鯉春病毒血癥病毒（SVCV）人工感染錦鯉攻毒試驗

花 麒,歐陽敏,田飛焱,劉文珍,徐節(jié)華

（江西省水產技術推廣站 ,江西 南昌 330046）

鯉春病毒血癥病毒（SVCV）屬彈狀病毒科（Rhabdoviridae）、水泡性病毒屬（Vesiculovirus）,為單股負鏈RNA病毒[1],最早由Fijian等[2]分離出來。它可以引起鯉春病毒血癥病毒,主要感染鯉科魚類,并導致極高的死亡率[3],因此在我國農業(yè)部發(fā)布的《一、二、三類動物疫病病種名錄》中,被列為一類動物疫病[4]。

本試驗利用本中心實驗室采集和保藏的SVCV病毒株（JX14-012）對養(yǎng)殖的錦鯉進行人工感染試驗,然后再定期對對照組和試驗組錦鯉進行SVCV檢測、生化指標檢測和組織病理學研究,以證明該毒株對錦鯉的致病性,并對SVCV人工感染錦鯉后的發(fā)病情況進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料SVCV病毒株（JX14-012）是本中心實驗室利用草魚卵巢細胞系（Grass carp Ovary,CO）從1批鯽魚監(jiān)測樣品中分離鑒定到的1株病毒。試驗用錦鯉取自江西省分宜縣某錦鯉養(yǎng)殖場,在實驗室暫養(yǎng)5 d無異常后開始試驗。

1.2 方法

1.2.1 SVCV感染錦鯉 試驗前隨機抽取該批錦鯉25尾,取肝、脾、腎和腦進行病毒分離和PCR檢測,確定試驗魚為SVCV陰性樣本。然后將剩下的魚隨機分成4組,每組15尾,暫養(yǎng)于室內水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的4個水缸中,水溫為8℃ ～16℃。以JX14-012株的細胞懸液作原液,并將原液用含10%胎牛血清的M199以1∶10倍、1∶100倍稀釋,共3個梯度的攻毒液通過腹腔注射試驗組,同時用正常的CO細胞懸液注射另一組作為對照組。

1.2.2 SVCV檢測 取樣品的肝、腎、脾和腦研磨,加入10倍體積含雙抗的M199細胞培養(yǎng)液,4℃孵育過夜,然后7 000 r/min離心10 min,取上清作病毒原液,將原液用M199以1∶10倍、1∶100倍稀釋,3個稀釋度分別接種已長滿單層的CO細胞,逐日觀察細胞病理變化。待80%細胞出現(xiàn)細胞病變（CPE）時,將細胞凍融1次,收取細胞懸液繼續(xù)接種同種細胞;若細胞無CPE則繼續(xù)盲傳7 d,仍未見CPE則無害化處理。

按照E.Z.N.A.TM Total RNA kit說明書步驟對凍存的細胞懸液進行RNA提取,然后采用One step RNA PCR kit（AMV）參照 OIE編寫的《水生動物疾病診斷手冊》（2012版）進行PCR鑒定,引物:SVC-F1 （5′-TCT TGG AGC CAA ATA GCT CAR RTC-3′）、SVC-R2（5′-AGA TGG TAT GGA CCC CAA TAC ATH CAN CAY-3′） 和 SVC-R4 （5′-CTG GGG TTT CCN CCT CAA AGY YGY-3′）,其中 SVC-F1 和SVC-R2經RT-PCR擴增出SVCV糖蛋白（G）基因的714 bp片段,SVC-F1和SVC-R4經Semi-nested PCR從RT-PCR產物中擴增出606 bp片段[5]。

1.2.3 生化指標檢測 試驗一:每尾注射0.1 mL,分別在感染2 d、9 d后用無菌注射器進行尾靜脈取血1 mL;試驗二:每尾注射0.2 mL,在感染6 d后用無菌注射器進行尾靜脈取血1 mL。

