樹鼩糞便中病毒三種濃縮方法的效果比較*

陳玲霞 尹博文 苗雨潤 宋慶凱 李曉飛 代解杰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，樹鼩種質(zhì)資源中心，昆明 650118)

腸道食源性病毒傳播途徑為傳染源-糞便-水體或食品-人，根據(jù)其致病類型可將其分為3種:引起胃腸炎的病毒，如杯狀病毒、輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒；肝炎病毒，包括甲肝病毒，戊肝病毒；引起其他疾病類型的病毒，如腸道病毒[1]。糞便污染水質(zhì)樣本，經(jīng)水傳播病毒導(dǎo)致人體感染的病例時(shí)有報(bào)道，已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注[2-3]。對糞便中的病毒進(jìn)行快速有效的檢測，是阻斷病原體傳播的關(guān)鍵。高通量測序技術(shù)能夠快速地鑒定出標(biāo)本中存在的病毒,已形成了一門研究特定環(huán)境中病毒群落的新興學(xué)科：病毒宏基因組學(xué)。但由于野生樹鼩糞便中所含病毒豐度通常很低，而病毒宏基因組學(xué)需要獲得足夠的病毒核酸用于測序，為保證檢測結(jié)果的質(zhì)量，需要對樹鼩糞便中的病毒進(jìn)行預(yù)先富集濃縮。病毒的富集方法繁多，主要包括超濾法、吸附洗脫法、絮凝沉淀法等。病毒富集方法的選擇與樣品類型有關(guān)，國內(nèi)外多數(shù)用于水體中病毒的濃縮富集，Rutjes等[4]使用膜吸附洗脫法濃縮水樣病毒，Shah等[5]利用PEG沉淀病毒結(jié)合超聲分離以濃縮火雞腸道組織的病毒，John等[6]采用鐵離子絮凝的化學(xué)方法濃縮富集海洋病毒；國內(nèi)寇曉霞等[7]采用三氯化鋁和膜吸附法研究了不同水體的病毒濃縮回收率，徐露等[8]比較了鈣離子法、牛肉湯洗膜法和載陽電荷濾料法對水體中病毒的濃縮效果。目前暫無研究報(bào)道針對糞便樣品中的病毒濃縮方法。鑒于糞便樣品的雜質(zhì)含量多，超濾和膜吸附等方法容易堵塞，所以本文選擇沉淀濃縮病毒的方法，即PEG沉淀結(jié)合超聲分離法、鐵離子絮凝的化學(xué)方法和GBviroFast病毒濃縮試劑盒等三種病毒濃縮方法。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測含有指示病毒TRV的模擬糞便上清，評價(jià)這三種病毒濃縮方法用于糞便中病毒濃縮的效果，為進(jìn)行腸道病毒宏基因組學(xué)研究選擇最佳的病毒富集濃縮方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生馴化樹鼩，來源于醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心[SCXK(滇)K2013-0001]。實(shí)驗(yàn)操作在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(滇)K2013-0001]。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑

試劑：PBS(購自Thermo)、生理鹽水(購自四川科倫藥業(yè))、PES膜過濾器(購自Millipore)、PEG-6000(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、Fecl3·6H2O(購自BBI Life Sciences)、GBviroFast病毒濃縮試劑盒、QIAamp Viral RNA Mini Kit、TaKaRa One Step PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)、TRV為指示病毒(本實(shí)驗(yàn)室分離保存)。

儀器：CJJ78-1磁力加熱攪拌器、JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、CT15RE低溫離心機(jī)、CFX96TMReal-Time PCR Detection System擴(kuò)增儀。

1.3 方法

1.3.1加標(biāo)糞便上清的制備:采取野生馴化樹鼩的新鮮糞便30份于40個(gè)EP管中，加PBS 1 mL/管，充分渦旋混勻，12 000 r/min離心30 min，取上清，經(jīng)0.45、0.22 μm PES膜進(jìn)行過濾，得濾液30 mL，分成3份，每份10 mL糞便上清加入TRV懸液140 μL。

1.3.2病毒濃縮方法

1.3.2.1 PEG-6000沉淀結(jié)合超聲分離法:按W/V8%加PEG-6000至配置好的10 mL糞便上清，4 ℃攪拌過夜，12 000 r/min于4 ℃離心30 min，收集沉淀，4 ℃保存，上清經(jīng)PEG-6000重復(fù)沉淀，將兩次收集的沉淀懸浮于500 μL的冷生理鹽水；對懸液進(jìn)行超聲5 min，超聲5 s、停歇5 s、30個(gè)循環(huán)，超聲后經(jīng)12 000 r/min離心5 min，沉淀PEG顆粒，將上清移至新EP管。

1.3.2.2 鐵離子絮凝法:取4.83 g Fecl3·6H2O加至1 L蒸餾水，配置成Fe3+濃度為1 g/L的溶液；取配置的溶液10 μL加入配置好的10 mL糞便上清，F(xiàn)e3+終濃度為1 mg/L，充分混勻，4 ℃過夜；12 000 r/min于4 ℃離心30 min，收集沉淀，將沉淀懸浮于500 μL生理鹽水中。

