脊髓灰質(zhì)炎病毒I型單克隆抗體的制備

王朝元，唐永洪，黃 圣，尹玉瑩，楊繼紅

(1 中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074；2 華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430079)

脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus，PV)，簡稱脊灰病毒，是引起脊髓灰質(zhì)炎的病原，其屬于小RNA病毒科(Picornavirales)腸道病毒屬(Enterovirus)[1].脊灰病毒RNA基因組為單股正鏈RNA，其RNA分子量為2.41×108.1981年P(guān)V I型的Mahoney 疫苗株的RNA全序列首次被測定；我國科研工作者分別在2009年和2011年對PV I，III型的基因組結(jié)構(gòu)特征進行了分析[2].PV感染機體引起脊髓灰質(zhì)炎，主要是通過侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成弛緩性肌肉麻痹(AFP)，可引起患者機體出現(xiàn)隱性感染或亞臨床感染(占90%)、頓錯型感染(占10%)，以及少數(shù)嚴重感染.自1988年通過了由WHO提出“2000年全球消滅脊髓灰質(zhì)炎”的決議[3]以來，全球脊髓灰質(zhì)炎流行國家從125個減少至2018年的2個(巴基斯坦和阿富汗)，脊炎病例由35 萬例減至2018年的11例，減少了99%以上[4].

為逐漸完成消滅脊髓灰質(zhì)炎，世界各國正積極采用口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗(OPV)和滅活疫苗(IPV)預(yù)防疾病.世界衛(wèi)生大會2012年制定了《消滅小兒麻痹癥和最后階段戰(zhàn)略計劃(2013—2018)》[5].病毒的單克隆抗體在脊灰病毒流行病學(xué)監(jiān)視、疫苗免疫水平評估等臨床醫(yī)學(xué)以及病毒生物學(xué)研究等領(lǐng)域都具有十分重要的意義.

本文以純化的脊灰病毒Sabin疫苗株I型免疫小鼠，取其脾細胞與SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞進行細胞融合，獲得了一株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞，為脊髓灰質(zhì)炎病毒的體外檢測和臨床應(yīng)用等提供了實驗基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

DMEM 高糖培養(yǎng)基(Hyclone)；1×PBS、青霉素-鏈霉素溶液(Hyclone)；胎牛血清(GIBICO)；PEG 6000(Biosharp)；HEPES、100 mmol/L丙酮酸鈉、50×HAT&HT培養(yǎng)基添加劑、50% PEG溶液、P7181-5X5ML(Sigma-Aldrich)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012，上海碧云天)；QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2-Dye Plus試劑盒(Ta-KaRa).

細胞過濾器(70 μm，F(xiàn)ALCON Corning, USA)；96孔酶標板(Costar)；超高速離心機(CP100MX，rotor：P40ST-1520，Hitachi)；酶標儀(BioTek Instruments，Inc)；CO2培養(yǎng)箱(MCO-15AC，SANYO Electric Biology Co，Ltd)；生物安全柜(BHC-1300II B2，蘇州安泰空氣技術(shù))；TC型基因擴增儀[TC-96/G/H(b)C，杭州博日科技].

1.2 細胞、病毒和動物

非洲綠猴腎細胞Vero由華中師范大學(xué)楊繼紅教授惠贈，10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)；小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0-Ag14)購自武漢大學(xué)保藏中心，20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)[6]；脊髓灰質(zhì)炎病毒Sabin疫苗株(I, II, III型)由武漢生命科技股份有限公司提供；SPF級Balb/c小鼠購自湖北省實驗動物研究中心，于中南民族大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng).

1.3 脊灰病毒增殖與效價測定

取脊灰Sabin株毒種液，無血清DMEM稀釋10倍，取1 mL接種于Vero細胞培養(yǎng)瓶，5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中吸附60 min，棄上清，加入2%DMEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察細胞病變(CPE).待CPE達到80%以上，反復(fù)凍融3次(-20 ℃冷凍、室溫或37 ℃解凍)使細胞裂解，收獲病毒原液S0，-80 ℃保存?zhèn)溆?

取一塊長滿Vero細胞的96孔培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗3次.將上述80 ℃病毒原液用無血清DMEM 10倍稀釋10-1～10-11，每孔100 μL，每個稀釋度設(shè)8個復(fù)孔，最后一列設(shè)置為正常細胞對照組，病毒吸附1 h后，每孔補加100 μL 2%維持液，繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察CPE，按照Reed-Muench[7]公式計算TCID50.

