香豆素類近紅外熒光染料應(yīng)用研究進(jìn)展*

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，日照 276826)

基于熒光探針的熒光成像技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)胞活動(dòng)可視化和實(shí)時(shí)監(jiān)控，并具有靈敏度高、選擇性好和無創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)，在生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，已成為近幾年研究的熱點(diǎn)[1]。其中，近紅外(near-infrared,NIR)熒光探針(吸收和發(fā)射波長(zhǎng)在600～900 nm之間)因比短波長(zhǎng)探針具有對(duì)生物樣品光損傷小，不受樣品自發(fā)熒光的干擾，且能穿透深層組織等顯著優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。隨著熒光成像技術(shù)在藥物輸送及癌癥診斷和治療等生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，對(duì)NIR熒光探針的需求也日益增加，迫切需要開發(fā)更多新型結(jié)構(gòu)和功能的NIR熒光染料[2]。

香豆素類熒光染料具有優(yōu)異的光物理和化學(xué)性質(zhì)，如熒光量子產(chǎn)率高、Stokes位移大、光穩(wěn)定性好和易于修飾等，被廣泛用于各種離子、活性物質(zhì)的檢測(cè)以及核酸和蛋白質(zhì)分子的熒光標(biāo)記[3]。但該類染料主要在短波長(zhǎng)(400～520nm)區(qū)域發(fā)射，易受背景熒光的干擾，限制了其在活體成像中的應(yīng)用。所以，對(duì)香豆素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，開發(fā)在NIR區(qū)域發(fā)射的香豆素類熒光染料具有重要的學(xué)術(shù)和應(yīng)用價(jià)值。為此，化學(xué)家們付出了大量努力，已開發(fā)了許多新穎的香豆素類NIR熒光染料。本文將根據(jù)結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行分類，對(duì)近幾年報(bào)道的香豆素類NIR熒光染料及其應(yīng)用進(jìn)行歸納總結(jié)，為設(shè)計(jì)開發(fā)更多具有新型結(jié)構(gòu)和功能的香豆素類NIR熒光染料提供參考。

1 含半花菁結(jié)構(gòu)的NIR香豆素類熒光染料

花菁染料是近些年備受青睞的大分子熒光標(biāo)記和顯像染料，具有摩爾吸光系數(shù)大、熒光性能良好等優(yōu)點(diǎn)，但光穩(wěn)定性較差是其一個(gè)嚴(yán)重的缺陷。花菁染料中帶正電的半花菁部分作為優(yōu)異的電子受體，被廣泛用于新型熒光染料的開發(fā)。近些年，科研工作者將半花菁結(jié)構(gòu)引入到香豆素中，開發(fā)出了大量新型的NIR香豆素-半菁類熒光染料，它們的結(jié)構(gòu)見圖1，光學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用見表1。

圖1 含半花菁結(jié)構(gòu)的NIR香豆素類熒光染料

香豆素-半菁類染料可通過不同的反應(yīng)機(jī)制與各種離子、活性物質(zhì)和生物大分子反應(yīng)，從而產(chǎn)生熒光的變化，因此其可作為探針被廣泛用于以上各種物質(zhì)的檢測(cè)和顯像，并且具有選擇性好、靈敏度高以及細(xì)胞滲透性好等優(yōu)點(diǎn)。

另外，將香豆素與半菁結(jié)構(gòu)結(jié)合，不僅能改善花菁部分的光穩(wěn)定性，還能使香豆素的吸收和發(fā)射光譜顯著向NIR區(qū)域移動(dòng)。從表1可知，這些染料均具有較大的發(fā)射波長(zhǎng)和Stokes位移。它們的最大發(fā)射波長(zhǎng)大多在630～720nm的NIR區(qū)域，Stokes位移大多在50～90nm，而化合物7和10b高達(dá)150nm和130nm。

