利拉魯肽對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟GRP78-JNK-GLUT2通路的影響

郭曉宇 高 宇 宋 娜 山秀杰 葛曉春 馮增斌 劉曉燕

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 承德 067000)

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)及代謝綜合征發(fā)病共同病理生理基礎(chǔ)，肝臟是胰島素作用主要靶器官之一，更是胰島素調(diào)節(jié)機(jī)體糖、脂代謝的重要效應(yīng)器官。胰高血糖素樣肽(GLP)-1類似物利拉魯肽是目前治療T2DM的新型降糖藥物，最新研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽還可顯著減輕T2DM大鼠肝臟IR〔1〕。持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)發(fā)生在胰島素作用的主要靶組織(肝臟、脂肪、肌肉等)可引起IR，但具體機(jī)制不明〔2〕。本實(shí)驗(yàn)通過觀察高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟ERS相關(guān)分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78、c-jun氨基末端激酶(JNK)及胰島素受體相關(guān)因子蛋白激酶B(AKT)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子(GLUT)2表達(dá)的影響，探討不同濃度利拉魯肽利拉魯肽對(duì)肝臟ERS及IR的干預(yù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 游離脂肪酸測(cè)定盒及三酰甘油(TG)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。TRIzol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，引物合成于Invitrogen上海貿(mào)易有限公司，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司，AKT抗體購(gòu)自SANTA CRUZ公司，其余抗體均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。利拉魯肽購(gòu)自丹麥諾和諾德公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4月齡健康Wistar雄性大鼠54只，體重250 g左右，購(gòu)自北京維通利〔合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001〕，實(shí)驗(yàn)期間室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度(50±5)%，每 12 h光照/黑暗循環(huán) (光照時(shí)間7∶00～19∶00)，自由飲水、進(jìn)食。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組及模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為對(duì)照(NC)組16只與高脂喂養(yǎng)組38只，普通飼料及高脂飼料購(gòu)自北京科奧協(xié)力有限公司。普通飼料熱量組成：碳水化合物64.19%，脂肪12.04%，蛋白質(zhì)23.77%，總熱量為337 kCal/100 g。高脂飼料熱量組成：碳水化合物30.01%，脂肪53.75%，蛋白質(zhì)16.24%，總熱量為486 kCal/100 g。喂養(yǎng)8 w末行清醒狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)〔2〕，計(jì)算葡萄糖輸注率(GIR)，確定高脂喂養(yǎng)大鼠IR狀態(tài)是否造模成功。

1.3.2給藥方案 成膜后將高脂飼養(yǎng)組隨機(jī)分為高脂組(HFD組，高脂飲食+生理鹽水皮下注射)；利拉魯肽低劑量組(LL組，高脂飲食+100 μg·kg-1·d-1利拉魯肽皮下注射)；利拉魯肽高劑量組(HL組，高脂飲食+200 μg·kg-1·d-1利拉魯肽皮下注射)；NC組給予0.5 ml生理鹽水皮下注射。藥物干預(yù)2 w后，各組取5只大鼠再行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)。

1.3.3血清生化指標(biāo)檢測(cè)及肝組織蘇木素-伊紅(HE)染色 采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定TG、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)。取肝組織，行HE染色觀察其病理學(xué)改變。

1.3.4血清游離脂肪酸(FFA)及肝臟內(nèi)TG(LTG)檢測(cè) 按照相應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附法(ELASIA)試劑盒說明書方法(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)。

1.3.5口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)實(shí)驗(yàn) 藥物干預(yù)2 w后，4組大鼠隨機(jī)各取5只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取尾部一滴血，測(cè)空腹血糖。大鼠灌糖后，測(cè)30、60、120 min血糖。計(jì)算大鼠葡萄糖曲線下面積(AUC)，公式為AUC= (0′+30′)/4+(30′+60′)/4+(60′+120′)/2。

1.3.6Western印跡檢測(cè)肝臟組織相關(guān)蛋白表達(dá)量 取適量肝組織液氮下研磨成粉末，加入組織裂解液，冰上勻漿后4℃ 14 000 r/min離心30 min，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。配備12%分離膠和4%濃縮膠。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，分別加入一抗兔抗鼠GRP78、JNK、JNK磷酸化(P-JNK)、AKT、AKT磷酸化(P-AKT)、GLUT2，按4℃孵育過夜，次日室溫用辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗羊抗兔孵育2 h，TBST洗膜后進(jìn)行曝光顯影。利用圖像分析軟件Image J對(duì)顯影條帶進(jìn)行灰度值進(jìn)行定量分析。用“目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值”代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量情況。

