正交試驗(yàn)優(yōu)化超臨界CO2流體萃取淮山多糖工藝

楊孝輝，郭 君

(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南株洲 412004)

淮山在我國有廣泛的種植，是傳統(tǒng)的藥食同源植物［1］。研究表明，淮山含有的淮山多糖具有降低血糖［2］、調(diào)節(jié)和增強(qiáng)免疫功能、抗氧化、抗衰老、抗突變作用［3］。目前淮山多糖的提取方法主要有熱水浸提法、堿法提?。?］、酶輔助浸提法、微波輔助提取法［5］、超聲波輔助提取法等［3］，這些方法提取溫度高，使淮山多糖生物活性降低，同時(shí)使用的溶劑量較大，造成后續(xù)分離的困難。采用超臨界CO2流體萃取淮山多糖，萃取溫度低、所用萃取溶劑少，能夠在保持多糖萃取物生物活性的同時(shí)降低后續(xù)分離難度。本試驗(yàn)以淮山多糖的萃取率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)優(yōu)化超臨界CO2流體萃取淮山多糖的萃取條件，為淮山多糖的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與試劑

淮山(購自株洲市湘天橋菜市場);HA121－50－01超臨界萃取裝置(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司);UV－2550紫外可見分光光度計(jì)(島津制作所);分析天平(島津AUW220D);乙醚;無水葡萄糖;苯酚;硫酸。所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水均為新制蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淮山多糖的測定［6－7］

準(zhǔn)確稱取干燥至衡重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1g，配成濃度為0.1mg/mL的葡萄糖對照品貯備液，從中分別精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 置于 25 mL 具塞試管中，各加水至 2.0 mL，各加5%苯酚溶液1.5 mL，振搖混勻，滴加硫酸5.0 mL，迅速振搖均勻，于50℃下放置30min，照紫外可見分光光度法于490nm波長下測定吸光度值，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:y=6.2586x－0.0038，R2=0.9991。同法測定淮山提取物吸光度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算淮山多糖含量，計(jì)算萃取率。

淮山多糖萃取率(%)=c×V/m×100

c:淮山多糖質(zhì)量濃度;m:淮山樣品質(zhì)量(g);V:經(jīng)超臨界萃取所得萃取物樣品溶液體積(mL)。

1.2.2 超臨界CO2流體萃取淮山多糖單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 淮山樣品預(yù)處理

取新鮮的淮山去除雜質(zhì)、洗凈，60℃干燥至含水量小于5%，粉碎成40目的顆粒，用10倍量的乙醚浸提3次脫脂，樣品揮去乙醚，干燥，備用。

1.2.2.2 超臨界CO2流體萃取溫度對淮山多糖萃取率的影響

分別稱取經(jīng)乙醚脫脂處理的40目淮山樣品300g，固定萃取壓力為35MPa、萃取時(shí)間為2h、夾帶劑為100mL 90%乙醇，分別設(shè)定萃取溫度為20、30、40、50、60℃進(jìn)行萃取。萃取物按1.2.1方法測定淮山多糖，分別計(jì)算不同溫度條件下淮山多糖的萃取率。

1.2.2.3 超臨界CO2流體萃取壓力對淮山多糖萃取率的影響

分別稱取經(jīng)乙醚脫脂處理的40目淮山樣品300g，固定萃取溫度為50℃、萃取時(shí)間為2h、夾帶劑為100mL 90%乙醇，分別設(shè)定萃取壓力為20、25、30、35、40 MPa進(jìn)行萃取。萃取物按1.2.1方法測定淮山多糖，分別計(jì)算不同萃取壓力條件下淮山多糖的萃取率。

1.2.2.4 超臨界CO2流體萃取時(shí)間對淮山多糖萃取率的影響

分別稱取經(jīng)乙醚脫脂處理的40目淮山樣品300g，固定萃取壓力為35MPa、萃取溫度為50℃、夾帶劑為100 mL 90%乙醇，分別設(shè)定萃取時(shí)間為 1、1.5、2、2.5、3 h 進(jìn)行萃取。萃取物按1.2.1方法測定淮山多糖，分別計(jì)算不同萃取時(shí)間條件下淮山多糖的萃取率。

