從臨床出發(fā)，以信號(hào)通路為靶標(biāo)的復(fù)方新藥研發(fā)策略、途徑與實(shí)踐
——六論創(chuàng)建新醫(yī)藥學(xué)＊

羅國(guó)安，王義明，范雪梅，謝媛媛

（清華大學(xué)/教育部中醫(yī)藥現(xiàn)代化網(wǎng)上合作研究中心 北京 100084）

1 前言

1.1 中醫(yī)藥現(xiàn)代化簡(jiǎn)要回顧

大健康產(chǎn)業(yè)。中醫(yī)藥研究在臨床和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域取得了飛躍發(fā)展，國(guó)際影響日益擴(kuò)大。

1996 年科技部會(huì)同國(guó)家中醫(yī)藥管理局等部門提出了中藥現(xiàn)代化發(fā)展的整體戰(zhàn)略構(gòu)想[1]，1997年啟動(dòng)了中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)行動(dòng)，1998年中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)基地建設(shè)啟動(dòng)，出臺(tái)了《中藥現(xiàn)代化發(fā)展綱要》、《中醫(yī)藥創(chuàng)新發(fā)展規(guī)劃綱要》等指引性文件。1999年由王永炎院士領(lǐng)銜的“中藥方劑的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題基礎(chǔ)研究”獲得國(guó)內(nèi)科技界的一致贊同，成為第一個(gè)中藥973項(xiàng)目。20余年來(lái)中藥工業(yè)產(chǎn)值占據(jù)我國(guó)生物醫(yī)藥工業(yè)總產(chǎn)值的1/3，帶動(dòng)形成了超過(guò)萬(wàn)億元規(guī)模的中藥

1.2 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)快速發(fā)展

現(xiàn)代醫(yī)藥在經(jīng)歷了反思、自我否定之后，提出了轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、個(gè)體化治療、谷歌公司的“醫(yī)學(xué)大腦”在AI方面獲得長(zhǎng)足進(jìn)步等一系列創(chuàng)新發(fā)展，正面臨取得重大突破的前夜[2]。

1.3 二種傾向

中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展20余年了，在取得重大進(jìn)展之際，出現(xiàn)了二種傾向。一種是否定中醫(yī)藥現(xiàn)代化取得的成績(jī)，質(zhì)疑中醫(yī)藥現(xiàn)代化是全盤西化；另一種是魚(yú)龍混雜，泥砂俱下，不講科學(xué)，打著中醫(yī)藥旗號(hào)，包治百病的神醫(yī)、神藥不斷出現(xiàn)，令人擔(dān)憂。質(zhì)疑中醫(yī)藥浪潮時(shí)起彼伏。中醫(yī)藥發(fā)展出現(xiàn)了種種邊緣化現(xiàn)象：如中藥注射劑在二級(jí)甲等以下級(jí)別的醫(yī)院中不可使用，而三級(jí)甲等醫(yī)院不用，導(dǎo)致中藥注射劑銷售大幅下降；中成藥在疾病診治方案中不作為主治藥物，只是輔助治療用藥；在大健康、治未病的說(shuō)法下，弱化中藥作為治療藥物的作用，下降到保健品地位；人工智能的“中醫(yī)大腦”、“中藥大腦”無(wú)人探索，等等。如此場(chǎng)景，不禁令人發(fā)問(wèn)：中醫(yī)藥往何處去，中醫(yī)藥現(xiàn)代化之路朝向何方？!我們的回答是：中醫(yī)藥亟需拓展國(guó)際視野，提升科學(xué)高度，與時(shí)俱進(jìn)，不忘初心，為實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化再出發(fā)，踏上新征程，奔向新目標(biāo)！

1.4 應(yīng)對(duì)措施

產(chǎn)生目前狀況的原因在于：缺乏明確的戰(zhàn)略目標(biāo)，只強(qiáng)調(diào)中醫(yī)藥現(xiàn)代化是個(gè)過(guò)程；缺乏全球視野，滿足于自我欣賞；缺乏自我否定、革命性創(chuàng)新意識(shí)，滿足于追風(fēng)跟蹤。針對(duì)不利于中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的傾向，筆者認(rèn)為①堅(jiān)持中醫(yī)藥現(xiàn)代化之路不動(dòng)搖；②要有更多的創(chuàng)新，更多融合中醫(yī)藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，生命科學(xué)新進(jìn)展；③要有全球視野，走出自己的路，實(shí)現(xiàn)四個(gè)創(chuàng)新：理論（觀念）創(chuàng)新，方法（體系）創(chuàng)新，技術(shù)創(chuàng)新和集成創(chuàng)新[3]。

習(xí)主席在2018年兩院院士大會(huì)講話中指出：“我們堅(jiān)持走中國(guó)特色自主創(chuàng)新道路，堅(jiān)持創(chuàng)新是第一動(dòng)力，堅(jiān)持抓創(chuàng)新就是抓發(fā)展，謀創(chuàng)新就是謀未來(lái)”。面對(duì)中醫(yī)藥往何處去的方向問(wèn)題，我們應(yīng)該旗幟鮮明地認(rèn)識(shí)到傳承中醫(yī)藥是責(zé)任，堅(jiān)持創(chuàng)新是我們時(shí)代的使命。

本文試圖從整體系統(tǒng)醫(yī)學(xué)（新醫(yī)藥學(xué)，Holistic Sys?tems Medicine,HSM）理念[2-6]出發(fā)，從藥學(xué)（新藥）研發(fā)角度，探討能實(shí)現(xiàn)醫(yī)藥融合，臨床和實(shí)驗(yàn)室研究融合，適用于復(fù)方新藥（中藥復(fù)方、西藥復(fù)方乃至中西藥復(fù)方）的研發(fā)策略、途徑和實(shí)踐。

2 幾點(diǎn)思考

2.1 新藥研發(fā)重點(diǎn)將從新化學(xué)實(shí)體（NCE）轉(zhuǎn)向復(fù)方新藥

新藥研發(fā)是一個(gè)耗時(shí)、耗資都非常龐大的系統(tǒng)工程，主要包括實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)（候選藥物研發(fā)和臨床前研究）、申報(bào)臨床、臨床試驗(yàn)、申報(bào)生產(chǎn)、上市等。目前創(chuàng)新藥物在國(guó)際上是指含有新化學(xué)實(shí)體（NCE）的藥物。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的高速發(fā)展，人類疾病譜和醫(yī)療模式發(fā)生重大變革，發(fā)生率高和危害重大的疾病已由感染性的單因素性疾病，轉(zhuǎn)向機(jī)體自身代謝和調(diào)控失常為主要譜群的慢性、復(fù)雜、多因素性疾病，如心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、惡性腫瘤、免疫性疾病和代謝性疾病等。以單靶點(diǎn)直接對(duì)抗治療為代表的西方醫(yī)學(xué)思想在處理感染性等單因素性疾病方面取得了成功，但在面對(duì)慢性、復(fù)雜性、多因素性疾病時(shí)卻苦無(wú)良策。目前，治療理念的變革（如免疫治療等），臨床聯(lián)合用藥的實(shí)踐及美國(guó)FDA批準(zhǔn)越來(lái)越多的復(fù)方西藥，是啟示性標(biāo)志。以NCE為重點(diǎn)的新藥研發(fā)將逐步轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)方新藥的新藥研發(fā)模式，這是一個(gè)新趨勢(shì)。目前存在的問(wèn)題，在于新藥復(fù)方新藥的研發(fā)策略和途徑仍然遵循NCE的“靶點(diǎn)確定-模型建立-先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)-先導(dǎo)化合物優(yōu)化”的新藥研發(fā)模式。不同之處在于多是針對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的藥物的簡(jiǎn)單組合，從機(jī)理上看是1+1≥2。然而，復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展涉及到多個(gè)病理環(huán)節(jié)，這種針對(duì)一個(gè)或多個(gè)靶點(diǎn)的藥物組合缺乏整體觀指導(dǎo)，難于做到多種治療理念（如標(biāo)本兼治等）的整體系統(tǒng)研發(fā)。中藥復(fù)方新藥基于中醫(yī)藥傳統(tǒng)寶庫(kù)，得到了快速發(fā)展（如組分中藥等[7]），但仍存在缺乏整體觀、系統(tǒng)論指導(dǎo)下的“兩個(gè)基本講清”（基本講清藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，基本講清藥效及作用機(jī)理[8-10]）的現(xiàn)代科學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

2.2 NCE新藥研發(fā)模式的缺陷

新藥研發(fā)中候選藥物的確定是新藥研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，候選藥物的合理性一定程度上決定了新藥研發(fā)的成敗。目前NCE新藥研發(fā)以西方醫(yī)學(xué)思想為指導(dǎo)，“靶點(diǎn)確定-模型建立-先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)-先導(dǎo)化合物優(yōu)化”的模式存在明顯的缺陷。由于倫理、醫(yī)藥分工、簡(jiǎn)化復(fù)雜研究難度及技術(shù)上時(shí)代局限等原因，NCE新藥研發(fā)模式作了2個(gè)重要的簡(jiǎn)化替代：用動(dòng)物模型等取代了臨床病人；用靶點(diǎn)（或組合）取代了疾病。由此必然給藥物的有效性和安全性帶來(lái)重大的不確定性。目前大量臨床用的藥物都是NCE研發(fā)的成功范例，但背后隱藏的是巨大的失敗率和高額的研發(fā)成本。