將所取得的血液置于1.5 mL離心管中,用低溫冷凍離心機,10000 r/min離心10 min,收集血清,分別測定對照組與試驗組錦鯉血清中的總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、總膽固醇（TC）、尿素氮（BUN）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉移酶（GGT）、尿酸（UA）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酐（CREA）、葡萄糖（GLU）、球蛋白（GLB）。所有生化指標檢測均在優(yōu)利特URIT-8026全自動生化分析儀上完成。

1.2.4 組織病理切片的制作與觀察 對照組的錦鯉和試驗組的死亡錦鯉分別取腦、鰓、肝胰臟、脾臟、腎臟、肌肉各組織樣品用10%中性緩沖福爾馬林液固定24 h,將固定好的樣品用Leica TP 1020自動脫水機進行乙醇梯度脫水、二甲苯透明及浸蠟后,使用Leica EG 1150H石蠟包埋機進行包埋。用Leica RM 2235輪轉石蠟切片機進行連續(xù)切片,厚度5 μm,用毛刷移至Leica HI 1210攤片機進行展片和沾片后,在Leica HI 1220烤片機上進行烤片。使用Leica ST 5010自動染色機對切片進行H.E.染色,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 對照組和試驗組錦鯉表征觀察與分析 攻毒6 d后3個試驗組的魚開始發(fā)病,注射原液組癥狀更為明顯,表現(xiàn)為魚體干澀,表皮下充血,鱗片有輕微松動豎起（中插彩版圖1A）,肝門紅腫突出（中插彩版圖1B）,眼球突出（中插彩版圖1C）,魚鰾上有淤血斑（中插彩版圖1D）,15 d內原液試驗組15尾有3尾死亡,累積死亡率為20%（3/15）;對照組未觀察到癥狀和死亡現(xiàn)象。養(yǎng)殖過程中,試驗組錦鯉還出現(xiàn)腦部、頭背部、大側肌、肛門、鰭條等部位紅腫、充血。

2017年1月9日向每尾錦鯉注射0.1 mL相應的CO細胞懸液后,對試驗組和對照組錦鯉進行觀察得到如下結果:1月11日,養(yǎng)殖水溫16℃,試驗組錦鯉無明顯癥狀;1月18日,養(yǎng)殖水溫14℃,試驗組中注射稀釋100倍CO細胞懸液的錦鯉出現(xiàn)上頜充血,注射稀釋10倍CO細胞懸液的錦鯉出現(xiàn)后鰾室有明顯出血點,腦顱（室）充血,注射原始濃度CO細胞懸液的錦鯉出現(xiàn)鱗片松散,干澀,無光澤,軸上肌及背鰭基部明顯出血,泛紅,后鰾室有明顯出血點,腦顱（室）、上下頜充血,并死亡3尾;1月23日,養(yǎng)殖水溫15℃,試驗組中注射稀釋100倍CO細胞懸液的錦鯉出現(xiàn)鱗片松散,干澀,無光澤,鰾室有明顯出血點,腦顱（室）、上下頜充血,注射稀釋10倍CO細胞懸液的錦鯉出現(xiàn)鱗片松散,干澀,無光澤,大側肌及各鰭條明顯出血,鰾室有明顯出血點,腦顱（室）、上下頜充血,注射原始濃度CO細胞懸液的錦鯉出現(xiàn)鱗片松散,干澀,無光澤,大側肌及各鰭條明顯出血,鰾室有明顯出血點,肛門紅腫,突起,眼球突出,腦顱（室）、上下頜充血,對照組錦鯉無明顯癥狀。對照組錦鯉均無明顯癥狀。

