澤瀉湯加味方對高脂血癥大鼠胃黏膜AQP4蛋白表達(dá)的影響

張興芳 韓 雪 張一昕 王 茜 王亞芬 劉晨旭 王彥蕊

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200)

高脂血癥(HLP)為臨床常見病，現(xiàn)代常用的治療藥物有他汀類、貝特類等，雖療效顯著，但因胃腸道不適、肝腎損傷、肌肉酸痛等副作用而限制其臨床應(yīng)用〔1〕。近年來，中醫(yī)藥在防治HLP方面顯示出多途徑、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)、不良反應(yīng)較少的優(yōu)勢。臨床研究認(rèn)為脾失健運(yùn)，濕聚痰生，壅滯血脈為其主要發(fā)病機(jī)制〔2〕，澤瀉湯加味方具有祛濕消痰，健運(yùn)脾胃之功。水通道蛋白(AQP)4蛋白表達(dá)在水液代謝起重要作用〔3〕。 本研究旨在觀察澤瀉湯加味方對HLP大鼠血脂及APQ4的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性清潔級SD大鼠60只，體重160～180 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 澤瀉湯加味方組成：澤瀉50 g、白術(shù)20 g、荷葉10 g(廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的中藥配方顆粒，產(chǎn)品批號分別為：5073461、5063421、505037T，)將上述藥物用100℃蒸餾水充分溶解，冷卻辛伐他汀后冷藏備用。辛伐他汀片(石藥集團(tuán)，生產(chǎn)批號：380150701，國藥準(zhǔn)字：H20093007)，加入到0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液中攪勻，冷藏備用。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)購自中生北控生物科技股份有限公司，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)購自長春匯力生物技術(shù)有限公司，一抗AQP4兔抗IgG多克隆抗體購自美國Bioworld公司，二抗山羊抗兔、SP9001試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器 Humalyzer2000半自動生化分析儀(德國毫邁克公司)、TDL-5-A型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、全能顯微鏡 BX-UCB(日本 Olympus)，LEICA、RM2345石蠟切片機(jī)(萊卡上海分公司)。半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)(日本ATTO公司)、紫外可見分光光度計(jì)(美國Milton roy公司)、轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.5方法

1.5.1實(shí)驗(yàn)分組、造模、治療及樣本采集 將60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，按體重分層原則隨機(jī)分為6組，每組10只，正常組、模型組、辛伐他汀對照組(對照組)、澤瀉湯加味方高、中、低劑量組(高、中、低劑量組)。除正常組喂飼普通飼料外，其余各組均喂飼高脂飼料〔4〕(膽固醇1.5%、豬油10%、豬膽酸鈉0.5%、普通飼料88%，由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心加工)。從造模第1天起，正常組與模型組灌服蒸餾水，高、中、低劑量組分別組灌服29.56、14.78、7.39 g/kg澤瀉湯加味方，對照組灌服辛伐他汀1.89 mg/kg，1次/d，用藥體積均按 1 ml/100 g計(jì)算，共用藥治療5 w。用藥后第5周末，大鼠禁食24 h，麻醉后股動脈取血，離心，分離血清待檢。然后迅速剖取結(jié)腸，先取適當(dāng)大小的結(jié)腸組織，剪開沖洗干凈后，液氮保存，以備觀察AQP4、AQP4 mRNA的表達(dá)，再取適當(dāng)大小的結(jié)腸組織放于4%多聚甲醛液中固定，以備免疫組化觀察。

1.5.2血清生化指標(biāo)檢測 股動脈取血，室溫靜置30 min后，4℃、3 000 r/min離心10 min，采集血清置于EP管中，用半自動生化分析儀檢測血清TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量變化。

1.5.3肝組織病理學(xué)觀察 取大小約為1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的新鮮肝組織樣本，置于4%的多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.5.4免疫組化(SP)法觀察胃黏膜AQP4的表達(dá) 將結(jié)腸組織切片，常規(guī)脫水，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7.4清洗，3%H2O2液室溫下孵育20 min，PBS清洗，0.01 mol/L pH6.0 枸櫞酸緩沖液微波爐內(nèi)抗原修復(fù)30 min(92℃)，室溫下冷卻；PBS清洗，滴加山羊血清工作液封閉，37℃溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min，吸去多余血清，滴加兔抗鼠的AQP4抗體，4℃冰箱孵育過夜，PBS清洗，滴加二抗工作液，孵育30 min，PBS清洗，滴加三抗工作液，孵育30 min，PBS清洗，DAB顯色，光鏡下監(jiān)視，PBS充分沖洗，終止顯色。對組織切片拍照后采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖象分析系統(tǒng)，在100×視野下每張切片取8個視野，測定平均光密度值作半定量分析。