對(duì)比圖1的結(jié)構(gòu)不難發(fā)現(xiàn)，通過延長(zhǎng)共軛鏈可以明顯增大化合物的最大發(fā)射波長(zhǎng)和Stokes位移，如染料7較染料1和2，染料10b較染料10a，最大發(fā)射波長(zhǎng)和Stokes位移均有顯著增大；但隨著共軛鏈的增加，合成難度也會(huì)相應(yīng)增大。通過在結(jié)構(gòu)中引入一些水溶性基團(tuán)，還可以明顯改善染料的水溶性，如染料4和10，分別在結(jié)構(gòu)中引入了羧基和磺酸基，大大提高了它們的水溶性。

總之，香豆素-半菁類染料以其優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，較高的選擇性和靈敏度，良好的細(xì)胞滲透性，多樣的反應(yīng)機(jī)制和易于修飾的優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于生物檢測(cè)和成像，相信未來會(huì)有更多反應(yīng)機(jī)制和新型結(jié)構(gòu)的此類染料會(huì)被設(shè)計(jì)開發(fā)出來。

表1 含半花菁結(jié)構(gòu)的NIR香豆素類熒光染料的光學(xué)性質(zhì)與應(yīng)用

注：λabs，最大吸收波長(zhǎng)，λem，最大發(fā)射波長(zhǎng)，PBS，磷酸緩沖鹽溶液，pH=7.4;Buffer，CH3CN/磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液=1/4。

2 共軛剛性環(huán)并香豆素類NIR熒光染料

將共軛剛性環(huán)引入到熒光母體中，往往能增大其發(fā)射波長(zhǎng)，增強(qiáng)光穩(wěn)定性和提高熒光量子效率?？蒲泄ぷ髡咴谙愣顾氐慕Y(jié)構(gòu)中并入共軛剛性環(huán)，合成了一些具有優(yōu)異光學(xué)性質(zhì)的共軛剛性環(huán)并香豆素類NIR熒光染料。它們的結(jié)構(gòu)見圖2，光學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用見表2。

圖2 共軛剛性環(huán)并香豆素類NIR熒光染料

Wang課題組[13-14]將派洛寧Y結(jié)構(gòu)并入到香豆素中，設(shè)計(jì)合成了多個(gè)半月形(Crescent-shape)香豆素類NIR熒光染料11和12；隨后，該課題組又在結(jié)構(gòu)中引入羧酸，合成了水溶性NIR染料13[15]。Huang等[16]將苯并咪唑結(jié)構(gòu)并入亞氨基香豆素結(jié)構(gòu)合成了新型結(jié)構(gòu)NIR熒光染料14。

從表2可以看出，染料11、12、13的最大發(fā)射波長(zhǎng)在640～690nm的NIR區(qū)域，Stokes位移介于53～78nm之間；結(jié)構(gòu)分析可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)香豆素7-位氮上連有環(huán)狀結(jié)構(gòu)時(shí)，其最大發(fā)射波長(zhǎng)和Stokes位移都要大于連二甲基時(shí)?；诒讲⑦溥蚝蛠啺被愣顾亟Y(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的染料14，雖然Stokes位移較染料11、12、13有所減小，其最大發(fā)射波長(zhǎng)卻高達(dá)715nm以上，這種結(jié)構(gòu)為合成含多種功能基團(tuán)的NIR熒光染料提供一個(gè)新的思路。

細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)證明，染料11、12和13適用于活細(xì)胞中線粒體、溶酶體以及核仁RNA的成像，并具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性、良好的細(xì)胞通透性和較低的細(xì)胞毒性。其中，染料12b通過與核仁RNA結(jié)合，能快速染色活細(xì)胞核仁，比核仁色素SYTO RNASelect，更高的光穩(wěn)定性和選擇性，具有非常好的應(yīng)用前景。

表2 共軛剛性環(huán)并香豆素類NIR熒光染料的光學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用

