，結(jié)果表明鮮精組卵裂率顯著性高于低溫保存和冷凍保存精液組(P<0.05),與本研究結(jié)果有所差異。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明凍精組卵裂率低于新鮮精液組和低溫保存的精液組，可能是由于精液經(jīng)過冷凍解凍處理后，影響了精子受精能力，但不同保存方法受精效果未達(dá)到顯著水平，說明可以在實(shí)際工作中可以嘗試對(duì)酉州烏羊細(xì)管凍精進(jìn)行一些探索利用。