2.3 從動(dòng)物模型出發(fā)的新藥研發(fā)的局限性

用動(dòng)物模型（包括細(xì)胞模型等其它生物模型）來(lái)模擬病人是一種不得已的簡(jiǎn)化、替代辦法，其缺陷在于：多種治療理念（如標(biāo)本兼治、祛邪扶正、異病同治等）無(wú)法體現(xiàn)；病人的心理、情感、飲食及環(huán)境等因素?zé)o法表征等等。其本質(zhì)在于將醫(yī)生和藥學(xué)家的分工合作變成了藥學(xué)家的單一研究。中醫(yī)藥傳統(tǒng)體現(xiàn)了醫(yī)藥不分家的理念，但現(xiàn)在因藥學(xué)研發(fā)的復(fù)雜性使之有所降低。西醫(yī)藥分家由來(lái)已久，但何大一的雞尾酒療法成功研發(fā)為復(fù)方新藥，開(kāi)辟了由醫(yī)生臨床聯(lián)合用藥研發(fā)復(fù)方新藥的新途徑。我們提出了臨床系統(tǒng)生物學(xué)[11]途徑探索實(shí)現(xiàn)醫(yī)藥融合，以臨床病例為出發(fā)點(diǎn)研發(fā)新藥。

2.4 從靶點(diǎn)出發(fā)的新藥研發(fā)的局限性

從靶點(diǎn)出發(fā)的新藥研發(fā)取得了極大的成功，今后乃至相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍是新藥研發(fā)的主要途徑，其原因在于簡(jiǎn)單明了，抓住了疾病的關(guān)鍵，提供并建立了一整套完善、可操作、可復(fù)制的技術(shù)和方法體系。針對(duì)單因素性疾病，確定明確的靶點(diǎn)，采用高通量篩選，篩選出候選藥物，進(jìn)行進(jìn)一步藥效、藥理及臨床研究，形成了一種慣性思維，這是一種“點(diǎn)-點(diǎn)”（1個(gè)小分子化合物針對(duì)1個(gè)靶點(diǎn)）的模式。但對(duì)于慢性、復(fù)雜、多因素性疾病，“點(diǎn)-點(diǎn)”模式就有很大局限性，無(wú)法表征疾病的全面性，階段性及其本質(zhì)。筆者深感“點(diǎn)-點(diǎn)”模式（Point to Point，P2P）不足以描述表征中醫(yī)藥的深刻科學(xué)內(nèi)涵，也無(wú)法推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化和創(chuàng)新使命，在本世紀(jì)初出現(xiàn)的系統(tǒng)生物學(xué)理念啟迪下，于2006年初提出了用化學(xué)物質(zhì)組學(xué)（Chemomics）來(lái)表征中藥復(fù)雜體系，用整合化學(xué)物質(zhì)組學(xué)的整體系統(tǒng)生物學(xué)（Chemo?mics-integrated global systems biology）來(lái)闡述外部干預(yù)系統(tǒng)（中藥復(fù)方系統(tǒng)）與生物應(yīng)答系統(tǒng)（人體復(fù)雜系統(tǒng)）之間“系統(tǒng)-系統(tǒng)”模式（System to System,S2S）的相互作用[10,12]。從P2P到S2S是1個(gè)根本的轉(zhuǎn)變，“系統(tǒng)-系統(tǒng)”的新藥研發(fā)模式將對(duì)疾?。ò▉喗】档龋┘爸委煛⒅嗅t(yī)的證、方等都會(huì)有新的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)新的策略和途徑。

2.5 ?。ㄎ麽t(yī)）和證（中醫(yī)）都是有同一的生物學(xué)意義

自從系統(tǒng)生物學(xué)提出以來(lái)[13,14]，人體復(fù)雜系統(tǒng)的生物應(yīng)答可歸納為基因、蛋白質(zhì)、代謝物3個(gè)基礎(chǔ)層面正在逐步成為共識(shí)。中醫(yī)和西醫(yī)從不同理念和體系，用不同的表征方法來(lái)體現(xiàn)對(duì)人的疾病的認(rèn)識(shí)和治療，但對(duì)同一病人的中西醫(yī)不同表征，在物質(zhì)基礎(chǔ)（基因、蛋白質(zhì)、代謝物3個(gè)基本層面）上是有可能找到同一的生物學(xué)意義。新醫(yī)藥學(xué)是有可能在同一物質(zhì)基礎(chǔ)3個(gè)層面上實(shí)現(xiàn)結(jié)合，整合，融合而發(fā)展。在復(fù)方新藥研發(fā)上則會(huì)產(chǎn)生基于臨床出發(fā)，同一理念推動(dòng)研究策略和途徑的中藥復(fù)方新藥、西藥復(fù)方新藥和中西藥復(fù)方新藥[15,16]。

現(xiàn)在習(xí)慣上所講的中藥復(fù)方作用是多成分、多靶點(diǎn)的說(shuō)法，實(shí)際上體現(xiàn)了從西藥靶點(diǎn)出發(fā)，缺乏中醫(yī)藥整體觀、系統(tǒng)論的理念。中醫(yī)藥整體觀、系統(tǒng)論精髓指導(dǎo)下，應(yīng)是有君臣佐使之分的藥材組分和成分逐步遞進(jìn)的復(fù)方，針對(duì)的有主次之分的靶點(diǎn)和通路的系統(tǒng)作用。常用多組學(xué)來(lái)描述也有不妥?，F(xiàn)在有100多種組學(xué)，但其生物學(xué)意義根本上是3大類組學(xué)（基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)），用系統(tǒng)生物學(xué)或整體系統(tǒng)生物學(xué)能克服碎片化，體現(xiàn)了整體觀和系統(tǒng)論理念。筆者所提出的整體系統(tǒng)生物學(xué)（Global Systems Biolo?gy）[17-19]作了有益的探索。

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的優(yōu)缺點(diǎn)

2007年10 月提出的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[20]在復(fù)方藥物研發(fā)中得到了廣泛的應(yīng)用，它是用單成分藥物作為擾動(dòng)（點(diǎn)），采用系統(tǒng)生物學(xué)描述其活性，即P2S模式（Point to System,P2S）。通常用來(lái)預(yù)測(cè)推斷小分子和基因、蛋白質(zhì)、代謝物等靶點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)性，取得了有益的結(jié)果。如李梢等提出了網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)（network target）[21]；王忠等提出了模塊藥理學(xué)（Modular Pharmacology）等[22]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種有益、必要的技術(shù)，適宜作預(yù)測(cè)、推斷等輔助作用，不宜夸大所起作用。因?yàn)棰倬W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的依據(jù)是各種數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)中各數(shù)據(jù)可靠性不同，部分?jǐn)?shù)據(jù)準(zhǔn)確性有待證實(shí)，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果有極大影響。真實(shí)結(jié)果須在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證，再結(jié)合其它來(lái)源實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果予以修訂、補(bǔ)充、完善而得。②網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)角度出發(fā)，預(yù)測(cè)工具有很多不同算法，各算法出發(fā)點(diǎn)不同，采用方法不同導(dǎo)致所得結(jié)論各不相同，須經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。③數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)源于1個(gè)小分子藥物對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)（基因網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)、代謝途徑網(wǎng)絡(luò)等）的作用（P2S），未考慮多個(gè)化合物（復(fù)方藥物）對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的同時(shí)作用（S2S），即未考慮藥物之間的相互作用及和整體網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)性。④更扎實(shí)的途徑是從臨床病例的整體網(wǎng)絡(luò)（基因、蛋白質(zhì)和代謝物等）出發(fā)，從疾病的癥狀、影像、生化指標(biāo)和整體網(wǎng)絡(luò)出發(fā)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段進(jìn)行整體研究。⑤大數(shù)據(jù)、云計(jì)算等將為從臨床出發(fā)的整體網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Holistic Network Pharmacol?ogy）提供更多手段和更好前景。⑥期盼定量網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Quantitative Network Pharmacology）和毒性（副作用）網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Toxicity Network Pharmacology）的出現(xiàn)和研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是復(fù)方新藥研發(fā)必須且重要的技術(shù)之一，須明確其優(yōu)缺點(diǎn)，才能克服短處，更好應(yīng)用這一工具來(lái)發(fā)展復(fù)方新藥。

2.7 復(fù)方藥物的定義和特點(diǎn)

基于“系統(tǒng)-系統(tǒng)”（S2S）模式的復(fù)方藥物[15,16]定義如下：復(fù)方藥物是指為了實(shí)現(xiàn)整體最佳（而不是單靶點(diǎn)最佳）的療效目標(biāo)，綜合多種治療原則和多種作用機(jī)理導(dǎo)向下所開(kāi)發(fā)的由多個(gè)化合物或化合物群配伍組成的治療藥物。復(fù)方藥物一般具有以下特點(diǎn)：①?gòu)?fù)方藥物是由多個(gè)成分（化合物）或多個(gè)組分（化合物類）所組成的化合物群；②組成復(fù)方藥物的多個(gè)成分（或多個(gè)組分）具有一定的配伍和配比關(guān)系；③復(fù)方藥物往往包含多種治療原則和多種作用機(jī)理達(dá)到整體療效最佳；④復(fù)方藥物必須能夠體現(xiàn)復(fù)合組方的必要性，即必須體現(xiàn)多成分（或多組分）配伍之后增效或減毒方面的綜合優(yōu)勢(shì)；⑤復(fù)方藥物的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)能保證藥物質(zhì)量的穩(wěn)定和均一。在此原則下既可以開(kāi)發(fā)中藥復(fù)方藥物，也可以開(kāi)發(fā)西藥復(fù)方藥物和中西藥結(jié)合的復(fù)方藥物[15]。