1.4 脊灰病毒分子鑒定

脊灰病毒RNA提取按照QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒操作說明進行.脊灰病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄擴增(RT-PCR)參考安軍靜[2]的方法，采用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)試劑盒.擴增片段為脊灰病毒RNA的結(jié)構(gòu)蛋白VP1編碼區(qū)，上游引物UG1 (2402-2421)：5′-TTTGTGTCAGCGTGTAATGA-3′；下游引物UC11 (3885-3504)：5′-AAGAGGTCTCTATTCCACAT-3′.引物設(shè)計模板為Human poliovirus 1 strain Sabin 1, complete genome (GenBank: AY184219.1).逆轉(zhuǎn)錄擴增反應(yīng)程序為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min; PCR擴增29個循環(huán)(94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s)，72 ℃退火80 s，4 ℃保溫.用1.7%瓊脂糖凝膠電泳分析條帶，120 V恒定電壓電泳約30 min，凝膠放入含溴化乙錠的溶液中染色約5 min，于凝膠成像儀觀察凝膠條帶.

1.5 脊灰病毒純化

參照王三應(yīng)等[8]方法進行病毒純化：取上述-80 ℃保存的病毒原液，于4 ℃下4000 r/min離心30 min，除去細胞碎片，上清液中緩慢加入400 g/L的PEG6000至終濃度為70 g/L，加入時攪拌均勻，調(diào)整pH至7.5，4 ℃過夜后于4 ℃下8000 r/min離心30 min，棄上清，用1 mL PBS重懸沉淀，將此病毒濃縮液平鋪在質(zhì)量分數(shù)為15%～50%蔗糖液上，于4 ℃、284000 g離心2 h.注射器吸收法分段收集蛋白梯層，溶解于PBS中，測定各梯層在260，280 nm處的OD值.再將病毒蛋白層在12%分離膠、5%濃縮膠中進行SDS-PAGE電泳.

1.6 Balb/c小鼠免疫

取125 μL純化的病毒抗原，再移取125 μL弗氏完全佐劑，于漩渦混合儀上至抗原完全乳化，腹腔注射SPF級的Balb/c小鼠(6～8周齡，雌性)，每隔2周進行1次腹腔注射(免疫3次)，在細胞融合前3天選取效價達到1∶6000以上的小鼠，用弗氏不完全佐劑混合的等量抗原進行腹腔注射加強免疫.

1.7 細胞融合

細胞融合參考Milstein C 等[9]，具體如下：取經(jīng)過免疫后血清中脊灰病毒I型抗體效價達到1∶6000以上的小鼠，無菌操作制備免疫脾細胞；經(jīng)過8-氮鳥嘌呤(20 μg/mL)培養(yǎng)除去返祖的HGPRT+骨髓瘤細胞，融合時使骨髓瘤細胞達到對數(shù)生長期，制備SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞.將SP2/0-Ag14細胞懸液與脾細胞按1∶2～1∶10比例混合，利用50% PEG 1450進行融合，融合后用20%胎牛血清的1×HAT培養(yǎng)液重懸，以每孔2×104個脾細胞接種于每孔(2～5)×104個小鼠腹腔巨噬細胞的96孔飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)板中，5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合后每隔3 d換100 μL 20%胎牛血清的1×HAT培養(yǎng)液，第3次后換20%胎牛血清的1×HT培養(yǎng)液培養(yǎng).

1.8 抗體篩選

用方陣滴定試驗(Square matrix)確定選擇上述純化病毒抗原的最佳包被濃度，用間接ELISA篩選脊灰病毒Sabin株I型抗體[8].具體步驟如下：用1×抗原包被液稀釋純化的脊灰病毒Sabin株I型(0.1 mg/mL)，酶標板每孔加100 μL，在濕盒中37 ℃孵育2 h，或4 ℃過夜；甩去包被液，每孔加200 μL的5% BSA封閉液，于37 ℃孵育1 h；甩去封閉液，每孔加300 μL的1×PBST浸泡5 min，重復(fù)4次；每孔加100 μL雜交瘤上清夜(一抗)，室溫孵育1 h；PBST洗4次，每孔加100 μL羊抗小鼠IgG-HRP抗體(用PBST進行1∶5000稀釋)，室溫孵育1 h；PBST洗4次，每孔加100 μL TMB顯色液(現(xiàn)配現(xiàn)用A, B液混合)，室溫避光靜置20 min顯色；每孔加100 μL 1 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，用酶標儀在450 nm處波長測定吸光度值.以未免疫健康SPF級同齡雌性Balb/c小鼠的血清為陰性對照，以免疫脊灰病毒Sabin株I型抗原的Balb/c小鼠的血清為陽性對照.抗體陽性雜交瘤細胞的判斷依據(jù)：雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液與陰性對照P/N值≥2.1時，判定為陽性雜交瘤孔.