1.3.7總RNA提取和熒光定量PCR檢測(cè)肝臟相關(guān)基因的表達(dá) 應(yīng)用Trizol試劑提取各組大鼠肝臟總 RNA。以β-actin作為內(nèi)參。每個(gè)循環(huán) 94℃，變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸 15 s。利用檢測(cè)到的熒光信號(hào)，得到每份標(biāo)本的擴(kuò)增曲線及熔點(diǎn)曲線，檢測(cè)反應(yīng)的特異性，得到各自的Ct值，每組均重復(fù)3次。GRP78引物序列：上游引物5′-AACCCAGATGAGGCTGTAGCA-3′，下游引物5′-ACATCAAGCAGAACCAGGTCAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度約158 bp。GLUT-2引物序列：上游產(chǎn)物5′-GGCCTCTGTGGAAAATGTCTC-3′，下游產(chǎn)物5′-AGGGTACATGGTGGTGCC GCCGAGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度約176 bp。β-actin引物序列：上游產(chǎn)物5′-TGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3′，下游產(chǎn)物5′-TGCTAGGAGCCAGGGCAGTAA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度約138 bp。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)、方差分析及直線相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1一般項(xiàng)目結(jié)果 與NC組相比，HFD、LL、HL組的體重、血FFA(除HL組)、TG、LTG、AST、ALT均顯著升高(P<0.05)；與HFD組相比，HL組的體重、血FFA、TG、LTG、AST、ALT均明顯下降(P<0.05)。與HFD組相比，LL組僅FFA、AST、ALT明顯下降(P<0.05)。與LL組相比，HL組體重、FFA、LTG、TG、AST、ALT均明顯減少(P<0.05)。見表1。

表1 四組大鼠一般資料的比較

與NC組相比：1)P<0.05；與HFD組相比：2)P<0.05；與LL組相比：3)P<0.05，下表同

2.2光鏡觀察大鼠肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 NC組肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈大而壁薄，肝細(xì)胞索在中央靜脈周圍呈放射狀分布，HFD組肝細(xì)胞體積明顯增大，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不一的脂滴空泡，胞核被推向周邊，LL組肝細(xì)胞體積有所減小，胞質(zhì)內(nèi)脂滴空泡明顯減少，HL組肝小葉和肝竇結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞僅可見少許脂滴空泡。見圖1。

2.3OGTT結(jié)果 與NC組比較，HFD組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖均明顯升高、AUC明顯增加(P<0.05)；與HFD組比較，HL組各點(diǎn)血糖和AUC均明顯下降(P<0.05)，LL組各時(shí)間點(diǎn)血糖與AUC下降，但僅120 min血糖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LL組比較，HL組0 min、120 min血糖和AUC明顯下降(P<0.05)，見表2。

圖1 各組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化情況(HE，×200)

組別血糖(mmol/L)0 min30 min60 min120 minAUCNC組5.26±0.316.14±0.817.48±1.005.51±0.2813.44±1.06HFD組7.04±0.511)10.38±1.681)10.84±1.201)7.84±0.341)18.95±1.391)LL組6.36±0.369.14±0.748.84±0.826.63±0.802)16.21±0.65HL組5.73±0.762)3)8.91±0.872)8.66±0.752)6.23±0.682)3)14.77±0.552)3)

2.4Western印跡法檢測(cè)大鼠肝臟相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與NC組相比，HFD組GRP78、P-JNK/JNK蛋白表達(dá)顯著升高，GLUT2、P-AKT/AKT蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05)。與HFD組相比，HL組、LL組 GRP78、P-JNK/JNK蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)，GLUT2、P-AKT/AKT蛋白表達(dá)均增加(P<0.05)。與LL組相比，HL組GRP78、p-JNK/JNK蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，GLUT2、P-AKT/AKT蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。如圖2、圖3，表3。