復(fù)方藥物研發(fā)創(chuàng)新體系的特點(diǎn)為：①治療的對(duì)象是生病（或亞健康狀態(tài)）的人（而不只是?。?；②充分體現(xiàn)“醫(yī)生參與，醫(yī)藥融合”的特色；③研發(fā)途徑應(yīng)體現(xiàn)“臨床-動(dòng)物-臨床”的特點(diǎn)；④具有獨(dú)特的臨床療效綜合評(píng)價(jià)體系；⑤具有體現(xiàn)其作用模式（機(jī)理）的藥物綜合篩選模式（“系統(tǒng)-系統(tǒng)”相互作用模式）；⑥具有體現(xiàn)其化合物群的整體表征和局部特征的綜合表達(dá)形式[16]。

中藥復(fù)方新藥的來(lái)源為傳統(tǒng)的中藥方劑（古方，經(jīng)方），已上市的中成藥，確有療效的院內(nèi)制劑和臨床有效驗(yàn)方，組分中藥和由單體或組分按中醫(yī)藥理論和/或現(xiàn)代理論配伍組成的復(fù)方等。西藥復(fù)方新藥主要來(lái)源于臨床聯(lián)合用藥的實(shí)踐或針對(duì)疾病的臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究，以信號(hào)通路為靶標(biāo)研發(fā)而成復(fù)方新藥。

2.8 從臨床出發(fā)，以信號(hào)通路為靶標(biāo)的研發(fā)策略

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從數(shù)據(jù)庫(kù)和P2S模式出發(fā)，而本文所提出的復(fù)方新藥研發(fā)是基于臨床實(shí)踐取得的系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)和S2S模型進(jìn)行的。如何能吸取NCE以靶點(diǎn)為靶標(biāo)研發(fā)模式的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合“系統(tǒng)-系統(tǒng)”模式理念，從長(zhǎng)期和臨床相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)研究中，我們于2017年總結(jié)提出了以通路（signaling pathway，包括基因、蛋白質(zhì)、代謝物3個(gè)層面）為主，靶點(diǎn)為輔來(lái)表征整體藥效和相互作用的研發(fā)模式[6]。

從臨床出發(fā)，以信號(hào)通路為靶標(biāo)的復(fù)方新藥研發(fā)策略大致如下：

①對(duì)復(fù)方藥物進(jìn)行整體系統(tǒng)研究：采用化學(xué)物質(zhì)組學(xué)對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行藥材、組分和成分群3個(gè)層次，有君臣佐使之分，逐步遞進(jìn)的深入研究。針對(duì)不同類型的復(fù)方藥物，確定重點(diǎn)研究的化學(xué)層次，結(jié)合用動(dòng)物模型開(kāi)展的整體系統(tǒng)生物學(xué)研究，基本搞清復(fù)方藥物的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)；②針對(duì)所研究的疾病和中醫(yī)的辨證治療，制定臨床研究方案。從流行病學(xué)研究開(kāi)始，根據(jù)不同的研究問(wèn)題，研究目的，可采用不同的研究設(shè)計(jì)和方法。在各種臨床研究類型中，隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)內(nèi)在真實(shí)性高，可以判斷干預(yù)措施真實(shí)的療效，能夠證明因果關(guān)系，是學(xué)術(shù)界廣泛接受和認(rèn)可的療效評(píng)價(jià)方法，其研究結(jié)果被認(rèn)為是最高等級(jí)的臨床證據(jù)[23]。確定臨床病人入組條件后，入組病人0天的整體系統(tǒng)生物學(xué)及其它信息（病、證、生化指標(biāo)、影像學(xué)等）可作為疾?。ㄗC）分型橫斷面依據(jù)，治療各階段的所有信息作為整體療效評(píng)價(jià)和候選復(fù)方新藥的依據(jù)和來(lái)源；③臨床整體系統(tǒng)生物學(xué)研究:對(duì)臨床病人的血清（血漿）、尿液等樣品，根據(jù)疾病的特性確定所需開(kāi)展的整體系統(tǒng)生物學(xué)的各種組學(xué)類型，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。采用生物信息學(xué)方法，確定和疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，信號(hào)通路和相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)，特別聚焦和疾病分型相關(guān)的整合生物標(biāo)志物體系（Intergrated Biomarker System，IBS）[11]；④網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)搜尋預(yù)測(cè)候選復(fù)方新藥：根據(jù)臨床數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)所確定的靶點(diǎn)、通路和相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法確定復(fù)方藥物化學(xué)物質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和其相關(guān)性，以通路為主要靶標(biāo)，靶點(diǎn)輔助，聚焦得出候選復(fù)方藥物初步的化學(xué)成分，組分的配伍及配比；⑤生物學(xué)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化和驗(yàn)證:采用動(dòng)物模型（包括模式生物，如線蟲(chóng)、斑馬魚(yú)等），細(xì)胞模型和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得出的候選復(fù)方藥物的組成、配伍和配比進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證；⑥傳統(tǒng)新藥研究開(kāi)發(fā)中的藥效、藥理和安全性評(píng)價(jià)。

從臨床出發(fā)，以通路為靶標(biāo)的復(fù)方新藥研發(fā)策略能有效克服目前中醫(yī)藥研究中存在“方-病-證”割裂（違背中醫(yī)藥整體觀）和“基因-蛋白質(zhì)-代謝物分離”（缺乏系統(tǒng)性）的弊病，避免了單靶點(diǎn)、多靶點(diǎn)（缺乏有主次的整體表征）的不足，既可以發(fā)現(xiàn)針對(duì)疾病（證）多種治療理念集合的復(fù)方新藥，也可以發(fā)現(xiàn)對(duì)疾病的各病理階段的針對(duì)性強(qiáng)的復(fù)方新藥。

從臨床出發(fā)，基于信號(hào)通路的復(fù)方新藥研發(fā)途徑如圖1所示。本文以和中日友好醫(yī)院李平教授團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)展的糖腎方治療糖尿病腎?。―N）的臨床數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，開(kāi)展的候選復(fù)方新藥研究實(shí)踐為實(shí)例進(jìn)行闡述。

3 糖腎方治療DN研發(fā)候選復(fù)方新藥的途徑與實(shí)踐

經(jīng)過(guò)隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證了糖腎方是治療DN的有效方劑；采用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)糖腎方干預(yù)DN療效相關(guān)的通路；采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)糖腎方整體化學(xué)物質(zhì)組的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，確定糖腎方化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)；采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)糖腎方中主要活性成分潛在的作用靶點(diǎn)和通路；整合臨床系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的相關(guān)通路，鎖定糖腎方干預(yù)DN的關(guān)鍵通路，并通過(guò)溯源分析，預(yù)測(cè)“有效化學(xué)成份群”，作為糖腎方干預(yù)DN組分新藥的候選藥物，進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞模型和動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1 從臨床出發(fā)、以通路為靶標(biāo)的復(fù)方新藥發(fā)現(xiàn)途徑

基本途徑（圖1）可分為11個(gè)方面：（1）糖腎方治療DN的隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)；（2）DN橫斷面的臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究；（3）糖腎方治療DN臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究；（4）糖腎方化學(xué)物質(zhì)組學(xué)分層次整體研究；（5）糖腎方干預(yù)db/db小鼠的整體系統(tǒng)生物學(xué)研究；（6）基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的糖腎方干預(yù)DN作用靶點(diǎn)和通路預(yù)測(cè)；（7）由關(guān)鍵作用通路溯源“有效化學(xué)成分群”；（8）網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得結(jié)果的分子生物學(xué)驗(yàn)證；（9）基于細(xì)胞模型的候選復(fù)方新藥優(yōu)化和驗(yàn)證；（10）由臨床系統(tǒng)生物學(xué)聚焦而得整合生物標(biāo)志物體系及作用；（11）傳統(tǒng)新藥研發(fā)過(guò)程（包括藥學(xué)與臨床前藥理、藥效學(xué)研究、急性毒性/長(zhǎng)期毒性研究等臨床前藥學(xué)研究，臨床試驗(yàn)階段和上市后再評(píng)價(jià)）。

3.1 糖腎方治療DN的隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照臨床研究

DN是糖尿病的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，具有高患病率和高死亡率的特點(diǎn)。顯性蛋白尿是DN疾病進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素，加速了DN進(jìn)展至終末期腎病。

20世紀(jì)80年代，名老中醫(yī)時(shí)振聲教授提出“氣陰兩虛”是慢性腎臟病的發(fā)病關(guān)鍵[24]。中醫(yī)藥治療DN的1464篇臨床隨機(jī)對(duì)照研究文獻(xiàn)回顧性研究，發(fā)現(xiàn)DN患者中頻次大于20%的證候依次為血瘀、氣虛、陰虛、腎虛、肝郁、脾虛和濕濁[25,26]。