1.5.5Western印跡法檢測胃黏膜AQP4蛋白表達(dá) 取大鼠胃組織約100 mg，液氮研磨，然后轉(zhuǎn)移到900 μl含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA溶解液中性裂解液當(dāng)中，混勻，超聲裂解，配平后4℃，12 000 r/min離心 15 min，收集上清，進(jìn)行蛋白含量的測定。蛋白煮沸變性以后，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次，二抗室溫孵育1.5 h，PBST洗膜3次，暗室曝光，X線膠片上顯影，用Tanon Gis軟件掃描各條帶的吸光度值并分析結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1澤瀉湯加味方對HLP大鼠血脂的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C 的含量均明顯升高(P<0.01)，HDL-C 含量明顯降低(P<0.01或P<0.05)。藥物干預(yù)后，各用藥組TG、TC、LDL-C的含量均較模型組顯著降低，HDL-C含量均顯著升高(P<0.01或P<0.05)；與對照組相比，高劑量組血脂各項(xiàng)指標(biāo)無明顯變化(P>0.05)，中、低劑量組TG、TC、LDL-C含量顯著升高，HDL-C含量顯著降低(P<0.01或P<0.05)；澤瀉湯加味方各劑量組之間比較，高劑量組TG、TC、LDL-C的含量顯著低于中、低劑量組(P<0.01或P<0.05)，HDL-C的含量顯著高于中、低劑量組(P<0.05)；與低劑量組相比，中劑量組TC含量顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.2澤瀉湯加味對HLP大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響 正常組肝細(xì)胞排列整齊，形狀為規(guī)則六邊形，圍繞中央靜脈呈放射狀分布，肝血竇結(jié)構(gòu)正常，無脂肪滴和炎性浸潤。模型組大鼠肝細(xì)胞排列不整齊，且出現(xiàn)大量脂肪滴，細(xì)胞核位置被擠壓偏離，肝血竇充血水腫。對照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，脂肪滴明顯減少，肝血竇充血水腫減輕，但存在細(xì)胞壞死及炎性浸潤。澤瀉湯加味方高、中、低劑量組較模型組結(jié)構(gòu)排列清晰，脂肪滴也不同程度減少，肝血竇形態(tài)趨于正常，尤以高劑量組效果顯著。見圖1。

2.3免疫組化法檢測各組胃黏膜AQP4的表達(dá)情況 正常組胃黏膜上皮細(xì)胞陽性細(xì)胞表達(dá)較少，著色較淺。模型組胃黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞核、胞質(zhì)著色較深，表達(dá)較多，上皮細(xì)胞下方的平滑肌細(xì)胞陽性表達(dá)較少。對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組陽性細(xì)胞的表達(dá)及著色程度依次降低。半定量分析顯示：模型組大鼠胃黏膜AQP4的表達(dá)較正常組顯著升高(P<0.01)；各用藥組AQP4的表達(dá)均顯著低于模型組(P<0.01)；其中，高、中、低劑量組顯著低于對照組(P<0.01或P<0.05)；高劑量組顯著低于低劑量組(P<0.05)，與中劑量組無差異(P>0.05)；中劑量組顯著低于低劑量組(P<0.05)，見表1，圖2。

2.4Western印跡檢測各組胃黏膜AQP4蛋白的表達(dá)情況 模型組大鼠胃黏膜AQP4的表達(dá)較正常組顯著升高(P<0.01)；各用藥組AQP4的表達(dá)均顯著低于模型組(P<0.01)；其中，高、中劑量組顯著低于對照組(P<0.01)；高劑量組顯著低于低劑量組(P<0.01)，與中劑量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中劑量組與低劑量組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1，圖3。

表1 各組血清 TG、TC、HDL-C、LDL-C 含量及胃黏膜組織APQ4蛋白相對含量比較

與模型組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與對照組比較：3)P<0.05，4)P<0.01;與高劑量組比較：5)P<0.05，6)P<0.01；與中劑量組比較： 7)P<0.05

圖1 各組肝組織的形態(tài)變化(HE，×200)