1.9 雜交瘤細胞克隆

利用有限稀釋法克隆陽性孔雜交瘤細胞.用20%胎牛血清的1×HT培養(yǎng)液對雜交瘤細胞進行10倍梯度稀釋，1個陽性雜交瘤細胞/孔的密度，接種于每孔(2～5)×104個小鼠腹腔巨噬細胞的96孔飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)板中，飽和濕度5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至少連續(xù)進行2次克隆化培養(yǎng)，直至雜交瘤細胞克隆陽性孔比率達到100%為止.

1.10 單克隆抗體的制備

采用細胞培養(yǎng)法制備單克隆抗體.將克隆化穩(wěn)定的抗體陽性雜交瘤細胞于細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待鋪滿細胞瓶80%時，換無血清DMEM培養(yǎng)至細胞脫落，收集細胞懸液于離心管中，室溫下500 g離心10 min；棄沉淀，收集上清分裝，放于-80 ℃下保存?zhèn)溆?

1.11 效價測定

利用上述間接ELISA測定雜交瘤細胞單抗上清液的效價，同時用微量中和試驗法測定雜交瘤細胞單抗上清液的中和抗體效價.

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

對不同濃縮倍數(shù)下病毒液效價的測定結(jié)果，采用t-檢驗法(student’st-test)進行顯著性差異分析，P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示極顯著差異.

2 結(jié)果

2.1 細胞病變

正常Vero細胞為貼壁細胞，單層細胞時排列緊密有規(guī)則，形態(tài)清晰(見圖1a)；接種脊灰病毒Sabin株I型96 h后細胞完全CPE，細胞折光性增強，胞內(nèi)顆粒增多，細胞收縮，由梭形逐漸變?yōu)閳A形，細胞間只有纖細的細胞間橋連接，細胞單層出現(xiàn)拉網(wǎng)結(jié)構(gòu)，融合成片(見圖1b).

a)正常細胞形態(tài)；b)細胞完全病變形態(tài)圖1 脊灰病毒致細胞病變效應(yīng)Fig.1 CPE of poliovirus

2.2 效價測定

將收獲的病毒原液經(jīng)過PEG濃縮后，測定每個批次病毒效價. 第1 ～6 d，I型脊灰病毒原液的效價和濃縮毒液的效價存在顯著差異.終點效價，其中I型10倍和500倍濃縮毒液的效價均顯著高于原液的效價(P<0.05, 見圖2).

與I型原液相比，*P<0.05，**P<0.01，n=3圖2 脊灰病毒I型效價測定Fig.2 Titer determination of poliovirus type I

2.3 脊灰病毒Sabin株I型VP1基因的擴增

針對I型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的編碼區(qū)設(shè)計的引物UG1和UC11，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增后，產(chǎn)生約1100 bp的特異性產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在1100 bp處各有一條明亮的脊灰病毒VP1基因的特異性條帶，460 bp處為試劑盒陽性對照條帶，1100 bp處為目的條帶(見圖3)，其表明逆轉(zhuǎn)錄擴增成功，初步確定病毒為脊髓灰質(zhì)炎病毒.

M)DNA標準品；PC)陽性對照；1,2,3) I型脊灰病毒樣品 圖3 脊灰病毒Sabin株I型VP1基因RT-PCR擴增產(chǎn)物Fig.3 RT-PCR amplification product of VP1 gene from poliovirus Sabin type I

2.4 病毒純化蛋白含量及SDS-PAGE圖譜

經(jīng)過蔗糖(質(zhì)量比為15%～50%)密度梯度離心，及50%, 30%蔗糖墊層離心后，培養(yǎng)的脊灰病毒純化效果一般，其蛋白含量為2.764 mg/mL.脊灰病毒的3種結(jié)構(gòu)蛋白VP1, VP2, VP3在SDS-PAGE圖譜上可見分子量分別為35 , 28, 24 KDa.