多中心流行病學(xué)橫斷面現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查的方法，通過(guò)“病-證結(jié)合”的臨床研究（橫斷面研究），闡釋了DN中醫(yī)證候特點(diǎn)、分布以及變化規(guī)律，以及中醫(yī)證候與西醫(yī)病理分期的相關(guān)性[27]。收集2型DN患者182例（注冊(cè)號(hào)：ChiCTR-TRC-10000843），按照西醫(yī)Mogensen分期標(biāo)準(zhǔn)分為糖尿病（33例）、DN III期（33例）、DN IV期（27例）和DN V期（39例）組，另有正常對(duì)照組（50例）；將DN III期-V期患者按中醫(yī)辨證分型為氣陰兩虛偏陰虛、氣陰兩虛偏陽(yáng)虛和陰陽(yáng)兩虛。表1所示為西醫(yī)Mogensen分期和中醫(yī)辨證分型的相關(guān)性，雖然中西醫(yī)對(duì)疾病診斷判別標(biāo)準(zhǔn)不同，但對(duì)疾病嚴(yán)重程度的判斷基本類同，提示中西醫(yī)可能具有同一生物學(xué)意義。

流行病學(xué)研究表明，從糖尿病發(fā)展到DN，以及DN的發(fā)展過(guò)程中（從III期逐步發(fā)展到V期），尿蛋白、血肌酐、尿素氮等3個(gè)表征腎功能的指標(biāo)顯著增加；腎小球?yàn)V過(guò)率顯著降低。以34項(xiàng)中醫(yī)癥狀的量化評(píng)分比較三個(gè)中醫(yī)辨證分型8個(gè)單證素分布情況，證實(shí)了中醫(yī)理論中認(rèn)為DN的病機(jī)是氣陰兩虛，且貫穿始終，疾病后期陰損及陽(yáng)、陰陽(yáng)兩虛的觀點(diǎn)。在“氣陰兩虛→陰陽(yáng)兩虛”的發(fā)展進(jìn)程中，臨床生化指標(biāo)顯示了與Mo?gensen分期一致的變化趨勢(shì)，提示中醫(yī)辨證分型與西醫(yī)病理分期具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表1 中西醫(yī)臨床診斷相關(guān)性

糖腎方（TSF）由黃芪、生地黃、山萸肉等7味中藥配伍而成，具有“益氣柔肝，活血通絡(luò)”的功效，是針對(duì)DN微量白蛋白尿期及顯性蛋白尿期的臨床經(jīng)驗(yàn)方。兩次糖腎方治療DN的多中心、隨機(jī)雙盲、安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)（注冊(cè)號(hào)：ChiCTR-TRC-10000843，ChiCTRTRC-13003566），證實(shí)糖腎方顯著改善顯性蛋白尿期患者倦怠乏力、肢體麻木等氣虛血瘀相關(guān)癥狀。在微量白蛋白尿期，糖腎方在減少尿蛋白排泄和改善腎小球?yàn)V過(guò)率方面與腎素血管緊張素酶抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑（ACEI/ARB）療效一致，而在延緩腎功能損傷進(jìn)展方面更具優(yōu)勢(shì)；在顯性蛋白尿期，尿蛋白排泄增加，腎小球?yàn)V過(guò)率呈進(jìn)行性下降，西藥治療無(wú)法阻止疾病發(fā)展，糖腎方可顯著降低24 h尿蛋白含量，提高腎小球?yàn)V過(guò)率。此外，糖腎方可減少尿蛋白及尿液肝型脂肪酸結(jié)合蛋白水平，并降低DN微量白蛋白尿患者的尿液TGF-β水平[28-29]。RCT臨床試驗(yàn)證實(shí)了糖腎方臨床療效確切，為深入開(kāi)展糖腎方作用機(jī)制等研究提供了基礎(chǔ)和支撐。

3.2 DN橫斷面的臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究

本研究建立了整合代謝輪廓譜分析（整體效應(yīng)）、七大類百余種磷脂（細(xì)胞膜形成、脂質(zhì)代謝異常、活性氧自由基）、15種脂肪酸（脂毒性、胰島素分泌抑制）、21種嘌呤嘧啶（調(diào)節(jié)腎素釋放、腎血流能量代謝異常）和8種硫醇氨基酸（機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)、糖代謝、腎臟功能）定量分析的定量代謝組學(xué)平臺(tái)技術(shù)，以及14種DN相關(guān)基因PCR定量測(cè)定技術(shù)[30-37]，針對(duì)“3.1節(jié)”多中心流行病學(xué)橫斷面研究病例開(kāi)展了臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究。

圖2 基于西醫(yī)分期的DN橫斷面研究結(jié)果

3.2.1 基于西醫(yī)分期的DN橫斷面研究

西醫(yī)分期研究結(jié)果（圖2A）顯示，患者血漿代謝狀態(tài)隨著疾病進(jìn)展發(fā)生了顯著改變，篩選得到了41個(gè)可表征DN發(fā)展進(jìn)程的內(nèi)源性潛在代謝物生物標(biāo)志物（圖2B）?；蚨拷Y(jié)果顯示（圖2C），AR、AGT、CD?KAL1、IGF2BP2和MTHFR基因的表達(dá)與DN分期顯著相關(guān)。上述結(jié)果表明，能量代謝與脂肪酸代謝異常引起糖脂代謝紊亂是DN發(fā)生發(fā)展的主要原因之一（圖2D）。

3.2.2 基于中醫(yī)分型的DN橫斷面研究

中醫(yī)分型研究中，各組樣本分布呈螺旋狀，病情越嚴(yán)重，樣本距離正常對(duì)照組越遠(yuǎn)（圖3A）。其中，隨著陰虛向陽(yáng)虛的轉(zhuǎn)化，磷脂類代謝物呈下降趨勢(shì)，而嘌呤/嘧啶核苷類代謝物呈上升趨勢(shì)（圖3C），與其在DN西醫(yī)分期中的變化趨勢(shì)（圖3D）基本一致，表明中醫(yī)辨證分型與西醫(yī)病理分期具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。AR、AGT、AGER和IGF2BP2基因的差異表達(dá)與DN的中醫(yī)分型顯著相關(guān)（圖3B）。特別是AR基因，推測(cè)其高表達(dá)與長(zhǎng)期高血糖引起腎臟等結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生微血管病變相關(guān)，高血糖會(huì)導(dǎo)致郁而化熱，燔灼津液而為陰虛。

3.2.3 整合生物標(biāo)志物體系的建立

本研究通過(guò)整合臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究結(jié)果與臨床中西醫(yī)診斷指標(biāo)，建立了包括西醫(yī)病理生化指標(biāo)、生物標(biāo)志物（基因、蛋白質(zhì)和代謝物等）以及中醫(yī)證候指標(biāo)，可應(yīng)用于DN診斷與治療的整合生物標(biāo)志物體系，并對(duì)其進(jìn)行聚焦分析，獲得可易于臨床檢測(cè)的最佳聚焦整合標(biāo)志物群（圖4）。

圖3 基于中醫(yī)分型的DN橫斷面研究結(jié)果

圖4 整合生物標(biāo)志物體系的發(fā)現(xiàn)途徑

圖5 DN中醫(yī)分型對(duì)應(yīng)的代謝標(biāo)志物群[6]

基于西醫(yī)分期研究，得到包括4個(gè)代謝物（肌苷、腺苷、腺苷同型半胱氨酸和亞油酸）以及4個(gè)臨床生化指標(biāo)（腎小球?yàn)V過(guò)率、尿蛋白、尿素氮和血肌酐）在內(nèi)的指標(biāo)群，可作為表征DN發(fā)生發(fā)展及治療藥物療效評(píng)價(jià)的指標(biāo)[6]。在不同層次的潛在生物標(biāo)志物體系判別分析中，臨床生化指標(biāo)群的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為74.7%，以代謝指紋譜篩選的生物標(biāo)志物及與DN發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的嘌呤嘧啶類代謝標(biāo)志物和潛在基因生物標(biāo)志物的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率分別為74.5%、78%和37.7%，整合生物標(biāo)志物體系的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率最高（綜合預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為98.9%）。

基于中醫(yī)辨證分型，發(fā)現(xiàn)了與不同證候顯著相關(guān)的潛在代謝標(biāo)志物群（圖5），進(jìn)一步聚焦得到包括4個(gè)代謝物（肌苷、腺苷、胞嘧啶、S-腺苷同型半胱氨酸）、4個(gè)臨床生化指標(biāo)（尿蛋白、腎小球?yàn)V過(guò)率、尿素氮、血肌酐）和5個(gè)中醫(yī)癥狀指標(biāo)（倦怠乏力、腰膝酸軟、氣短懶言、手足心熱和浮腫）的DN中醫(yī)證候診斷整合指標(biāo)體系。

綜上所述，通過(guò)對(duì)DN的西醫(yī)分期和中醫(yī)辨證分型進(jìn)行的橫斷面臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究，初步探索了疾病的發(fā)展機(jī)制，建立的整合生物標(biāo)志物體系為后期DN的早期診斷和療效評(píng)價(jià)提供了潛在的指標(biāo)。