2.2 SVCV檢測結果 取對照組和試驗組錦鯉的組織進行病毒分離和PCR檢測,3個試驗組錦鯉均能觀察到CPE,PCR檢測均為陽性,判定為已感染SVCV;而對照組錦鯉無CPE,PCR檢測為陰性,判定為SVCV癥病毒。見圖2,3,4。

圖2 接種CO細胞72 h后產生CPE的結果 （×100）

圖3 RT-PCR結果

圖4 semi-nested PCR結果

2.3 生化指標檢測結果 試驗一:試驗組錦鯉TP、ALB、GLB、HDL、LDL均在感染后濃度有所下降,但沒有顯著性差異,在感染9 d后,血清中含量顯著下降,與對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。TG、UA在感染2 d后濃度迅速上升,尤其是原始濃度感染組和稀釋10倍濃度感染組,與對照組相比較有極顯著性差異（P＜0.01）,但在感染后期,其濃度降低到與對照組濃度無明顯差異。LDH、CREA、GLU均在感染初期變化不明顯,在感染9 d后,含量均極顯著升高。BUN在感染2 d后濃度迅速下降,在感染9 d后,其濃度與對照組相比較有極顯著性差異（P＜0.01）。詳細數(shù)據(jù)見表1。

試驗二:基本驗證了試驗一的結果,試驗組錦鯉 TP、ALB、GLB、HDL、BUN 含量顯著下降,LDH、GLU、CREA含量顯著上升,均與試驗一結果一致。詳細數(shù)據(jù)見表2。

與對照組相比較,試驗組錦鯉TBIL、DBIL、TC、ALT、AST、ALP、GGT 無顯著性差異（P ＞0.05）。

2.4 組織病理切片結果 將對照組與試驗組各組織切片在光鏡下觀察,從中插彩版圖5、圖6可以看出試驗組錦鯉腦部血管擴張,管腔內充滿紅細胞;鰓小片上皮細胞變性壞死,細胞質出現(xiàn)空泡,細胞破裂,細胞核聚集,柱狀細胞腫大,細胞核濃染,上皮細胞與柱狀細胞間出現(xiàn)空隙;胰細胞腫大,細胞核淡染,部分細胞核溶解;肝臟肝孛排列紊亂,細胞質出現(xiàn)空泡,細胞核溶解,肝細胞變性壞死;脾臟各細胞C排列分散,細胞變性壞死,細胞核淡染,部分細胞核溶解;腎小管上皮細胞變性壞死,細胞核碎裂,腎間質可見濃染膨大的細胞核;肌纖維變性,部分橫紋消失,肌纖維縱裂。

表1 試驗一對照組與試驗組錦鯉的血液生化指標的比較

表2 試驗二對照組與試驗組錦鯉的血液生化指標比較

3 討論

3.1 關于攻毒試驗的成敗分析 利用本實驗室分離到的JX14-012鯉春病毒血癥病毒株配成不同梯度的攻毒液,用錦鯉作為試驗對象,設計試驗組與對照組,經腹腔注射,放于室內飼養(yǎng)缸中飼養(yǎng),隨著養(yǎng)殖時間的推移,經攻毒的試驗魚第3天開始,先后不斷地出現(xiàn)了患病癥狀、死亡,然后對其進行SVCV病原檢驗,結果顯示陽性,表明已攜帶或感染SVCV,說明攻毒試驗成功。攻毒試驗的成功進一步證明了采集到的病原體就是SVC致病病原體,而且具備有效的毒力,對確診江西省鯉春病毒病病原和病原庫建立起到了重要的見證依據(jù)。

3.2 攻毒試驗的佐證 試驗結果有利于進一步認識病情癥狀,對攻毒產生患病癥狀的魚進行生化指標檢測并與健康魚比較,進一步表明患病魚的肝胰臟、腎臟等受到嚴重損害并導致功能不全;對病魚進行組織病理切片觀察,結果發(fā)現(xiàn)腦、鰓、肝胰臟、脾臟、腎臟、肌肉各組織均出現(xiàn)不同程度的變性壞死,而對照組錦鯉均一切正常。試驗結果進一步證明以JX14-012病毒株對錦鯉進行攻毒能夠使試驗組錦鯉致病,說明該毒株感染錦鯉后可在其體內復制、增殖,且對錦鯉有一定的致病力。