miR-29b和Tiam1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床意義*

舒 若，田 衍，曾玉劍，羅華友，李 穎

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸與疝外科，昆明 650032)

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年約有600 000例患者死于結(jié)腸癌[1-2]。盡管在診斷和治療上取得重大進(jìn)展，但結(jié)腸癌的病死率仍然很高[3]。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)行為，也是影響治療效果和預(yù)后的主要原因之一[4-5]。許多研究表明，microRNA在癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[6-7]。microRNA是一類片段小的非編碼RNA，能夠通過抑制翻譯而減少特定靶基因的表達(dá)[8-10]。其中相關(guān)研究報道MicroRNA-29b (miR-29b)在結(jié)腸癌中低表達(dá)，并在癌癥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[11-12]。同時發(fā)現(xiàn)T淋巴瘤浸潤轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(T lymphoma invasion and metastasis including factor 1,Tiam1)是一個鳥嘌呤核苷酸交換因子，能夠選擇性地激活類似Rho GTP酶[13]，在結(jié)腸癌中高表達(dá)，并且在癌癥轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用[14-15]。生物信息學(xué)和分子生物學(xué)實驗表明miR-29b可與Tiam1 mRNA的3′-UTR結(jié)合，直接抑制癌細(xì)胞中Tiam1的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，提示miR-29b可能Tiam1的直接靶基因[16]。但目前綜合分析miR-29b和Tiam1在結(jié)腸癌的表達(dá)及其意義鮮有報道。本研究通過檢測結(jié)腸癌組織和癌旁組織中miR-29b、Tiam1 mRNA表達(dá)，分析二者相關(guān)性，并且觀察它們與結(jié)腸癌病理特征的關(guān)系，以探討結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)潛在的藥物治療靶點。

表1 基因引物序列

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2015年6月至2017年3月手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織標(biāo)本及癌旁正常組織(距離癌組織大于5 cm)，手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本置于-80 ℃冰箱保存。標(biāo)本共計30例，其中男16例，女14例；年齡42～80歲，平均(66.87±8.13)歲。參考全國結(jié)直腸癌協(xié)作組結(jié)直腸癌診治規(guī)范及AJCC/UICC的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)腸癌組織進(jìn)行診斷和分期(Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅱ～Ⅳ期12例)[17]。所有受試者均已簽署知情同意書，本研究通過本院倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR法檢測miR-29b、Tiam1 mRNA表達(dá)水平 提取總RNA:按照Trizol試劑說明書取約50 mg組織提取總RNA，RNase-Free H2O溶解RNA，微量分光光度計檢測RNA濃度及純度，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肨aqman RT-PCR kit進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測miR-29b以U6為內(nèi)參基因，檢測Tiam1 mRNA表達(dá)水平以GAPDH為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系在ABIQ6型實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行，測定每個樣品的Ct值?；虻谋磉_(dá)以相對含量=2-△△Ct的形式呈現(xiàn)。基因引物序列見表1。

1.2.2蛋白免疫印跡檢測Tiam1的表達(dá) 分別取約250 mgⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的結(jié)腸癌組織加入RIPA lysis buffer提取總蛋白。然后將各樣品放入4 ℃離心機(jī)中12 000 g離心15 min，收集上清液。利用BCA protein assay kit確定蛋白濃度。為了檢測Tiam1在不同分期結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，各取80 μg的蛋白在15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，75 V下反應(yīng)2 h，然后轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。向PVDF膜加入Tiam1一抗(Abcam)在4 ℃過夜孵育后，再加入二抗孵育2 h，最后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液在Alpha Innotech曝光成像分析。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參蛋白。

1.2.3觀察指標(biāo) 記錄并統(tǒng)計所有參與者臨床分期和是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2 結(jié) 果

2.1miR-29b與Tiam1 mRNA的表達(dá) miR-29b在結(jié)腸癌組織(0.50±0.27)比其在癌旁組織(1.00±0.00)中的表達(dá)低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Tiam1 mRNA在結(jié)腸癌組織(4.22±2.13)比其在癌旁組織(1.00±0.00)中的表達(dá)高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2miR-29b與Tiam1 mRNA的相關(guān)性分析 將miR-29b與Tiam1 mRNA在結(jié)腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.869，P<0.01)，見圖1。