3.3 糖腎方治療DN的臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究

3.3.1 糖腎方臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究的多組學(xué)分析

本研究針對(duì)“3.1節(jié)”糖腎方治療DN的循證醫(yī)學(xué)臨床研究病例開(kāi)展了臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究，安慰劑組和糖腎方治療組患者采用臨床生化指標(biāo)進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)的同時(shí)，收集血漿進(jìn)行了臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究。

通過(guò)建立血漿miRNAs表達(dá)譜篩選得到與糖腎方治療作用相關(guān)的59個(gè)潛在miRNAs標(biāo)志物（圖6A）；蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了228個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)隨糖腎方治療發(fā)生顯著變化（圖6B）；定量代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)糖腎方治療后，患者血漿代謝狀態(tài)趨向正常對(duì)照（圖6C）。對(duì)上述臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，聚焦構(gòu)建了糖腎方作用的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（圖6D所示）。糖腎方通過(guò)調(diào)節(jié)PPAR信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、Jak-STAT、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、脂肪酸代謝等信號(hào)通路參與調(diào)控機(jī)體的免疫功能、炎癥反應(yīng)、代謝紊亂及細(xì)胞凋亡等功能，發(fā)揮其治療DN的作用。

3.3.2 PPAR通路是糖腎方治療DN的關(guān)鍵（君）通路之一

PPAR（過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體）通路在脂肪細(xì)胞分化、脂肪酸代謝、胰島素抵抗中起重要作用[38,39]。對(duì)富集到PPAR通路的潛在標(biāo)志物進(jìn)行定量測(cè)定，部分結(jié)果(圖6E)所示。miR-7108-5p和miR-6833-3P分別負(fù)調(diào)控adiponectin和MMP-1蛋白質(zhì)表達(dá)，從而有效控制了最終代謝產(chǎn)物飽和游離脂肪酸與游離脂肪酸的水平，給藥6個(gè)月后，其總量均顯著下降（P＜0.05）。雖然安慰劑對(duì)照組通過(guò)基礎(chǔ)治療也可在一定程度上調(diào)控潛在標(biāo)志物表達(dá)與脂肪酸水平，但整體療效不如糖腎方，從代謝物水平證實(shí)了糖腎方對(duì)PPAR通路的調(diào)節(jié)作用[34,36]。

綜上所述，糖腎方對(duì)延緩DN發(fā)展具有良好的療效，PPAR通路是糖腎方發(fā)揮特有調(diào)控作用的關(guān)鍵（君）通路之一。

3.4 糖腎方化學(xué)物質(zhì)組學(xué)分層次整體研究

化學(xué)物質(zhì)組學(xué)把具有明確臨床療效的復(fù)方中藥作為整體化學(xué)物質(zhì)組，以生物活性為導(dǎo)向，層次化、逐層遞進(jìn)地逐步篩選出具有最小化學(xué)組成但仍保留其療效的最優(yōu)化學(xué)物質(zhì)組，有自上而下和自下而上兩種應(yīng)用模式（圖7）。糖腎方（TSF）由黃芪、生地黃、山萸肉、三七、大黃、鬼箭羽、枳殼等7味中藥配伍而成。采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)糖腎方（整體化學(xué)物質(zhì)組）及各配伍藥材（各子化學(xué)物質(zhì)組的）的化學(xué)成分進(jìn)行全息表征和解析鑒定，鑒定了糖腎方中9大類73個(gè)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)（表2）。

進(jìn)而整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、糖腎方治療DN臨床系統(tǒng)生物學(xué)、動(dòng)物模型系統(tǒng)生物學(xué)研究及分子生物學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的糖腎方調(diào)控的關(guān)鍵通路信息，篩選預(yù)測(cè)其治療DN的有效組分群（表2），提示糖腎方中各味藥材（子化學(xué)物質(zhì)組）通過(guò)各自藥效物質(zhì)基礎(chǔ)（有效化學(xué)物質(zhì)組），各司其職，通過(guò)對(duì)腎組織纖維化、糖脂代謝紊亂、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等的調(diào)節(jié)發(fā)揮藥效。

采用Luciferase reporter穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株技術(shù)，分析糖腎方系列方藥對(duì)TGFβ1/Smad、AP-1、STAT3、NF-κB及NRF2等5個(gè)信號(hào)通路的影響。方中枳殼、鬼箭羽和大黃對(duì)TGFβ1/Smad通路（纖維化發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵通路）和AP-1通路（體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，高糖狀態(tài)能上調(diào)TGFβ1、Fibronectin等基因）均具有抑制作用；黃芪對(duì)NRF2通路（調(diào)控氧化應(yīng)激）具有明顯上調(diào)作用，其有效成分為毛蕊異黃酮-7-β-O-D-葡萄糖苷[40]。后續(xù)研究中，將采用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)靶向制備各有效組分群，深入探究各個(gè)配伍化學(xué)信息與藥效信息的相關(guān)性，弄清各組分之間的相互關(guān)系，去粗存精，重新配伍構(gòu)成有效化學(xué)物質(zhì)組。并綜合考慮各成分的口服生物利用度、吸收、分布、代謝和排泄等特征，發(fā)現(xiàn)和辨識(shí)有效成分群。

3.5 糖腎方干預(yù)動(dòng)物模型的整體系統(tǒng)生物學(xué)研究

db/db小鼠是目前使用最廣泛的2型糖尿病小鼠模型[41]。db/db小鼠8周齡血糖明顯升高，出現(xiàn)白蛋白尿，12周起出現(xiàn)明顯腎損傷，其病程進(jìn)展與人類相似。故本研究采用db/db小鼠作為DN早期病變的動(dòng)物模型，整合基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)開(kāi)展了糖腎方治療DN的整體系統(tǒng)生物學(xué)研究，進(jìn)一步驗(yàn)證并闡釋其作用機(jī)制。

3.5.1 經(jīng)典藥理學(xué)評(píng)價(jià)

8周齡雄性db/db小鼠隨機(jī)分為模型組、糖腎方組及陽(yáng)性對(duì)照組（氯沙坦），db/m小鼠（C57/BL6）作為正常對(duì)照組，連續(xù)給藥12周。相較于模型組，糖腎方干預(yù)可顯著抑制db/db小鼠血糖升高和尿白蛋白排泄增加；改善DN發(fā)展所致胰島形態(tài)不規(guī)則，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目變少且排列分布不均勻等胰島組織病變；同時(shí)可減輕模型動(dòng)物腎小球肥大和腎組織纖維化程度（圖8），提示糖腎方減輕腎組織損傷，減緩DN發(fā)展[42,43]。

圖6 基于臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究構(gòu)建的糖腎方作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 中藥化學(xué)物質(zhì)組學(xué)的“自上而下”、“自下而上”兩種分層次、逐層遞進(jìn)的應(yīng)用模式[7]

表2 糖腎方整體化學(xué)物質(zhì)組化學(xué)成分

3.5.2 基因組學(xué)研究

建立給藥0周和12周各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎組織基因表達(dá)譜，通過(guò)與模型組比較，糖腎方組篩選得到1670個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)1177個(gè)，下調(diào)127個(gè)。對(duì)其進(jìn)行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)糖腎方主要通過(guò)調(diào)控Jak-STAT、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、MAPK信號(hào)通路、嘌呤代謝、胰島素、Wnt等14條通路發(fā)揮其對(duì)db/db小鼠的治療作用。

3.5.3 蛋白質(zhì)組學(xué)研究

細(xì)胞因子及其受體廣泛參與了DN的腎臟微血管病理生理過(guò)程，可影響到細(xì)胞外基質(zhì)成分的積聚、細(xì)胞肥大和細(xì)胞增生等諸多方面[44]。本研究從腎臟蛋白質(zhì)表達(dá)水平探索了糖腎方的作用機(jī)制。采用蛋白質(zhì)芯片建立腎臟組織中640個(gè)蛋白因子的表達(dá)譜，組間比較篩選得到275個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)與糖腎方療效相關(guān)。對(duì)其聚類分析發(fā)現(xiàn)，相較于安慰劑組，糖腎方組樣本不僅聚為一類，而距離模型組更遠(yuǎn)，說(shuō)明其對(duì)db/db小鼠的干預(yù)作用更為顯著。對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行通路富集發(fā)現(xiàn)，JAK-STAT和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用是顯著性最高的兩條通路。

圖8 基于db/db小鼠模型的整體系統(tǒng)生物學(xué)研究

圖8 -1基于db/db小鼠模型的整體系統(tǒng)生物學(xué)研究之“經(jīng)典藥理評(píng)價(jià)”

圖8 -2基于db/db小鼠模型的整體系統(tǒng)生物學(xué)研究之“基因組學(xué)”

圖8 -3基于db/db小鼠模型的整體系統(tǒng)生物學(xué)研究之“蛋白質(zhì)組學(xué)”

圖8 -4基于db/db小鼠模型的整體系統(tǒng)生物學(xué)研究之“代謝組學(xué)”

