貴州省豬源大腸桿菌對磺胺類抗菌藥物耐藥性及耐藥基因檢測

寇 宏,呂世明,譚艾娟,王 想,張順然,羅致茜,林 習,楊睿智

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 ,貴州 貴陽 550025;2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025）

大腸桿菌是人和動物腸道中普遍存在的一類腸道共生菌群,也是一種人獸共患病的條件致病菌群,大腸桿菌也經(jīng)常作為抗生素耐藥基因的貯存庫,在細菌耐藥性分析及耐藥基因傳遞研究方面起著非常重要的作用[1-2]。近年來,隨著規(guī)模養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展,大腸桿菌等細菌病原對于動物健康的危害日趨廣泛而復(fù)雜,這也就直接導(dǎo)致了抗菌藥物的大量使用,使細菌耐藥及耐藥基因傳遞逐漸成為廣泛關(guān)注的嚴峻問題[3-4],這給養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展埋下隱患,更為人與動物疾病的預(yù)防及治療帶來了極大的危害。

磺胺類藥物是廣譜抗菌藥,對革蘭陰性和革蘭陽性細菌均有抑菌作用[5]。自從百浪多息（Prontosil）在1935年發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物以來[6],磺胺類藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人類和動物細菌病及原蟲感染的治療[7]。由于磺胺類藥物有其獨特的優(yōu)點:（效價高、毒副作用小、口服容易吸收、性質(zhì)穩(wěn)定、國內(nèi)大量生產(chǎn)等[5-6],現(xiàn)仍在獸醫(yī)抗感染治療上發(fā)揮重要作用[8]。本研究通過對貴州省各個地區(qū)得到的66株豬源大腸桿菌,使用微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗。使用PCR方法對sul1、sul2和sul3進行了檢測,為貴州省豬大腸桿菌病的科學(xué)防控提供理論依據(jù),也為獸醫(yī)臨床磺胺類藥物的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù),從而減少或降低抗生素抗性對人類及動物健康造成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 試驗菌株由2012年從貴州省安順（9株）、銅仁（11 株）、六盤水（11 株）、遵義（11株）、畢節(jié)（13株）、黔東南（11株）6個地區(qū)的部分規(guī)?；B(yǎng)豬場采集樣本,并由貴州大學(xué)藥理實驗分離純化,保種66株豬源大腸桿菌。標準菌株大腸桿菌ATCC25922,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 藥品及試劑 磺胺嘧啶（SD）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺噻唑（ST）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）,均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;LB肉湯,購自北京奧博星生物科技有限責任公司;伊紅美蘭瓊脂（EMB）,購自上海博微生物技術(shù)有限公司;50×TAE電泳緩沖液、DM-2 000 DNA Marker、2 × Tag PCR Master Mix,均購自北京康為世紀生物科技有限公司;GoldView核酸指示劑購自Solarbio公司。

1.3 PCR擴增產(chǎn)物根據(jù)GenBank上登錄的sul1基因,利用Premier 5.0軟件設(shè)計1對sul1特異性引物,而sul2、sul3引物參照周萬蓉等[9]設(shè)計,引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（詳見表1）。

表1 sul基因引物序列

1.4 方法

1.4.1 藥敏試驗 以ATCC25922為藥敏質(zhì)控細菌,根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會CLSI 2009年版標準,采用微量肉湯稀釋法測定66株豬源大腸桿菌對5種磺胺類抗菌藥的最小抑菌濃度（MIC值）。MIC值≥512為耐藥菌株,≤256為敏感菌株。

1.4.2 sul基因檢測 細菌DNA模板的制備:參照孫碩等[10]方法采用煮沸法提取66株大腸桿菌總DNA作為模板。

PCR反應(yīng)體系:采用12 μL反應(yīng)體系,2×Tag PCR Master Mix 5 μL,DNA 模板 5 μL,上下游引物各 0.5 μL 共 1 μL,滅菌蒸餾水補足 12 μL。

PCR反應(yīng)條件與產(chǎn)物電泳:94℃ 5 min預(yù)變性,94℃ 50 s變性,56℃退火,72℃ 50 s延伸,32次循環(huán)。配制1.5%的瓊脂糖,90 V電泳40 min。在紫外照膠儀下檢測PCR產(chǎn)物。

1.4.3 擴增產(chǎn)物的序列測定 將擴增出有sul1、sul2、sul3目的條帶的可疑PCR產(chǎn)物。送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行單向測序,并與NCBI基因庫已經(jīng)登錄的sul基因進行 BLAST比對。

2 結(jié)果

2.1 貴州省66株豬源大腸桿菌藥敏試驗檢測結(jié)果

試驗菌株對磺胺類抗生素藥敏情況如表2,其中對磺胺二甲嘧啶耐藥率為93.94%,其次是磺胺甲噁唑和磺胺噻唑分別為86.36%、89.39%,磺胺間甲氧嘧啶和磺胺嘧啶分別為84.85%、80.30%。試驗菌株對5種磺胺類抗生素中的耐藥率均超過50%。表明貴州省豬源大腸桿菌對磺胺類藥物耐藥現(xiàn)象十分嚴重。

表2 66株大腸桿菌對5種藥物的耐藥情況

2.2 sul基因PCR檢測結(jié)果 3種sul耐藥基因的陽性擴增片段如下圖1所示。所擴的片段大小與目的片段相一致,將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測序,所測序結(jié)果與GenBank上登錄的sul基因序列BLAST比較結(jié)果,其同源性均達到99%。表明擴增產(chǎn)物為3個sul基因。