圖2 各組胃黏膜中AQP4的表達(dá)(SP，×200)

1：正常組 2：模型組 3：對照組4：低劑量組 5：中劑量組 6：高劑量組圖3 各組胃黏膜中AQP4蛋白的表達(dá)

3 討 論

中醫(yī)中據(jù)HLP臨床表現(xiàn)、體征及舌脈等特點(diǎn)，可歸屬于“痰濁”、“血瘀”等范疇〔4〕，臨床多分為肝氣郁證、肝郁脾虛證、肝腎陰虛證、腎陽虛證、痰瘀內(nèi)阻證、陰虛陽亢證等6種證型予以辨治〔5〕。該病的發(fā)生多是由飲食饑飽失節(jié)、偏嗜醇甘厚味、久坐怠惰懶動、情志抑郁失暢等致使脾運(yùn)功能下降，升清降濁失職，水濕停聚成痰，痰濁停積生成“脂膏”，注入血液、壅塞血脈而誘發(fā)。痰濁是導(dǎo)致血脂異常的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，脾失健運(yùn)，痰濁內(nèi)生為其主要病機(jī)，健脾祛濕消痰為其有效治法。有學(xué)者對脾虛狀態(tài)下HLP大鼠的膽固醇代謝進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，因脾虛運(yùn)化失常導(dǎo)致的HLP膽固醇水平明顯升高，且肝臟出現(xiàn)脂質(zhì)沉積，揭示了“脾主運(yùn)化”對肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用〔6〕。澤瀉湯加味方是在《金匱要略》澤瀉湯的基礎(chǔ)上加入荷葉而成，方中澤瀉利水道、祛水濕、消痰濁、降血脂，白術(shù)補(bǔ)氣健脾、燥濕利水，既健脾益氣以助運(yùn)化，又祛痰濕，荷葉升清降濁，祛濕利尿，三藥同用，驅(qū)邪扶正，標(biāo)本兼顧，共奏消痰祛濁，健運(yùn)脾胃之功，臨床以此為基礎(chǔ)方劑隨證加味，獲效較佳。

AQP在20 世紀(jì) 90 年代被發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞膜上具有“轉(zhuǎn)運(yùn)水”的特異性通道蛋白，在人體水液代謝中發(fā)揮不可替代的作用，共有13個亞型，AQP0～12，存在于人體各個組織器官中〔7〕，AQP4 主要集中在胃體部黏膜的中部和底部，多在胃腺體主細(xì)胞膜和壁細(xì)胞膜的基側(cè)面分布表達(dá)。AQP與中醫(yī)的濕病關(guān)系密切〔8〕，為探討中醫(yī)藥在防治與水液代謝失常所致疾病的研究中提供了新的方向。目前基于AQPs途徑防治HLP的報(bào)道較少，但有關(guān)通過調(diào)控胃黏膜AQPs的表達(dá)，調(diào)節(jié)水液代謝防治脾胃疾病的報(bào)道較多。李合國等〔9〕通過檢測慢性淺表性胃炎(經(jīng)中醫(yī)辨證屬于脾胃濕熱證和脾虛證)患者胃黏膜中AQP3、4的表達(dá)，認(rèn)為其表達(dá)升高可能是脾失健運(yùn)，水液運(yùn)化失常的病理基礎(chǔ)。韋嵩等〔10〕通過實(shí)驗(yàn)研究觀測脾胃濕熱大鼠胃黏膜組織中AQP4的表達(dá)，也認(rèn)為其表達(dá)增強(qiáng)可能是脾胃濕熱證發(fā)生的機(jī)制之一。婁勤進(jìn)等〔11〕開展了腹水草水提液對胃潰瘍大鼠胃組織中AQP4表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)研究，認(rèn)為腹水草通過降低AQP4的表達(dá)調(diào)節(jié)胃內(nèi)水液代謝的平衡從而達(dá)到保護(hù)胃黏膜的作用。因此，胃黏膜AQP4的表達(dá)與水濕的生成關(guān)系密切。

本研究證實(shí)了血脂異常與胃黏膜AQP4的表達(dá)具有相關(guān)性，由于AQP4表達(dá)上調(diào)，使細(xì)胞分泌及水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)異常。經(jīng)澤瀉湯加味方治療后，體內(nèi)水分重吸收過度，澤瀉湯加味方是通過調(diào)控AQP4表達(dá)調(diào)節(jié)水液代謝。