整合分析基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Jak-STAT信號(hào)通路是最關(guān)鍵的信號(hào)通路之一。對(duì)富集到Jak-STAT通路的5個(gè)蛋白因子IL-2、IL-6、IL-13、IL-15、IFNγ和 7 個(gè) 基 因 JAK1、JAK2、STAT3、STAT4、SOCS1、SOCS3、SOCS7進(jìn)行了定量測(cè)定。糖腎方治療12周，IL-2，IL-6，Il-15和IFNγ的表達(dá)增加，而IL-13表達(dá)下降，其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制Jak-STAT和炎癥介質(zhì)的生成抑制炎癥反應(yīng)，緩解臟纖維化；基因表達(dá)除Stat4被抑制外，其它6個(gè)均被激活，提示糖腎方可使SOCS家族過(guò)度表達(dá)，負(fù)反饋調(diào)節(jié)Stat4的表達(dá)，使得血糖水平得到控制，改善DN腎組織的生理病理特征，從而達(dá)到對(duì)DN的治療作用。

3.5.4 代謝組學(xué)研究

本研究采用UPLC/TOF-MS對(duì)給藥前后db/db小鼠的血清和尿液進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)PLS-DA分析顯示，糖腎方組和陽(yáng)性對(duì)照組聚集在一起，與模型組及正常組達(dá)到較好分離，說(shuō)明藥物干預(yù)后db/db小鼠的代謝狀態(tài)發(fā)生明顯改善，趨向正常。組間對(duì)比篩選鑒定得到16個(gè)與糖腎方作用相關(guān)的潛在代謝生物標(biāo)志物，涉及三羧酸循環(huán)、氨基酸、嘌呤嘧啶、膽汁酸合成以及α-亞麻酸和亞油酸循環(huán)等代謝途徑。db/db小鼠給藥前后尿液代謝軌跡圖可以看出，隨著給藥時(shí)間的增加，小鼠尿液代謝狀態(tài)偏離模型組，趨向正常，趨勢(shì)較血清代謝更為明顯。篩選鑒定的10個(gè)潛在代謝標(biāo)志物主要涉及氨基酸代謝、嘧啶代謝和固醇類代謝。

綜上所述，基于db/db小鼠模型的整體系統(tǒng)生物學(xué)研究證實(shí)糖腎方治療DN確有療效，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)Jak-STAT、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子相互作用通路、MAPK、嘌呤代謝、Wnt等信號(hào)通路，調(diào)控模型動(dòng)物小鼠能量代謝、嘧啶代謝及固醇類代謝紊亂，這與臨床研究發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵通路略有不同。臨床研究顯示糖腎方調(diào)節(jié)的關(guān)鍵通路是PPAR信號(hào)通路，其次為脂肪細(xì)胞因子、Jak-STAT等信號(hào)通路。其原因可能與db/db小鼠主要發(fā)病機(jī)制為脂代謝異常與炎癥反應(yīng)相關(guān)。由此可見(jiàn)，動(dòng)物模型不能完全模擬臨床疾病，在實(shí)際研究中，應(yīng)建立不同誘導(dǎo)機(jī)制的多種模型，才能為臨床疾病及研究提供更科學(xué)、全面的研究參考。

3.6 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的TSF干預(yù)DN作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路預(yù)測(cè)

“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”[20]可通過(guò)分析藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)，構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，為闡釋中藥及其復(fù)方多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理提供了新的思路和視角。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從整體性的角度對(duì)TSF干預(yù)DN的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制進(jìn)行探討。

3.6.1 潛在作用靶點(diǎn)和通路預(yù)測(cè)

采用PharmMapper反向藥效團(tuán)模型預(yù)測(cè)了TSF整體化學(xué)物質(zhì)組中73個(gè)成分的206個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。通過(guò)Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索已被FDA批準(zhǔn)注冊(cè)的用于治療DN的西藥及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息，共得到治療DN疾病的西藥主要有31種，共有43個(gè)作用靶點(diǎn)。通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜索已報(bào)道的、與DN相關(guān)的基因，去除重復(fù)基因和假陽(yáng)性基因，結(jié)果顯示共有174個(gè)基因參與調(diào)控DN的發(fā)生和發(fā)展。

采用Pharmmaper預(yù)測(cè)TSF中的化學(xué)成分有206個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，與DN相關(guān)的靶點(diǎn)有21個(gè)，與FDA批準(zhǔn)的西藥共同作用的靶點(diǎn)有5個(gè)。其中ACE（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶）、CFTR（囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白）、HMGCR（3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶）和INSR（胰島素受體）等4個(gè)靶點(diǎn)為TSF和西藥（FDA drugs）共同調(diào)控、與DN相關(guān)的基因靶點(diǎn)。

作用于CFTR和INSR靶點(diǎn)的西藥分別為格列本脲和甘精胰島素等，是臨床上較為常用的控制血糖的藥物。來(lái)源于山茱萸中的環(huán)烯醚萜類化合物當(dāng)藥苷（Sweroside）與格列本脲同作用于CFTR靶點(diǎn)。CFTR是葡萄糖依賴性的電活性和胰島素分泌β細(xì)胞的調(diào)節(jié)器[45]。生地黃中的環(huán)烯醚萜苷類化合物乙酰基梓醇（Acetylcatalpol）、地黃苦苷元（Rehmapicrogenin），苯乙醇苷類化合物肉蓯蓉苷A、肉蓯蓉苷H和松果菊苷，以及枳殼中的柚皮苷（Narirutin）均作用于INSR靶點(diǎn)，該基因編碼胰島素受體不同亞型的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體，與胰島素具有特殊的親和力，受體基因突變或缺失、合成減少或降解加速，親和力降低、β亞單位酪氨酸激酶活性降低，均可導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，從而導(dǎo)致血糖升高。ACE可催化將血管緊張素I轉(zhuǎn)化為具有生理活性的血管緊張素II。抑制ACE的活性可延緩DN的進(jìn)展[46]，腎ACE2的脫落介導(dǎo)DN的疾病機(jī)制，并且尿ACE2可以作為腎損傷的預(yù)警指標(biāo)，抑制其活性有助于保護(hù)腎功能[47]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類（ACEI）藥物是目前公認(rèn)的在預(yù)防和治療DN、減少尿蛋白排泄最有效的藥物，作用于ACE的西藥為依那普利、苯那普利、卡托普利、福辛普利、培哚普利、西拉普利等ACEI類藥物，山茱萸中的馬來(lái)酸（Malic acid）作用于該靶點(diǎn)。脂代謝異常在糖尿病微血管病及DN的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展中起到重要作用，調(diào)節(jié)脂代謝紊亂對(duì)控制糖尿病及其并發(fā)癥、降低DN心血管病發(fā)生率和病死率具有重要意義，他汀類降脂藥是最為常用的脂代謝紊亂調(diào)節(jié)劑；山茱萸中的環(huán)烯醚萜類化合物馬錢子苷（Lo?ganin）與他汀類藥物共同作用于HMGCR靶點(diǎn)，而該靶點(diǎn)是膽固醇合成的限速酶。

綜上所述，TSF中主要化學(xué)成分具有與西藥相同的作用靶點(diǎn)，一方面提示TSF具有控制血糖，調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，調(diào)整血壓和減少尿蛋白排泄等藥理作用，另一方面揭示了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特性。

將TSF潛在作用靶點(diǎn)、DN相關(guān)靶點(diǎn)基因及DN的西藥作用靶點(diǎn)基因分別導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析，TSF對(duì)DN的調(diào)控作用主要涉及73條通路，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的西藥對(duì)DN的調(diào)控作用主要涉及20條通路，其中有14條通路為TSF和FDA批準(zhǔn)的西藥共同調(diào)控的通路。另有9條通路，為已經(jīng)系統(tǒng)生物學(xué)研究驗(yàn)證的TSF調(diào)控通路，但在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，并未預(yù)測(cè)到它們是DN疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因注釋通路。

3.6.2 關(guān)鍵通路

根據(jù)TSF中主要化學(xué)成分潛在作用通路、DN發(fā)生發(fā)展相關(guān)通路以及治療DN西藥的潛在作用通路，整合系統(tǒng)生物學(xué)研究結(jié)果，選擇經(jīng)系統(tǒng)生物學(xué)驗(yàn)證的TSF調(diào)控DN的關(guān)鍵通路，分別為磷脂酰肌醇-3-激酶-絲蘇氨酸蛋白激酶信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling path?way）、蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路（PPAR signaling pathway）、胰島素抵抗通路（Insulin re?sistance）、胰島素信號(hào)通路（Insulin signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、FcεRI信號(hào)通路（Fc epsilon RI signaling pathway）、T細(xì)胞受體信號(hào)通路（T cell receptor signaling pathway）、核苷酸寡聚化域樣受體信號(hào)通路（NOD-like receptor sig?naling pathway）、粘著斑（Focal adhesion）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路（VEGF signaling pathway）等11條通路。

圖9所示為TSF中73個(gè)活性成分作用于206個(gè)靶點(diǎn)注釋的11條關(guān)鍵通路及其對(duì)應(yīng)的生物學(xué)功能，提示TSF通過(guò)對(duì)胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂的調(diào)控，以及免疫功能和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，改善腎組織纖維化狀態(tài)和細(xì)胞凋亡而治療DN[48-55]。其中TSF對(duì)PPAR信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路的調(diào)控作用在其治療DN的臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究和分子生物學(xué)研究中得到驗(yàn)證。但也有一些在整體系統(tǒng)生物學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的通路在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)富集通路中未能找到，推測(cè)有兩方面原因，一方面是由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在已有的西藥小分子作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)基礎(chǔ)上的，其收錄內(nèi)容受數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容所限，影響預(yù)測(cè)結(jié)果；另一方面網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)工具所采用算法的局限性也會(huì)影響預(yù)測(cè)結(jié)果，這兩點(diǎn)原因也是現(xiàn)在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究亟待突破的問(wèn)題。