1.2.2.5 超臨界CO2流體萃取夾帶劑用量對淮山多糖萃取率的影響

分別稱取經(jīng)乙醚脫脂處理的40目淮山樣品300g，固定萃取壓力為35MPa、萃取時(shí)間為2h、萃取溫度為50℃，分別設(shè)定90%乙醇作為夾帶劑的用量為 0、50、100、150、200mL進(jìn)行萃取。萃取物按1.2.1方法測定淮山多糖，分別計(jì)算不同夾帶劑用量條件下淮山多糖的萃取率。

1.2.2.6 淮山粒度對淮山多糖萃取率的影響

取新鮮的淮山去除雜質(zhì)、洗凈，60℃干燥至含水量小于5%，分別粉碎成粒度為10、30、50、70、90目的淮山顆粒，用10倍量的乙醚浸提3次脫脂，樣品揮去乙醚，干燥;分別稱取經(jīng)乙醚脫脂處理的淮山樣品300 g，固定萃取壓力為35MPa、萃取時(shí)間為2 h、萃取溫度為50℃，夾帶劑為100 mL 90%乙醇，考察不同粒度樣品其淮山多糖萃取率。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取超臨界CO2流體萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間、夾帶劑用量4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以淮山多糖萃取率為考察指標(biāo)，按L9(34)正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化萃取工藝，正交試驗(yàn)的因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels for orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超臨界CO2流體萃取溫度對淮山多糖萃取率的影響

圖1 萃取溫度對淮山多糖萃取率的影響Fig.1 The relationship between the extraction temperature and the extraction rate

由圖1可見溫度對淮山多糖萃取率的影響明顯。在20～40℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，淮山多糖萃取率不斷提升，這可能是由于溫度升高，加速了CO2流體的熱運(yùn)動(dòng)，同時(shí)也提高了多糖分子熱運(yùn)動(dòng)，加速了淮山多糖的溶出;在40～50℃范圍內(nèi)，淮山多糖萃取率隨溫度升高變化不大，這可能是由于淮山原料顆粒內(nèi)外多糖轉(zhuǎn)移達(dá)到平衡所致;萃取溫度高于50℃時(shí)，萃取率隨溫度的升高而下降，這可能是在壓力一定的情況下，超臨界CO2流體密度隨著溫度升高而降低，溶劑化效應(yīng)下降，淮山多糖在其中的溶解度降低導(dǎo)致萃取率下降;也可能是部分多糖在較高溫度下被氧化、分解，導(dǎo)致多糖萃取率降低。

2.1.2 超臨界CO2流體萃取壓力對淮山多糖萃取率的影響

圖2 萃取壓力對淮山多糖萃取率的影響Fig.2 The relationship between the extraction pressure and the extraction rate

超臨界CO2流體壓力是影響淮山多糖萃取率的重要因素。由圖2可以看出，在20～30MPa范圍內(nèi)，淮山多糖的萃取率隨著壓力的增大在不斷升高，這可能是因?yàn)樵跍囟纫欢ǖ臈l件下下超臨界CO2流體的密度隨壓力的升高而升高，淮山多糖的溶解度隨之加大，多糖溶出增加導(dǎo)致的;淮山多糖的萃取率在30～40MPa范圍內(nèi)隨超臨界CO2流體壓力的提高變化不大，這可能和萃取壓力增加，超臨界CO2流體密度增加，擴(kuò)散性降低，淮山多糖傳質(zhì)速率降低量與壓力升高導(dǎo)致的溶解度增大量達(dá)到平衡有關(guān)。同時(shí)萃取壓力增大也會(huì)導(dǎo)致設(shè)備、操作費(fèi)用的升高。

2.1.3 超臨界CO2流體萃取時(shí)間對淮山多糖萃取率的影響

圖3 萃取時(shí)間對淮山多糖萃取率的影響Fig.3 The relationship between the extraction time and the extraction rate