圖1 miR-29b與Tiam1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.3miR-29b、Tiam1 mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌主要臨床病理特征的關(guān)系 在不同臨床分期中，miR-29b和Tiam1 mRNA的表達(dá)水平表現(xiàn)出不同的趨勢。隨著臨床分期的進(jìn)展，miR-29b表達(dá)呈下降的趨勢，其中Ⅲ期、Ⅳ期結(jié)腸癌組織中miR-29b的相對表達(dá)量為0.23±0.08，明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期結(jié)腸癌(0.69±0.18，P<0.05)。隨著臨床分期的進(jìn)展，Tiam1 mRNA表達(dá)呈上升的趨勢，其中Ⅲ期、Ⅳ期結(jié)腸癌組織中Tiam1 mRNA的相對表達(dá)量為6.10±1.86，明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期結(jié)腸癌(2.97±1.15，P<0.05)。并且利用蛋白免疫印跡檢測Tiam1在不同分期結(jié)腸癌組織中的蛋白表達(dá)也顯示Ⅲ期、Ⅳ期結(jié)腸癌組織中Tiam1蛋白的相對表達(dá)量明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期結(jié)腸癌組織中的表達(dá)(圖2)。另外，miR-29b和Tiam1 mRNA表達(dá)還顯示出與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的密切聯(lián)系，miR-29b在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織的表達(dá)明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織中Tiam1 mRNA表達(dá)水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，見表2。

圖2 Tiam1蛋白在不同分期結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

表2 miR-29b、Tiam1 mRNA表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

結(jié)腸癌的發(fā)生是一個多因素、多階段和多基因改變協(xié)同作用的過程，其發(fā)生的分子基礎(chǔ)包括癌基因和抑癌基因的表達(dá)失調(diào)[18]。研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，如分子遺傳學(xué)和生物學(xué)的改變，在將來有希望能夠改善患者的預(yù)后。但是，不幸的是，大多數(shù)患者死于其轉(zhuǎn)移性[19]。因此，研究結(jié)腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移都尤為重要。

最近幾年，許多研究表明microRNAs通過綁定不同的mRNAs在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[20]。到目前為止，在結(jié)腸癌中已有許多異常表達(dá)的microRNAs，如miR-21、miR-124和miR-29b等，并且這些microRNAs在結(jié)腸癌的發(fā)生和進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用[21-23]。本研究對30例結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中miR-29b表達(dá)下降，同時Tiam1過表達(dá)，二者呈顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道及生物信息學(xué)分析，推測腸道正常組織miR-29b對Tiam1的表達(dá)呈負(fù)向調(diào)控。在各種致瘤因子的刺激下，miR-29b對Tiam1的負(fù)向調(diào)控相對較弱，從而使Tiam1的表達(dá)在病理狀態(tài)下增加，影響腫瘤的微環(huán)境，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，Tiam1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)升高，并且TNM分期Ⅰ和Ⅱ期結(jié)腸癌組織中miR-29b的表達(dá)水平明顯高于Ⅲ和Ⅳ期結(jié)腸癌(P<0.05)，而TNM分期Ⅰ～Ⅳ期結(jié)腸癌組織中Tiam1表達(dá)有上升趨勢，即Ⅰ和Ⅱ期結(jié)腸癌組織中Tiam1 mRNA的表達(dá)水平明顯低于Ⅲ和Ⅳ期結(jié)腸癌(P<0.05)。該結(jié)果說明miR-29b和Tiam1可能成為結(jié)腸癌臨床分期的指標(biāo)。另外，miR-29b在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織的表達(dá)明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，Tiam1 mRNA表達(dá)與其相反。LIU等[14]研究發(fā)現(xiàn)Tiam1在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞系(LoVo和SW620)中的表達(dá)明顯高于原發(fā)性結(jié)腸癌細(xì)胞系(LS174T,SW480，HCT116，LST，HRT和Hee8693)的表達(dá)，這說明Tiam1基因與轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌密切相關(guān)。WANG等[16]還發(fā)現(xiàn)miR-29b能夠通過下調(diào)Tiam1和抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

本文結(jié)果提示結(jié)腸癌中miR-29b表達(dá)下降并且伴隨Tiam1表達(dá)上調(diào)可能是結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制之一，miR-29b和Tiam1可以成為結(jié)腸癌潛在的診斷標(biāo)志物。