3 含有二氟硼絡(luò)合物結(jié)構(gòu)的香豆素NIR染料

二氟硼結(jié)構(gòu)是強(qiáng)缺電子體系，是非常好的電子受體。以二氟硼結(jié)構(gòu)為母體的分子大都具有優(yōu)良的光物理和光化學(xué)性能。如二吡咯甲川(BODIPY)是其中的杰出代表，但它們的缺點(diǎn)是Stokes位移一般較小(15～30nm)。將二氟硼結(jié)構(gòu)引入香豆素，一些近紅外發(fā)射的二氟硼-香豆素類染料相繼被開發(fā)出來，其結(jié)構(gòu)見圖3，光學(xué)性質(zhì)見表3。

圖3 含有二氟硼絡(luò)合物結(jié)構(gòu)的香豆素NIR染料

其中，Sekar課題組在二氟硼-香豆素類NIR染料的開發(fā)中做了大量工作，如他們基于姜黃素結(jié)構(gòu)，合成了含有二氟硼結(jié)構(gòu)的雙香豆素染料15和16[3]；將二氟硼和咔唑環(huán)引入到香豆素結(jié)構(gòu)中合成了染料17[17]；將二氟硼和查耳酮結(jié)構(gòu)引入到香豆素中，合成了染料18[18]；將芳基偶氮(Ar-N=N-)和二氟硼引入香豆素中，合成了染料19[19]。Bochkov等[20]將香豆素并入BODIPY中，合成了一系列新型不對(duì)稱香豆素并BODIPY的NIR染料20。

從表3可以看出，這些染料具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，特別是Stokes位移較BODIPY類化合物有著顯著增大，大都在90nm以上，而化合物20高達(dá)144nm。它們的最大發(fā)射波長(zhǎng)均在640nm以上，化合物20和16甚至達(dá)到750和780nm。從圖3中的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，染料最大發(fā)射波長(zhǎng)與連接兩個(gè)芳環(huán)的共軛鏈長(zhǎng)度有關(guān)，如染料15和16的最大發(fā)射波長(zhǎng)明顯大于17，18和19。

雖然二氟硼-香豆素類NIR染料具有較大的最大發(fā)射波長(zhǎng)和Stokes位移，但在極性溶劑中極低的熒光量子產(chǎn)率限制了其在生物檢測(cè)和成像方面的應(yīng)用，未來如能解決這一缺陷，相信這類染料會(huì)有很大的應(yīng)用空間。

表3 含有二氟硼絡(luò)合物結(jié)構(gòu)的香豆素NIR染料的光學(xué)性質(zhì)

4 含多個(gè)氰基的香豆素類NIR熒光染料

氰基作為一個(gè)強(qiáng)吸電子基團(tuán)，是熒光染料中常用的電子受體。在香豆素3-位通過共軛雙鍵引入多氰基基團(tuán)，而在7-位引入給電子基如羥基和二乙胺基，可通過分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)實(shí)現(xiàn)香豆素發(fā)射光譜的紅移。

圖4 含多個(gè)氰基的NIR香豆素?zé)晒馊玖?/p>

表4 含多個(gè)氰基的NIR香豆素?zé)晒馊玖系墓鈱W(xué)性質(zhì)與應(yīng)用

注:HEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液。

從表4可以發(fā)現(xiàn)，這些染料大都具有超過650nm的最大發(fā)射波長(zhǎng)和非常大(>90nm)的Stokes位移，染料22b和24甚至能達(dá)到149和150nm。對(duì)比它們的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，隨著共軛體系的增大，化合物的最大發(fā)射波長(zhǎng)也相應(yīng)發(fā)生紅移，如染料21、22和24的最大發(fā)射波長(zhǎng)依次增大；而Stokes位移與共軛體系大小無直接聯(lián)系。Tathe等[23]通過計(jì)算證實(shí)，在香豆素4-位引入氰基會(huì)使分子發(fā)射光譜發(fā)生明顯紅移。