3.7 由關(guān)鍵作用的通路溯源“有效化學(xué)成分群”

基于前述從臨床出發(fā)，以通路為靶標(biāo)的研發(fā)策略，以糖腎方為例，開(kāi)展了基于信號(hào)通路的新藥發(fā)現(xiàn)（圖10），該新藥發(fā)現(xiàn)策略可為后續(xù)新藥研發(fā)提供藥理機(jī)制比較明確、具有開(kāi)發(fā)前景的候選新藥。

整合糖腎方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)和臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究結(jié)果，得到PPAR、2型DN、脂肪因子和淀粉和蔗糖代謝4條重要通路。其中，PPAR和脂肪因子信號(hào)通路所涉及的功能和靶點(diǎn)類似；2型DN涉及的西藥主要是胰島素和格列類降糖藥，與胰島素水平和機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性相關(guān)；淀粉和蔗糖代謝主要是阿卡波糖的靶點(diǎn)，其功效為配合飲食控制治療2型糖尿病。考慮到DN患者已是糖尿病發(fā)展的中后期，出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)病，通過(guò)合理控制飲食已很難控制或逆轉(zhuǎn)疾病。因此，優(yōu)選關(guān)鍵（君）信號(hào)通路PPAR和2型DN兩條通路開(kāi)展“有效化學(xué)成份群”溯源。通過(guò)富集在關(guān)鍵通路中的中藥成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，逆向?qū)ふ覍?duì)應(yīng)的有效化學(xué)成分，并確認(rèn)藥材歸屬，結(jié)果詳見(jiàn)表3。

從表3可知，作用于PPAR信號(hào)通路的中藥為：黃芪（2）、三七（6）、山茱萸（1）、熟大黃（3）、衛(wèi)矛（1）、生地黃（2）；作用于2型DN信號(hào)通路的中藥為：枳殼（1）、生地黃（5）、熟大黃（1）。黃芪具有益氣固表、利水消腫的功效，黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分；三七具有活血化瘀的功效，人參皂苷Rg1和三七皂苷R1是三七的主要成分，它們作用于PDPK1、RXRA和RXRB3個(gè)靶點(diǎn)；山茱萸具有補(bǔ)益肝腎的功效，二甲基蘋果酸酯對(duì)FABP5和RXRB具有潛在調(diào)控作用，但二甲基蘋果酸酯是山茱萸中的微量成分，莫諾苷為山茱萸特征性指標(biāo)成分，且對(duì)高糖致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，可降低糖尿病大鼠血糖、尿蛋白、血清白蛋白和總蛋白水平。生地黃具有清熱生津的功效，其中主要的環(huán)烯醚萜苷類成分潛在的作用靶點(diǎn)為PDPK1和IN?SR。綜合藥效預(yù)測(cè)、藥材的功效、有效成分的含量及藥理活性，進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證的中藥候選復(fù)方優(yōu)選來(lái)自黃芪、三七、山茱萸和生地黃的5個(gè)藥效成分：人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、黃芪甲苷、莫諾苷、梓醇。

圖9 “藥材-通路-生物活性”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

圖10 基于信號(hào)通路的組分新藥發(fā)現(xiàn)策略示意圖

表3 PPAR信號(hào)通路中中藥預(yù)測(cè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的成分及藥材歸屬

3.8 分子生物學(xué)驗(yàn)證

由3.6節(jié)所得11條重要通路，除了系統(tǒng)生物學(xué)研究得到的真實(shí)通路之外，需對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的通路進(jìn)行了分子生物學(xué)驗(yàn)證。

3.8.1 NF-κB信號(hào)通路和TGF-β/Smad3通路

TSF可顯著降低高脂飲食合并鏈尿佐菌素誘導(dǎo)的DN模型大鼠腎小球系膜基質(zhì)百分比和腎小管損傷指數(shù)；顯著降低模型大鼠微量白蛋白尿、血清甘油三酯、膽固醇和低密度脂蛋白水平。TSF可抑制Smurf2表達(dá)，減少smad7水解，從而一方面促進(jìn)IκBα表達(dá)，抑制NF-κB驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)；另一方面降低Smad2/3磷酸化水平，減輕TGF-β/Smad3介導(dǎo)的腎臟纖維化[40]。TSF可改善db/db模型小鼠在DN發(fā)展所致胰島形態(tài)不規(guī)則，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目變少且排列分布不均勻等胰島組織病變；減輕模型動(dòng)物腎小球肥大，減輕纖維化程度。該保護(hù)作用的機(jī)制可能是：TSF抑制NF-κB通路誘導(dǎo)的炎癥因子異常升高，阻斷miRNA21介導(dǎo)的TGF-β/Smad通路，減少纖維化I、IV型膠原積聚，通過(guò)調(diào)控JAK/STAT/SCOS通路同時(shí)改善了炎癥與纖維化，減少其對(duì)腎小球?yàn)V過(guò)屏障及腎小管重吸收功能的損害，降低尿蛋白的排泄[56]。

此外，TSF可降低db/db小鼠體重和肝臟系數(shù)，抑制尿白蛋白排泄增加，降低血脂水平，顯著改善模型小鼠脂質(zhì)代謝紊亂和肝臟脂肪變；相關(guān)機(jī)制與TSF通過(guò)AMPK/SREBPs及其下游靶基因顯著抑制db/db小鼠肝組織脂質(zhì)生成、通過(guò)Sirt·PGC1α-1增加肝組織與骨骼肌脂肪酸氧化利用，調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及巨噬細(xì)胞活化等代謝途徑相關(guān)[57]。

3.8.2 TSF對(duì)2型糖尿病胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究

TSF可促進(jìn)HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型的葡萄糖消耗，降低細(xì)胞中甘油三酯的蓄積，改善細(xì)胞糖脂代謝，并增加細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）和降低丙二醛（MDA）含量，改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。TSF對(duì)HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型中PI3K/AKT/SREBP-1c通路上6個(gè)重要功能基因的表達(dá)定量結(jié)果表明，與模型組相比，TSF可顯著增加HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型中PI3K p58、AKT1、GLUT4、PPARα基因表達(dá)水平，顯著降低SREBP-1c和FASN基因表達(dá)水平，表明TSF可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/SREBP-1c通路重要基因表達(dá)干預(yù)2型糖尿病胰島素抵抗的作用。

3.9 基于細(xì)胞模型的候選復(fù)方新藥優(yōu)化和驗(yàn)證

DN特征性的病理改變?yōu)槟I小球基底膜均勻肥厚伴有腎小球系膜細(xì)胞基質(zhì)增多、腎小球囊和腎小球系膜細(xì)胞呈結(jié)節(jié)性肥厚及滲透性增加[58,59]。系膜細(xì)胞的生理特性決定了它是DN眾多致病因子作用的主要靶細(xì)胞之一。采用高糖刺激下人腎小球系膜細(xì)胞（HMC）模型，對(duì)候選復(fù)方（人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、黃芪甲苷、莫諾苷、梓醇）進(jìn)行了初步處方優(yōu)化及藥效評(píng)價(jià)。

3.9.1 候選復(fù)方的處方優(yōu)化

首先成功建立高糖刺激下HMC模型，確定高糖刺激48 h細(xì)胞增殖異常顯著，且可持續(xù)至72 h，因此，確定高糖刺激造模時(shí)間為48 h。基于此模型，通過(guò)細(xì)胞活性考察確定了5種中藥成分的濃度考察范圍，發(fā)現(xiàn)復(fù)方作用優(yōu)于單成分作用，其中，黃芪甲苷為1-10 μM；人參皂苷Rg1為25-60 μM；三七皂苷R1為1-10 μM；梓醇為1-10 μM；莫諾苷為1-10 μM。

表4 糖尿病不同分期聚焦整合生物標(biāo)志物群

其次，采用5因素10水平的均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)復(fù)方組成的配伍比例進(jìn)行優(yōu)化，篩選確定水平3（黃芪甲苷3.0 μM、三七皂苷R1 56.1 μM、人參皂苷Rg1 1.0 μM、梓醇4.0 μM、莫諾苷5.0 μM）為最佳復(fù)方配伍，其對(duì)高糖導(dǎo)致的HMC的異常增殖抑制作用最為顯著且作用穩(wěn)定，且優(yōu)于各單成分作用。

3.9.2 優(yōu)化復(fù)方對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)TGF-β1、Col I和Col III分泌的影響

分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）和膠原蛋白在糖尿病腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要的角色[60]，持續(xù)高糖刺激能促進(jìn)很多與DN發(fā)病相關(guān)的細(xì)胞因子（如TGF-β1、Col I和Col III、ANG II和VEGF等）的表達(dá)。本研究所建立的高糖刺激下HMC的TGF-β1、Col I和Col III外分泌均顯著增加；而加入最佳配伍復(fù)方后，高糖刺激下HMC的TGF-β1、Col I和Col III的異常分泌均具有顯著改善，蛋白表達(dá)水平均接近正常細(xì)胞（P＞0.05），且優(yōu)于各單體化合物的作用，體現(xiàn)了中藥復(fù)方配伍增效的作用。

