月季花紅色素提取條件的優(yōu)化

張思博，趙 陽，李 杰，李 斌，羅建成

(南陽理工學院生物與化學工程學院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南南陽 473004)

月季花(Chinese Rose)別名有月月紅、四季花。原產(chǎn)于我國，素有“花中皇后”的美譽。根據(jù)醫(yī)藥及藥草類古籍中對月季花的記載，月季花的花瓣和花根經(jīng)研磨后可入藥，歸肝經(jīng)，其性味為甘，溫。可以活血調(diào)經(jīng)，疏肝解郁。月季花中的紅色素是一類天然植物色素類活性物質(zhì)，主要為花青素。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，花色素可以降低血液的粘稠度，疏通血管，改善血液循環(huán)，促進人眼視網(wǎng)膜細胞中的視紫質(zhì)的再生成從而達到預防近視增強視力的作用;花青素可以穩(wěn)定大腦組織，使大腦不受有害物質(zhì)的傷害;花青素具有清除自由基的作用，從而讓癌細胞無法順利擴散，所以可以避免更多健康的細胞被癌細胞所侵蝕。因此，以花青素作為功能性成分的藥物對于癌癥的治療有著很好的積極作用［1］。色素類化合物的提取方法有:針對脂溶性色素用有機溶劑提取法，常使用的有機提取溶劑有乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、石油醚、乙酸乙酯等;利用植物體內(nèi)生物多種活性物質(zhì)與堿的不同作用常用堿提取法［2］;超臨界二氧化碳流體萃取方法是一種新型針對物質(zhì)分離、精制技術(shù)，使用這種方法所得到的產(chǎn)品沒有毒性、沒有溶劑殘留，不僅經(jīng)濟還是一種環(huán)境友好型的萃取技術(shù)［3］。利用超聲波產(chǎn)生的強烈振動、極高的加速度、強烈的空化效應、攪拌作用等加速藥物有效成分進入溶劑，可以提高提取率，并且不存在溫度對該技術(shù)的影響［4－7］。飽含天然色素類化合物的月季花，是開發(fā)天然抗氧化活性物質(zhì)的天然金庫。該研究課題可為大規(guī)模生產(chǎn)天然色素類活性物質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎，至今未見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

月季花花瓣(采摘于河南南陽理工學院藥用植物園)。

1.2 實驗儀器

FW－100高速萬能粉碎機:北京中興偉業(yè)儀器有限公司;HHS－6電熱恒溫水浴鍋:上海躍進儀器有限公司;101－2A型電熱鼓風干燥箱:天津市泰斯特儀器有限公司;721 N可見分光光度計上海精752N紫外－可見分光光度計:上海精密科學儀器有限公司;SCIENTZ－ⅡD型超聲波細胞粉碎機:上海珂淮儀器有限公司。

1.3 實驗試劑

花青素(紅色素)標準品(中國藥品生物制品檢定所);甲醇(AR)、乙醇(AR)、乙醚(AR)、石油醚(AR)、乙酸乙酯(AR)、正丙醇(AR)、正丁醇(AR)，天津市德恩化學試劑有限公司。

1.4 月季花紅色素提取工藝

月季花花瓣清洗→干燥→粉碎→水浴提取→超聲處理提取→離心→定容→稀釋→測定含量。

1.5 月季花紅色素標準曲線繪制

精確稱取花青素標準品0.6500g，使用95%濃度的乙醇溶液于25mL容量瓶中進行定容，得到濃度為0.026g/mL的紅色素標準液，精密吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 的紅色素標準液分別于七個潔凈的10mL容量瓶中，然后用95%乙醇溶液于10mL容量瓶中進行定容，充分振蕩后靜置10min，在可見分光光度儀上520nm處測吸光度值，繪制曲線。

1.6 樣品的測定及提取率的計算

1.6.1 樣品測定方法［8－12］

將月季花色素提取液離心處理，使用50mL容量瓶對提取液進行定容，用移液管精確吸取定容溶液10mL于刻度試管中，再使用移液管于刻度試管中精確吸取溶液1.0mL于10mL刻度試管中，稀釋10倍，最后用95%乙醇溶液于10mL容量瓶中進行定容，充分振蕩后靜置10min，在可見分光光度儀520nm處測吸光度值。

1.6.2 色素提取率的計算

由標準曲線可以推導出標準曲線方程:x=(y+0.0066)/0.0507

y:吸光度值。

x:計算得到的色素提取物的濃度。

提取率=(色素提取物的濃度×提取液體積)/月季花花瓣粉末的重量×100%

在吸光度測量時將提取液稀釋10倍，則推導出月季花紅色素含量的計算公式為:

色素含量(g/100g)=(色素濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù))/樣品鮮重(或干重)

即:η%=(x×1 mL×10)/1000/1 g×100(g/100 g)