圖2 GRP78、GLUT2蛋白表達(dá)情況

圖3 JNK、AKT磷酸化情況

組別GRP78GLUT2P-JNK/JNKP-AKT/AKTNC組0.54±0.021.03±0.020.86±0.081.69±0.01HFD組1.24±0.081)0.21±0.011)1.67±0.071)1.08±0.021)LL組0.97±0.031)2)0.54±0.021)2)1.15±0.071)2)1.35±0.011)2)HL組0.62±0.051)2)3)0.82±0.021)2)3)0.96±0.011)2)3)1.55±0.021)2)3)

2.5Real-Time RCR 法檢測(cè)大鼠肝臟GRP78、GLUT2 mRNA表達(dá)情況 與NC組大鼠相比，HFD組大鼠的GRP78 mRNA的表達(dá)顯著增高，GLUT2 mRNA表達(dá)顯著減低(P<0.05)；與HFD組大鼠相比，LL組及HL組大鼠GRP78 mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，與LL組大鼠相比，HL組減低更為明顯(P<0.05)；與HFD組大鼠相比，LL組及HL組GLUT2 mRNA的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)，但HL組上調(diào)程度顯著高于LL組(P<0.05)。見表4。

2.6單因素相關(guān)分析 GIR與體重、FFA、LTG、TG呈負(fù)相關(guān)(P<0.05,P<0.01)。GRP78蛋白表達(dá)量與FFA、LTG、TG呈正相關(guān)，與GIR呈負(fù)相關(guān)(P<0.05,P<0.01)。GLUT2蛋白表達(dá)量與FFA、LTG、TG呈負(fù)相關(guān)，與GIR呈正相關(guān)(P<0.01)，見表5。

表4 4組大鼠肝臟GRP78、GLUT2 mRNA表達(dá)情況

表5 大鼠GIR及肝臟GRP78、P-JNK、P-AKT、GLUT2蛋白相關(guān)分析

3 討 論

ERS與肥胖、IR和T2DM等的發(fā)病環(huán)節(jié)密切相關(guān)〔3〕。GRP78是ERS反應(yīng)標(biāo)志性分子伴侶，蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PEPK)，轉(zhuǎn)錄激活因子(ATF)6，和肌醇激酶(IRE)1α與GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上相結(jié)合，以保持其非活動(dòng)狀態(tài)，當(dāng)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在ER腔中積聚時(shí)，分子伴侶GRP78與以上三個(gè)受體解離，以促進(jìn)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白進(jìn)行正確折疊。本研究證實(shí)高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟發(fā)生了ERS，伴有GIR下降，出現(xiàn)IR，與既往研究結(jié)果肝臟發(fā)生ERS時(shí)促進(jìn)機(jī)體IR的加劇相符合〔4〕。ERS激活I(lǐng)RE-1α，繼而引起JNK信號(hào)通路活化〔5〕，活化后JNK使胰島素刺激的P-AKT和胰島素受體底物(IRS)-1酪氨酸磷酸化受到抑制阻止了胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)，降低了胰島素在外周組織的敏感性，導(dǎo)致IR的發(fā)生〔6，7〕。利拉魯肽是目前研發(fā)的GLP-1類似物，不僅可以改善胰島B細(xì)胞功能促進(jìn)胰島素分泌發(fā)揮降糖作用，還可顯著減輕T2DM大鼠IR〔8〕。本研究說明利拉魯肽有改善IR發(fā)揮降糖作用，與既往Díaz-Soto等〔9〕研究一致。本實(shí)驗(yàn)提示IR減輕與ERS緩解相關(guān)。利拉魯肽呈濃度依賴性改善大鼠ERS，減輕IR。有研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1類似物可刺激糖尿病大鼠肝臟、肌肉及脂肪組織GLUT2、GLUT4蛋白及mRNA的表達(dá)，從而增加機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性〔10〕。利拉魯肽是否通過降低FFA和肝內(nèi)脂質(zhì)沉積，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GRP78-JNK-AKT-GLUT2通路，改善ERS，減輕肝臟IR，目前尚未報(bào)道。綜上，高脂飲食可導(dǎo)致FFA及肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積，發(fā)生ERS，導(dǎo)致IR，利拉魯肽可呈依賴性緩解高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕IR，其機(jī)制可能與利拉魯肽使肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78蛋白表達(dá)水平下降及JNK-AKT-GLUT2通路有關(guān)，然而其具體的分子機(jī)制還待進(jìn)一步研究。