3.10 由臨床系統(tǒng)生物學(xué)聚焦而得整合生物標(biāo)志物體系和應(yīng)用

基于DN橫斷面的臨床生物學(xué)研究，構(gòu)建了整合臨床指標(biāo)、代謝生物標(biāo)志物和基因生物標(biāo)志物的生物標(biāo)志物體系。其中包括11種臨床指標(biāo)：血糖控制指標(biāo)（空腹血糖、餐后2小時(shí)血糖、糖化血紅蛋白）、腎功能指標(biāo)（尿蛋白、血肌酐、尿素氮、腎小球?yàn)V過(guò)率估算值）和血脂指標(biāo)（膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白）；41種代謝生物標(biāo)志物（圖2B）；5種基因標(biāo)志物：CDKAL1，IGF2BP2，AR，AGT和MTHFR。

3.1 0.1 整合生物標(biāo)志物體系的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

將整合生物標(biāo)志物體系中各生物標(biāo)志物含量與臨床生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示其與臨床表征腎病的腎功能指標(biāo)（尿蛋白、腎小球?yàn)V過(guò)率、尿素氮和血肌酐）和表征糖尿病的血糖控制指標(biāo)（糖化血紅蛋白和餐后血糖）具有顯著相關(guān)性，表明將生物標(biāo)志物用于臨床診斷是可行的，但是該體系包含生物標(biāo)志物數(shù)目眾多，不適于臨床實(shí)際檢測(cè)。研究中發(fā)現(xiàn)不同類型的標(biāo)志物在疾病進(jìn)程中的作用并不相同，例如磷脂類代謝物主要與血糖控制指標(biāo)相關(guān)，游離脂肪酸類代謝物主要與腎功能及腎損傷指標(biāo)相關(guān)；前者在進(jìn)行預(yù)測(cè)診斷時(shí)，較適合用于糖尿病的診斷，后者較適合用于DN不同分期的診斷。因此，有必要對(duì)所建立的整合生物標(biāo)志物體系進(jìn)行聚焦、評(píng)價(jià)，探索疾病早期診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和藥物篩選的最佳生物標(biāo)志物體系。

3.1 0.2 整合生物標(biāo)志物體系聚焦分析及應(yīng)用

（1）DN早期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)聚焦和評(píng)價(jià)

通過(guò)對(duì)DM和DN各期生物標(biāo)志物的聚焦分析發(fā)現(xiàn)肌苷和eGFR水平結(jié)合對(duì)DN 1期和2期具有較高的分離能力，利用肌苷和eGFR水平經(jīng)過(guò)PLS-DA聚類分析后，DM、DN 1期和2期患者可以實(shí)現(xiàn)較好分離。該研究為臨床上缺乏DN的1期和2期準(zhǔn)確診斷指標(biāo)的問(wèn)題提供了解決方法，并在國(guó)內(nèi)外首次報(bào)告肌苷可以早期預(yù)測(cè)糖尿病腎病發(fā)生與進(jìn)展[61]。加拿大卡爾加里大學(xué)Matthias教授以“代謝組學(xué)與2型糖尿病，從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用”為題，給予了高度的評(píng)價(jià)[62]。

（2）DN治療藥物療效評(píng)價(jià)指標(biāo)聚焦和評(píng)價(jià)

應(yīng)用建立的整合生物標(biāo)志物體系，分別聚焦對(duì)DN各期具有診斷能力的生物標(biāo)志物（表5）。將這3個(gè)階段的指標(biāo)進(jìn)行整合，得到一個(gè)包含4個(gè)臨床指標(biāo)和4個(gè)代謝生物標(biāo)志物的指標(biāo)群，其對(duì)各個(gè)階段的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率均達(dá)到90%以上，可將其作為表征DN發(fā)生發(fā)展的重要指標(biāo)，也可作為聯(lián)合用藥的療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.1 0.3 糖尿病腎病中醫(yī)證候的可量化指標(biāo)體系

整合生物標(biāo)志物體系對(duì)氣陰兩虛偏陰虛、氣陰兩虛偏氣虛和陰陽(yáng)兩虛患者的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率接近100%。我們嘗試用“整體表征”與“局部特征”結(jié)合的模式，聚焦建立了可量化中醫(yī)證候的生物標(biāo)志物群。通過(guò)對(duì)三種證候的8類34種癥狀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)氣陰兩虛偏陰虛主要表現(xiàn)為陰虛內(nèi)熱、腎陰虛癥狀；偏氣虛主要表現(xiàn)為肺氣虛、腎陰虛癥狀；陰陽(yáng)兩虛主要表現(xiàn)為腎陽(yáng)虛、肺氣虛、腎陰虛及血瘀癥狀。并且通過(guò)相關(guān)性分析得到與這項(xiàng)癥狀顯著相關(guān)的代謝生物標(biāo)志物（表6），表明中醫(yī)證候有其特定的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)其相關(guān)代謝物含量進(jìn)行檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)證候的客觀量化。

表5 與糖尿病腎病中醫(yī)分型癥狀顯著相關(guān)的代謝生物標(biāo)志物

綜上所述，基于臨床系統(tǒng)生物學(xué)研究建立的整合生物標(biāo)志物體系可以準(zhǔn)確表征DN的發(fā)展進(jìn)程，對(duì)其聚焦分析得到的不同生物標(biāo)志物群，不僅可以分別用于DN早期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、疾病精準(zhǔn)分期及藥效評(píng)價(jià)，而且大幅縮減標(biāo)志物的數(shù)量，滿足臨床檢驗(yàn)實(shí)際需求，使生物標(biāo)志物檢測(cè)進(jìn)入臨床應(yīng)用成為可能。

3.11 傳統(tǒng)新藥研發(fā)過(guò)程

包括藥學(xué)與臨床前藥理、藥效學(xué)研究、急性毒性/長(zhǎng)期毒性研究等臨床前藥學(xué)研究，臨床試驗(yàn)階段和上市后再評(píng)價(jià)。

4 展望

中國(guó)新藥的研發(fā)模式基本上是遵循國(guó)際西藥開(kāi)發(fā)模式，缺乏科學(xué)理念（理論）的創(chuàng)新，局限在科學(xué)技術(shù)上的創(chuàng)新。如何將東方醫(yī)學(xué)的精髓結(jié)合西方醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)理念（理論）上突破，可能是中國(guó)現(xiàn)代藥學(xué)發(fā)展中的卡脖子（瓶頸）科學(xué)問(wèn)題。從2011年起，筆者從研究實(shí)踐出發(fā)提出了新醫(yī)藥學(xué)的理念。新醫(yī)藥學(xué)或稱整體系統(tǒng)醫(yī)學(xué)（Holistic Systems Medicine，HSM），是以維護(hù)人體系統(tǒng)的整體健康為根本目標(biāo)，融合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥學(xué)，現(xiàn)代中醫(yī)藥學(xué)和現(xiàn)代生命科學(xué)，創(chuàng)立兼取所長(zhǎng)，既高于現(xiàn)代的中醫(yī)，也高于現(xiàn)代的西醫(yī)，解決人類整體健康和疾病預(yù)防、治療的整體系統(tǒng)醫(yī)學(xué)[2]。迄今已連續(xù)發(fā)表五文[2-6]，本文則是從整體系統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的新藥研發(fā)出發(fā)，提出以復(fù)方新藥為現(xiàn)代藥學(xué)新的發(fā)展目標(biāo)，并提出了相應(yīng)策略、途徑和我們的實(shí)踐范例。

自1999年5月國(guó)家科技部啟動(dòng)實(shí)施“中藥現(xiàn)代化”科技工作已經(jīng)20年了，包括之后不久又調(diào)整為“中醫(yī)藥現(xiàn)代化”，中醫(yī)藥向何處去，發(fā)展的方向和目標(biāo)究竟為何物，始終困擾著我們這一代學(xué)者。正如習(xí)近平主席在兩院院士大會(huì)上指出的“我國(guó)科技在視野格局、創(chuàng)新能力、資源配置、體制改革等方面存在諸多不適應(yīng)的地方。”解決的方法就是“發(fā)展科學(xué)技術(shù)必須具有全球視野。”“自主創(chuàng)新是我們攀登世界科技高峰的必由之路”。屠呦呦先生獲諾貝爾獎(jiǎng)后談到：“中醫(yī)藥是寶庫(kù)，但拿來(lái)就用還不夠?！薄叭绻朗刂献孀诘膶氊?，固步自封，中藥只能是‘一筐草’，無(wú)法變成‘一塊寶’”。中醫(yī)藥是巨大寶庫(kù)，但不能固步自封，傳承是我們的責(zé)任，創(chuàng)新是我們的使命。中醫(yī)藥將和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)融合，發(fā)展到毛澤東主席提出的“中國(guó)統(tǒng)一的新醫(yī)學(xué)新藥學(xué)”。我們強(qiáng)烈倡議設(shè)立中國(guó)“新醫(yī)藥學(xué)發(fā)展計(jì)劃”，實(shí)現(xiàn)習(xí)近平主席提出的“主動(dòng)發(fā)起全球性創(chuàng)新議題”。既促進(jìn)中醫(yī)學(xué)的發(fā)展，也促進(jìn)西醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的發(fā)展，為中國(guó)和全球老百姓健康福祉盡心盡力。