2 結(jié)果與分析

2.1 色素標準曲線的繪制

不同濃度的色素標準液在520nm處測吸光度值如圖1所示。

圖1 不同濃度色素標準品在520 nm處標準曲線

根據(jù)圖1中數(shù)據(jù)計算月季花中紅色素含量與色素吸光度值之間的線性關系:y=0.0507x－0.0066。其中 y代表于520 nm處測得的吸光度值;x為色素濃度(mg/mL)，相關系數(shù)R2=0.9976，回歸極顯著。所以在色素含量為0～16 mg/mL的范圍內(nèi)，是可以用該方法檢測色素含量的。

2.2 提取溶劑對色素提取率的影響

精確稱量7份月季花花瓣粉末，每份1.0g，分別甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、石油醚、乙醚、乙酸乙酯為溶劑;在料液比為1∶50(g/mL)，80℃的水浴提取1h，超聲波功率450W，占空比1/2(超聲中超聲時間與總時間的比值)處理15min。提取液離心，取上清液定容至10mL容量瓶。每種溶劑做3個平行試驗，求平均值，實驗結(jié)果如表1。

表1 不同溶劑的色素提取率

由表1中數(shù)據(jù)可以看出，不同的提取溶劑色素的提取率有所不同，由上表可知乙醇的提取率最大，故以下實驗均選擇乙醇溶劑作為提取溶劑。

2.3 提取溶劑濃度對色素提取率的影響

精確稱量5份月季花花瓣粉末，每份1.0g，使用乙醇作為提取溶劑，分別用50%、60%、70%、80%、95%、無水乙醇提取。料液比為1∶50(g/mL)，80℃水浴提取1h，超聲波功率450W，占空比1/2處理15min。提取液離心，取上清液定容至10mL容量瓶。不同濃度提取溶劑做3個平行試驗，求平均值，實驗結(jié)果如表2。

表2 不同濃度提取溶劑的色素提取率

由表2中數(shù)據(jù)可以看出，提取溶劑的濃度對實驗影響是比較明顯的，在95%乙醇提取溶劑濃度下獲得最大色素提取率。

2.4 提取水浴溫度對色素提取率的影響

表3 不同水浴溫度的色素提取率

精確稱量5份月季花花瓣粉末，每份1.0g，使用95%乙醇為提取溶劑，按料液比 1∶50(g/mL)，采用 20、40、60、80、100℃提取溫度提取1h，超聲波功率450W、占空比1/2處理15min。提取液離心，取上清液定容至10mL容量瓶，不同水浴溫度做3個平行試驗，求平均值，實驗結(jié)果如表3所示。

由表3中數(shù)據(jù)可以看出，隨著溫度的升高色素提取率隨之升高，超過80℃之后反而下降，分析原因有可能是色素分子的結(jié)構(gòu)在高溫下受到了破壞。故選擇80℃水浴溫度作為最佳提取水浴溫度。

2.5 提取溶液的料液比對色素提取率的影響

精確稱量5份月季花花瓣粉末，每份1.0 g，使用95%乙醇為提取溶劑，80℃水浴提取 1 h，分別采用 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60料液比，超聲波功率450W，占空比1/2處理15min，提取液離心，取上清液定容至10mL容量瓶，不同料液比做3個平行試驗，求平均值，結(jié)果如表4所示。

表4 不同料液比的色素提取率

由表4中數(shù)據(jù)可以看出，物料與提取溶劑的配比越大越好，隨著料液比的增大色素提取率也隨之增大，但是在料液比為1∶50之后有下降趨勢，在考量實驗成本與實驗效果等因素的基礎上選擇料液比為1∶50為提取實驗最佳料液比。

2.6 超聲波功率對色素提取率的影響

精確稱量5份月季花花瓣粉末，每份1.0g，使用95%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶50(g/mL)，80℃水浴提取1h。放入超聲波儀器處理，分別采用在 150、300、450、600、750W 和占空比為1/2的條件下提取20min。提取液離心，取上清液定容至10mL容量瓶，不同超聲波功率做3個平行試驗，求平均值，結(jié)果如表5所示。

表5 超聲波功率對色素提取率的影響

由表5中數(shù)據(jù)可以看出，超聲波功率對色素提取率的影響不是超聲波功率越大越好，而是存在最優(yōu)水平即450W超聲波功率，故選擇450W超聲波功率為色素提取最優(yōu)水平。

2.7 超聲波占空比對色素提取率的影響

表6 超聲波占空比對色素提取率的影響

精確稱量7份月季花花瓣粉末，每份1.0g，使用95%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶50(g/mL)，80℃水浴提取1 h。放入超聲波儀器提取，在功率為450W，占空比為1提取10min、2/3提取15min、1/2 提取 20min、1/3 提取 40min、1/4 提取 50min。提取液離心，取上清液定容至10mL容量瓶，不同超聲波占空比做3個平行試驗，求平均值，結(jié)果如表6所示。