圖1 sul基因PCR擴增結(jié)果

2.3 貴州省66株豬源大腸桿菌耐藥基因檢測結(jié)果 通過PCR方法對66株豬源大腸桿菌進行sul1、sul2及sul3三種基因的檢測（表3）。試驗結(jié)果顯示,3個耐藥基因的檢出率為100%（66/66）。其中sul1的檢出率為 89.4%（59/66）,sul2的檢出率為77.3%（51/66）,sul3 的檢出率為 100% （66/66）。只同時攜帶sul1和sul2的菌株檢出率為0（0/66）,只同時攜帶sul1和sul3的菌株檢出率為15.2%（5/66）。只同時攜帶sul2和sul3的菌株檢出率為3.0%（2/66）。同時攜帶sul1、sul2和sul3的菌株檢出率為74.2%。

表3 66株大腸桿菌中磺胺類藥物主要耐藥基因的分布

2.4 耐藥表型與耐藥基因攜帶的關(guān)系 由表4可知,sul3基因的攜帶率為100%,sul1+sul2+sul3基因型的檢出率在73%以上,對磺胺間甲氧嘧啶耐藥的大腸桿菌此類型基因攜帶率為81%,因此,此類基因的攜帶在耐磺胺類藥物的大腸桿菌中起主要作用,與菌株的耐藥性關(guān)系明顯。sul1、sul2基因型的單獨檢出率為0,sul3的單獨檢出率最高為8%,最低為4%;基因型和 sul1+sul2、sul1+sul3、sul2+sul3最高檢出率分別為0、16%、4%。

表4 耐磺胺類藥物的大腸桿菌耐藥表型與耐藥基因檢出情況比較

3 討論

3.1 抗菌藥物至今僅僅使用了70多年,很多曾經(jīng)可以輕易治療的細菌感染性疾病現(xiàn)在已經(jīng)很難治療。很多曾經(jīng)可以用一種藥物治療的傳染病目前已經(jīng)成為嚴重的公共衛(wèi)生安全問題[11]。耐藥性,特別是多重耐藥菌的不斷出現(xiàn),給人和動物的治療帶來極大的困難[12]。

由藥敏試驗結(jié)果可知,66株豬源大腸桿菌對5種磺胺類藥物:磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧、磺胺噻唑、磺胺甲噁唑、磺胺間甲氧嘧啶的耐藥百分率分別為84.85%、93.94%、86.36%、89.39%、80.30%,此結(jié)果表明,貴州省各地區(qū)磺胺類藥物耐藥十分嚴重。與王紅寧等[13]研究四川規(guī)模化豬場分離的大腸桿菌對磺胺類藥物耐藥率26.1%相比,明顯上升;與劉開成等[14]從山東、內(nèi)蒙古、山西分離到的161株豬源大腸埃希菌對磺胺異噁唑（SF）和新諾明（SMZ）的耐藥率分別為91.30%和90.06%,基本一致;與沈憲文等[15]分析吉林省部分地區(qū)仔豬大腸桿菌耐藥性對磺胺異噁唑（SF）耐藥率89.55%,對新諾明（SMZ）耐藥率86.57%相比,基本相一致。與植嬋萍等[16]報道的種鵝大腸桿菌對于磺胺類藥物復(fù)方新諾明的耐藥率在90%以上,基本一致。都表現(xiàn)出極高的耐藥水平。大腸桿菌對磺胺藥的耐藥率呈明顯的上升趨勢,一方面是由于藥物長期、大量、不合理的使用[17-18]。另一方面由于磺胺類藥物耐藥基因主要位于質(zhì)粒上,細菌通過質(zhì)粒在細菌間不斷的傳遞[19-20]。

3.2 耐磺胺類藥物大腸桿菌體內(nèi)sul基因可通過轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和整合子在細菌間傳遞,該基因編碼可替代性的、對磺胺類藥物親和力更低的新二氫葉酸合成酶并高水平表達,從而導(dǎo)致細菌對磺胺類藥物的抗性[21]。目前發(fā)現(xiàn)的磺胺類耐藥基因sulR主要是sul1、sul2、sul3[22]。本試驗首次對貴州省各地區(qū)臨床分離的大腸桿菌進行了磺胺類藥物耐藥基因sul1、sul2、sul3分子檢測的研究。結(jié)果表明,磺胺類藥物耐藥基因普遍存在于貴州省各地區(qū)的耐磺胺類藥物的大腸桿菌中,sul2總的檢出率為77.3%,此結(jié)果與sul2基因在豬源大腸桿菌中分布是最廣泛的,在大腸桿菌對磺胺藥物耐藥性方面的研究具有重要的意義[21]結(jié)論相似。也說明sul2基因是豬源大腸桿菌對磺胺類藥物耐藥的主要決定簇[23]。在Perrten V等[24]的研究中,sul3基因的檢出率占sulR基因的三分之一,而在本試驗中sul3的檢出率為100%,與前者相比sul3的檢出率有所上升。說明sul3基因在耐磺胺藥菌株中所占比重有所上升。其中最主要的磺胺耐藥基因同時攜帶兩種基因型的菌株為18.2%,同時攜帶3種基因型的菌株為74.2%。由此可見,磺胺類耐藥基因在貴州省各地區(qū)廣泛存在,應(yīng)給予足夠的重視。并且本試驗檢測的磺胺類耐藥基因攜帶率比較高,究其原因可能耐藥基因是通過質(zhì)?；蛉旧w進行了水平散播,有待深入研究加以證實。