5 基于羅丹明或苯并吡喃鎓結(jié)構(gòu)的NIR香豆素類熒光染料

羅丹明和苯并吡喃鎓類熒光染料具有對(duì)光穩(wěn)定性好、較寬的波長(zhǎng)范圍和較高的熒光量子產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熒光檢測(cè)和標(biāo)記。為開發(fā)更多新型結(jié)構(gòu)和優(yōu)異性能的熒光染料，科研工作者將香豆素引入到這兩種結(jié)構(gòu)中，開發(fā)了幾種基于羅丹明或苯并吡喃鎓結(jié)構(gòu)的NIR香豆素類熒光染料，其結(jié)構(gòu)見圖5，光學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用見表5。

圖5 基于羅丹明或苯并吡喃鎓結(jié)構(gòu)的NIR香豆素?zé)晒馊玖?/p>

如Chen等[25]將香豆素并入羅丹明分子骨架中，開發(fā)了新型深紅色熒光染料25。25酯化得到的化合物可以選擇性地染色線粒體和檢測(cè)Hg2+。Dai等[26]基于香豆素和苯并吡喃鎓鹽結(jié)構(gòu)，開發(fā)了對(duì)肼有高選擇性和敏感性的NIR比率熒光探針26，對(duì)肼的檢測(cè)限為1.5ppb，并成功地用于胎牛血清和活體細(xì)胞中肼的成像。Niu等[1]將基于香豆素和苯并吡喃鎓鹽，構(gòu)建了三個(gè)新的NIR熒光染料27a-27c。從表5可知，基于羅丹明結(jié)構(gòu)的染料25最大發(fā)射波長(zhǎng)在640～690nm之間，Stokes位移介于50～75nm之間，其最大發(fā)射波長(zhǎng)和Stokes位移隨香豆素7-位氮原子上剛性環(huán)的個(gè)數(shù)增加而變大?；诒讲⑦拎f的香豆素類染料的光學(xué)性質(zhì)受結(jié)構(gòu)影響更為明顯，在香豆素上多一個(gè)苯環(huán)的染料27，其最大發(fā)射波長(zhǎng)和Stokes位移分別達(dá)到814和148nm以上，比染料26分別增大120nm和100nm以上，27是目前已知香豆素染料中擁有最長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)的化合物，為以后設(shè)計(jì)此類NIR染料提供了重要的參考。

細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)表明，這兩類染料都顯示了良好的耐光性和較低的細(xì)胞毒性，其中染料25比市售染料MitoTracker具有更好的光學(xué)性質(zhì)和更低的細(xì)胞毒性，表明這些染料在活體成像中具有良好的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

表5 基于羅丹明或苯并吡喃鎓結(jié)構(gòu)的NIR香豆素?zé)晒馊玖系墓鈱W(xué)性質(zhì)與應(yīng)用

6 總結(jié)與展望

綜上所述，香豆素優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)和易于修飾的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使得香豆素類染料一直是研究開發(fā)的熱點(diǎn)。根據(jù)不同的合成策略，引入不同的基團(tuán)，近些年已有許多不同結(jié)構(gòu)類型的香豆素類NIR熒光染料被相繼開發(fā)出來，并被應(yīng)用到各種小分子、離子、活性粒子、pH的檢測(cè)和細(xì)胞成像上。目前來看，香豆素-半菁染料是研究最多和應(yīng)用最廣的一類化合物；而二氟硼-香豆素類NIR染料雖具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，但在極性溶劑中較低的熒光量子產(chǎn)率限制了其在生物檢測(cè)和成像中的應(yīng)用。隨著更多新型NIR熒光染料的涌現(xiàn)，將它們與香豆素結(jié)構(gòu)相融合，相信未來會(huì)有更多結(jié)構(gòu)新穎和性能良好的香豆素類NIR熒光染料會(huì)被開發(fā)出來。