由圖3可以看出萃取時(shí)間能夠明顯影響淮山多糖的萃取率。在1～2h時(shí)間范圍內(nèi)，淮山多糖的萃取率隨萃取時(shí)間的延長而提高，這可能是因?yàn)榛瓷蕉嗵窃诙虝r(shí)間內(nèi)不能充分溶出，萃取時(shí)間延長，淮山多糖從原料顆粒中充分溶出導(dǎo)致的。在2～2.5h時(shí)間范圍內(nèi)，淮山多糖的溶出達(dá)到平衡，表現(xiàn)為萃取率隨萃取時(shí)間的延長變化不大;在2.5～3h時(shí)間范圍內(nèi)，可能是因?yàn)橛胁糠只瓷蕉嗵潜谎趸?、分解，故表現(xiàn)為萃取率隨萃取時(shí)間的延長而降低。

2.1.4 超臨界CO2流體萃取夾帶劑用量對淮山多糖萃取率的影響

圖4 萃取夾帶劑用量對淮山多糖萃取率的影響Fig.4 The relationship between the extraction cosolvent and the extraction rate

夾帶劑用量能明顯改變超臨界CO2流體的萃取性能。由圖4可知在夾帶劑用量為0的情況下，由于超臨界CO2流體的弱極性和淮山多糖的不揮發(fā)性，淮山多糖的萃取率較低;當(dāng)夾帶劑加入量在0～100mL范圍內(nèi)增加時(shí)，超臨界CO2流體的極性改變，淮山多糖萃取率隨之提高;夾帶劑加入量在100～200mL范圍內(nèi)增加時(shí)，萃取率變化不大，這可能是超臨界CO2流體的極性在此范圍內(nèi)變化不大，對淮山多糖的溶解性改變不大導(dǎo)致的。

圖5 淮山樣品粒度對淮山多糖萃取率的影響Fig.5 The relationship between the particle size and the extraction rate

2.1.5 淮山粒度對淮山多糖萃取率的影響

淮山樣品粒度在10～50目范圍內(nèi)增加時(shí)，淮山多糖的萃取率隨之增加，這可能是由于顆粒減小，超臨界CO2流體能夠進(jìn)入顆粒內(nèi)部進(jìn)行充分交換的原因。當(dāng)粒度在50～70目范圍內(nèi)增加時(shí)，淮山多糖萃取率變化不明顯;當(dāng)粒度在70～100目范圍內(nèi)增加時(shí)，淮山多糖的萃取率減少，這可能是較小的淮山顆粒堵塞萃取隔板小孔，使萃取產(chǎn)物不能及時(shí)轉(zhuǎn)移到分離缸造成的;還可能是淮山顆粒較小，短時(shí)間內(nèi)溶出大量的淮山多糖，部分多糖被氧化、分解，從而導(dǎo)致萃取率降低。在萃取過程中，淮山樣品粒度較小時(shí)會(huì)發(fā)生結(jié)塊現(xiàn)象，影響萃取效率。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果綜合考慮，固定淮山樣品粒度為40目。

2.2 正交試驗(yàn)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of orthogonal experimental design

由表2中極差分析結(jié)果可知，超臨界CO2流體萃取淮山多糖的各因素影響依次為萃取壓力(B)＞萃取溫度(A)＞夾帶劑用量(D)＞萃取時(shí)間(C)。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)范圍內(nèi)，優(yōu)化得到的最佳萃取方案為B2A3D3C3，即萃取壓力35MPa、溫度45℃、90%乙醇作為夾帶劑用量150 mL、時(shí)間2.5 h。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)得到的超臨界CO2流體萃取淮山多糖的最佳工藝條件，即萃取壓力35MPa、溫度45℃、90%濃度乙醇作為夾帶劑用量150 mL、時(shí)間2.5 h，萃取淮山多糖，平行做3次，淮山多糖平均值為0.32%，高于正交試驗(yàn)表中每一項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，確定B2A3D3C3為最佳萃取方案。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)優(yōu)選得出超臨界CO2流體萃取淮山多糖的最佳工藝條件:萃取壓力35MPa、溫度45℃、90%濃度乙醇作為夾帶劑用量150 mL、時(shí)間2.5 h，在此條件下淮山多糖萃取率高。