由表6中數(shù)據(jù)分析可以看出，超聲波占空比為1/2時色素提取率有最大值，所以選擇超聲波功率為1/2為超聲波處理提取的最優(yōu)水平。

2.8 響應面實驗分析

根據(jù) Box－Behnken的中心組合實驗設計原理［13－14］，綜合單因素實驗所得實驗結(jié)果，選取3個對色素提取率影響顯著的因素，將乙醇濃度、水浴溫度和超聲波功率3個對色素提取率影響顯著的因素，確定乙醇濃度95%、料液比為1∶50，超聲波占空比為1/2，分別以A、B和 C為代表，每一個自變量的試驗水平分別以－1、0、1進行編碼。0代表最優(yōu)水平、－1為最優(yōu)水平左面的水平、1為最優(yōu)水平右面水平。以月季花紅色素提取率為響應值(Y)，在單因素試驗基礎上，采用三因素三水平的響應面分析方法，試驗因素與水平設計見表7，實驗結(jié)果與分析如表。

表7 響應面分析因素與水平

其中，對提取溶劑乙醇溶劑濃度A、水浴提取時間B和超聲波提取功率C作變換公式如下:A=(Z－95)/5，B=(t－80)/20，C=(T －450)/150(Z、t、T 分別為試驗提取溶劑乙醇溶劑濃度、水浴提取溫度及超聲波提取功率)以 A、B、C為自變量，以3次試驗所得月季花紅色素提取率的平均值為響應值(Y)，結(jié)果見表8。其中1～12為析因試驗，13～15是中心復合試驗，用來估計試驗誤差。

表8 響應面分析方案及結(jié)果

采用Minitab 15質(zhì)量數(shù)據(jù)分析電腦軟件對響應值與各因素進行回歸擬合，將以上數(shù)據(jù)錄入進行分析后，得到回歸方程和提取率估計回歸系數(shù)表如表9:

Y=11.9320 － 0.349000A+0.0367500B+0.215250C －0.698250A2 － 0.476750B2 － 0.802250C2+0.204000A*B+0.335500A*C+0.298000B*C。S=0.309198，PRESS=6.66798，R －Sq=93.36% ＞90.00%，說明方法可靠。R － Sq(預測)=7.35%R －Sq(調(diào)整)=81.40%。

表9 提取率的估計回歸系數(shù)

由表9提取率的回歸系數(shù)顯著性檢驗可以得知，該試驗模型:(1)一次項A乙醇濃度顯著;(2)二次項A2極顯著，B2、C2顯著;(3)交互項都不顯著。

提取率方差分析結(jié)果如表10，提取率的估計回歸系數(shù)，使用未編碼單位的數(shù)據(jù)結(jié)果如表11。

表10 提取率的方差分析

表11 提取率的估計回歸系數(shù)，使用未編碼單位的數(shù)據(jù)

以下為保持其中一個因素不作變化的情況下，探究其余兩個因素對色素提取率的影響，使用曲面圖形及等值線圖形來直觀地表達了每一因素對響應值即色素提取率的影響，如圖2～7所示。

圖2 色素提取率與乙醇濃度，水浴溫度曲面圖

圖3 色素提取率與乙醇濃度，水浴溫度等值線圖

圖4 色素提取率與乙醇濃度，超聲功率曲面圖

圖5 色素提取率乙醇濃度，超聲功率等值線圖

圖6 色素提取率與水浴溫度，超聲功率曲面圖

圖7 色素提取率與提取時間，提取溫度等值線圖

對分析所得的回歸方程:

Y=11.9320 － 0.349000A+0.0367500B+0.215250C －0.698250A2 － 0.476750B2 － 0.802250C2+0.204000A*B+0.335500A*C+0.298000B*C

求一階偏導并聯(lián)立方程組，解得A=－0.225500885，B=0.0185651718，C=0.0904499059，代入前面的變換公式可得到乙醇濃度Z為96.1% 、水浴提取溫度t為80.4℃、超聲波功率為463.6W。即月季花中紅色素提取工藝最佳工藝條件為，采用乙醇濃度為96.1%、水浴提取溫度80.4℃、料液比1∶50、超聲波處理提取超聲波功率463.6W、超聲波占空比為1/2。對實驗優(yōu)化條件進行驗證得到提取率為12.94%。

3 結(jié)論

在采用有機溶劑萃取、超聲波輔助處理提取工藝的優(yōu)化實驗研究中，得到最佳工藝條件為乙醇濃度為96.1%、提取溫度80.4℃、料液比 1∶50、超聲波處理提取超聲波功率 463.6W、超聲波占空比為1/2。對實驗優(yōu)化條件進行驗證得到提取率為12.94%。