M)蛋白標準品；1)純化病毒的衣殼蛋白圖4 純化脊灰病毒衣殼蛋白SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE result of VPs from purified poliovirus

2.5 細胞融合及陽性雜交瘤細胞建株

細胞融合后，第3 d出現(xiàn)幾個渾圓透亮正在生長的雜交瘤細胞；第5～6 d 出現(xiàn)多個成葡萄串狀分布的融合細胞集落；生長至第8 d時，融合細胞集落繼續(xù)長大，有肉眼可見針尖樣大小的集落；約第12 d，細胞集落可布滿每孔1/3～1/2的面積，培養(yǎng)液顏色呈黃色，此時可進行抗體篩選(見圖5).共進行6次細胞融合，鋪29塊96孔細胞培養(yǎng)板，6次的細胞融合率分別為15.63%, 3.12%, 66.49%, 33.33%, 46.65%, 14.21%；篩選到8株陽性雜交瘤細胞，經(jīng)過3次有限稀釋克隆化后，得到1株穩(wěn)定分泌脊灰病毒I型抗體的雜交瘤細胞株G8G7.

a) 3 d；b) 5 d；c) 8 d；d) 12 d圖5 細胞融合后培養(yǎng)不同時間的雜交瘤細胞克隆Fig.5 Hybridoma cell clones cultured at different time after cell fusion

2.6 單克隆抗體效價測定

通過細胞培養(yǎng)法制備的脊灰病毒I型抗體，按2倍連續(xù)稀釋2-1～2-4，利用間接ELISA測定其效價為1∶8(見表1).再通過中和試驗，固定100TCID50/0.1mL病毒PV-I與2-1～2-12稀釋度單抗上清中和后感染單層Vero細胞，以Reed-Muench公式計算抗體效價，其中和抗體效價為1∶58.此外利用此抗PV-I單抗上清與病毒PV-II中和實驗，結(jié)果顯示實驗組2-1～2-12稀釋度的Vero細胞病變率達到100%，說明抗PV-I單抗與PV-II之間無交叉反應(yīng).

表1 間接ELISA法測定單克隆抗體效價Tab.1 Determination of monoclonal antibody titer by indirect ELISA

3 討論

自César Milstein和Georges K?hler兩位科學(xué)家[10]1975年利用細胞融合技術(shù)開創(chuàng)了單克隆抗體技術(shù)以來，該技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得了了廣泛應(yīng)用.單克隆抗體具有單一生物活性、特異性強、質(zhì)量控制方便等許多優(yōu)點，而利用常規(guī)方法制備的脊灰病毒多抗血清，性質(zhì)常不均一；脊灰病毒單克隆抗體對于脊灰病毒流行病學(xué)監(jiān)視、疫苗免疫水平評估、衍生型病例研究具有重要意義.

1981年Osterhaus等[11]制備了Sabin株3種血清型的單克隆抗體，兩種針對PV-I的中和單克隆抗體顯示出與VP1的選擇性免疫沉淀，表明VP1是體內(nèi)誘導(dǎo)中和抗體的重要多肽.1982年Morag Ferguson等[12]利用脊灰病毒Sabin株III型為抗原制備了單克隆抗體，通過中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗得到9株分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株.PD Minor等[13]制備了針對Saukett株III型的特異性單克隆抗體，并用單向酶擴散法(SRD)分析該單抗與I，II型之間未有免疫交叉反應(yīng).2015年，制備具有治療性的A21單克隆抗體，其可中和針對I型和II型野生型和疫苗型脊髓灰質(zhì)炎病毒，同時不干擾對脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的免疫應(yīng)答，并且對抗脊髓灰質(zhì)炎病毒藥物的病毒株產(chǎn)生有效抑制[14].在國內(nèi)，唐恩華[15]于1991年利用脊灰病毒的3種血清型單克隆抗體開發(fā)了兩套試劑盒，用于脊髓灰質(zhì)炎病毒毒株間的差異和抗原變異的研究及疫苗株與野毒株的鑒別，具有高度特異性，可快速、簡便、敏感地進行病毒病原學(xué)診斷.褚學(xué)者[16]于2006年制備了Sabin株II型D抗原的單抗，ELISA測得其腹水抗體效價為1∶2.4×106，微量中和試驗測得中和抗體效價為1∶1.3×104；李樹香[17]2010年制備了抗脊灰病毒I型D抗原的單克隆抗體；張春梅[18]2014年成功制備了抗PV II, III且不與C抗原交叉反應(yīng)的D抗原單克隆抗體.這些研究為脊灰病毒抗原檢測試劑盒的研制建立了基礎(chǔ)，為疫苗質(zhì)量檢測提供了有效的手段.

本研究成功獲得了為抗脊灰病毒Sabin株I型D抗原單克隆抗體，通過細胞培養(yǎng)法制備的單克隆抗體，其抗體效價為1∶8，中和效價為1∶58，同時此抗PV-I單抗與PV-II之間無交叉反應(yīng)；說明該單克隆抗體為抗PV-I型特異性單克隆抗體.此抗脊灰病毒Sabin株I型雜交瘤細胞的建立，為脊髓灰質(zhì)炎病毒的體外檢測等提供了良好的基礎(chǔ).