1.3.2.3 GBviroFast病毒濃縮試劑盒：取3.3 mL GBviro Precipitation Buffer與配置好的10 mL糞便上清混合(體積比1∶3)，上下顛倒混勻，4 ℃過夜，12 000 r/min離心30 min，收集沉淀，沉淀懸浮于500 μL生理鹽水中。

1.3.3病毒RNA的提取:按照QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒的說明書進(jìn)行操作。分為四組，取TRV病毒懸液、PEG沉淀結(jié)合超聲分離法濃縮的糞便上清、鐵離子絮凝法濃縮的糞便上清以及GBviroFast病毒濃縮試劑盒濃縮的糞便上清各140 μL進(jìn)行病毒RNA的提取，每組提取三份病毒RNA。

1.3.4TaqMan 熒光定量RT-PCR方法檢測病毒載量:采用前期本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[9]，對TRV病毒懸液和稀釋濃縮后的樣品進(jìn)行病毒載量的檢測。

2 結(jié)果

2.1 TRV RNA標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋，采用已建立的熒光定量RT-PCR的檢測方法，利用5.13×106、5.13×105、5.13×104、5.13×103、5.13×102等濃度梯度，經(jīng)過3次重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2均接近0.999，重復(fù)性良好(圖1、圖2)。

圖1 TaqMan熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 TaqMan熒光定量RT-PCR擴(kuò)增曲線

2.2 TRV樣本和稀釋后濃縮樣本的病毒載量

對TRV病毒懸液、糞便上清稀釋后經(jīng)PEG沉淀結(jié)合超聲分離法濃縮的樣品、鐵離子絮凝法濃縮的樣品以及GBviroFast病毒濃縮試劑盒濃縮的樣品，即各組的三份病毒RNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，根據(jù)Ct值計(jì)算出樣品的初始模板量(表1)。

圖3 TaqMan熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 TRV病毒濃縮率的計(jì)算

根據(jù)TRV病毒懸液和糞便上清稀釋后經(jīng)濃縮方法的濃縮效率(表2)。經(jīng)濃縮方法得到的樣本量為500 μL，而提取RNA采用的體積量為140 μL，即濃縮得到的TRV病毒量=定量PCR測得的TRV病毒量×500÷140。

表1 三種濃縮方法的病毒拷貝數(shù)

表2 三種方法的濃縮效率

3 結(jié)論

糞便中病毒濃縮效果決定了病毒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，采用高效穩(wěn)定的濃縮方法直接影響到病毒的檢測結(jié)果。目前常用的病毒濃縮方法有超速離心、超濾濃縮、密度梯度離心、吸附洗脫等[10-14]，各方法濃縮病毒的原理和所用材料不同，故而使?jié)饪s效果存在明顯的差異。本文采取的PEG沉淀結(jié)合超聲分離法、鐵離子絮凝法以及GBviroFast病毒濃縮試劑盒三種方法的濃縮糞便上清中的病毒，不需要受限于樣本的雜質(zhì)含量。本實(shí)驗(yàn)中對指示病毒TRV經(jīng)糞便上清稀釋后濃縮的樣本與TRV病毒懸液的病毒載量進(jìn)行比較，通過熒光定量RT-PCR直接檢測，計(jì)算各濃縮方法的回收率。

目前有鋁離子絮凝、鈣離子絮凝以及鐵離子絮凝等方法用于水體中病毒的濃縮[6，15-16]。鐵離子絮凝法是新型的病毒濃縮方法，鐵離子形成的膠體能吸附和包裹水體中的病毒并形成絮凝，可通過濾膜截留或者直接離心沉淀，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、效果穩(wěn)定、快速。Hurwitz等[17]結(jié)果顯示，三氯化鐵濃縮得到的病毒/細(xì)菌的平均比約為2.2，優(yōu)于切向流過濾TFF濃縮。該法一般用于海洋、飲用水等水體中病毒的濃縮，此次用于樹鼩糞便上清，效果較佳，其病毒回收效率達(dá)49.57%。相比John等[6]濃縮富集海洋病毒采取的鐵離子絮凝法中通過濾膜截留絮凝，本文直接離心沉淀的操作更簡單方便。GBviroFast病毒濃縮試劑盒用于糞便上清的病毒回收效率為26.12%，可能由于糞便上清雜質(zhì)較多，回收效率并不理想。PEG沉淀病毒[18-19]是經(jīng)典的病毒沉淀方法，Colombet等[20]采用PEG濃縮純化浮游生物病毒，Shah等[5]利用PEG沉淀濃縮腸道組織病毒，進(jìn)行超聲分離，獲得病毒上清，經(jīng)超高速離心而達(dá)到二次濃縮。由于糞便上清并不是組織細(xì)胞，超聲破碎不能獲得細(xì)胞內(nèi)病毒，并且此次實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行二次濃縮，病毒濃縮效率僅為6.13%。從上述三種濃縮方法的病毒回收效率可以看出，濃縮方法還有待優(yōu)化，可以嘗試將兩種方法或多種方法結(jié)合，相互補(bǔ)充，以達(dá)到更高的病毒濃縮效率，如何實(shí)現(xiàn)樣本濃縮的高效穩(wěn)定，需要進(jìn)一步摸索探討。