星蔞承氣湯加味對腦出血大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α表達及神經(jīng)功能的影響

趙曉君 吳曉光 徐 櫻 王建福

(承德醫(yī)學院研究生院，河北 承德 067000)

腦出血后紅細胞裂解、凝血酶、氧化應激等因素引起的炎癥反應是導致腦出血后腦水腫的主要原因〔1～3〕，對腦出血患者的預后及康復起著重要的作用。本課題組臨床應用星蔞承氣湯加味在治療急性腦出血，抑制腦水腫等方面取得很好的療效，但其機制尚不明確。本研究探討星蔞承氣湯加味腦出血大鼠血清白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-17A、腫瘤壞死因子(TNF)-α等表達及神經(jīng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級成年雄性SD大鼠70只，3～4月齡，體質量300～360 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物許可證號：scxk(京)2014-0004。主要藥物和試劑：大鼠IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司，批號：201612)，中藥星蔞承氣湯加味(承德市中醫(yī)院，批號：17030112)，加水煎煮并濃縮至含藥量為2 g/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2動物模型制作 隨機選取雄性SD大鼠54只，均采用基底節(jié)注入自體動脈血的方法制作腦出血動物模型〔4〕。4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠固定于腦立體定位儀上，顱頂中線切口，剝離骨膜，暴露前囟，在前囟前0.2 mm、中線右側3.5 mm處鉆一直徑約1.0 mm的小孔，自體尾動脈抽取適量血液，在鉆孔處用微量注射器垂直進針6 mm(此處為腦右側基底節(jié)區(qū))，緩慢注入80 μl動脈血，注射完畢后留針10 min后緩慢拔針，碘伏消毒，縫合皮膚。剩余16只大鼠作為假手術組在造模過程中不注入動脈血，其余操作同模型組。

1.3動物分組、神經(jīng)功能評分及給藥 造模動物在自然蘇醒后參照Longa 5級4分法進行神經(jīng)功能評分〔5〕，取1～3分者入實驗。將符合要求的48只大鼠隨機等分為模型組、星蔞承氣湯加味高劑量組(高劑量組)、星蔞承氣湯加味低劑量組(低劑量組)。大鼠神經(jīng)功能評分結束后，高劑量組給予中藥50 g·kg-1·d-1灌胃，低劑量組給予中藥25 g·kg-1·d-1灌胃，假手術組、模型組給予生理鹽水3.5 ml/d灌胃，早晚各一次，連續(xù)給藥15 d。

1.4ELISA檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α的表達 大鼠乙醚麻醉，腹主動脈取血，嚴格按照ELISA 試劑盒的操作步驟，在LIR系統(tǒng)和酶標儀中將相應的參數(shù)設置好，對標準品倍比稀釋，選擇相應的板條，空白對照孔不加樣，標準品孔加標準品50 μl、鏈霉辣根過氧化物酶標記的鏈霉素和素(SA-HRP)50 μl，待測樣品孔加入標本40 μl、相應抗體10 μl、SA-HRP 50 μl，蓋封版膜、輕輕震蕩均勻，37℃溫育60 min，將30倍濃縮液用蒸餾水30倍稀釋備用，揭掉封版膜，棄去液體、甩干，加洗滌液，靜置30 s棄去，重復5次，每孔加顯色劑A、B各50 μl，混勻，37℃避光顯色15 min，每孔加終止液50 μl，在加入終止液10 min內，以空白孔調零，450 nm波長測量各孔吸光度值，根據(jù)標準品濃度及各孔OD值計算標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值分別計算血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α的相應濃度。

1.5大鼠腦組織含水量測定 采用干濕重法測定腦組織含水量〔6〕，每組隨機選取8只大鼠斷頭處死，取右側腦組織，于電子天平(精確度0.1 mg)測得濕重，然后置于100℃的烤箱內烘干24 h，恢復室溫后，測得干重。腦組織水含量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6腦組織蘇木素-伊紅(HE)染色 每組剩余8只大鼠斷頭處死，分離腦組織，以注血處為中心切取右側腦組織，10%甲醛固定48 h，石蠟包埋，5 μm厚冠狀切片，進行HE染色，于400倍鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1各組一般情況 實驗選用造模成功的大鼠64只，分成4組，實驗過程中無脫失，全部進入結果分析。實驗過程中大鼠一般狀態(tài)及精神良好，無脫毛、虛弱、體重減輕等情況，假手術組大鼠活動最為旺盛，低、高劑量組大鼠活動力稍強于模型組。整體而言，低、高劑量組大鼠的糞便量是模型組的2倍，大便較模型組顏色稍淺且柔軟，高劑量組大便稍多于低劑量組。

2.2神經(jīng)功能評分 造模后6 h神經(jīng)功能評分模型組與低劑量組、高劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.27，P=0.79；t=0.11，P=0.91)，假手術組與模型組差異有統(tǒng)計學意義(t=18.46，P=0.00)；給藥15 d后，與模型組相比，低、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低(t=10.80，P=0.02；t=12.48，P=0.00)。見表1。

2.3各炎癥因子指標比較 與假手術組相比，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α的含量顯著升高(t=-20.31、-41.30、-4.61、-14.00，均，P=0.00)；與模型組相比，低劑量組大鼠血清IL-6、IL-17A含量明顯降低(t=8.50，P=0.02；t=2.22，P=0.03)，IL-1β、TNF-α的含量顯著降低(t=5.62，P=0.00；t=3.06，P=0.01)，高劑量組大鼠血清IL-17A含量明顯降低(t=2.37，P=0.02)，IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著降低(t=8.56、10.85、3.90，均P=0.00)。見表2。

表1 四組神經(jīng)功能評分比較分)

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

表2 炎癥因子指標比較

2.4腦組織含水量 與假手術組〔(61.62±2.56)%〕相比，模型組大鼠腦組織含水量顯著升高〔(77.62±1.77)%,t=-12.50,P=0.00〕；與模型組相比，低劑量組大鼠腦組織含水量明顯降低〔(75.75±1.67)%,t=5.84,P=0.04〕，高劑量組大鼠腦組織含水量顯著降低〔(69.43±1.27)%,t=9.89,P=0.00〕。

2.5各組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)及密度的變化 假手術組神經(jīng)元數(shù)量較多為(39.25±2.31)個，形態(tài)完整，呈橢圓形，有較長的凸起，胞質呈紅色，細胞核大而圓，呈藍色，于神經(jīng)元中央；與假手術組比較，模型組部分神經(jīng)元脫失，呈空泡狀，膠質細胞顯著增生，可見大量噬神經(jīng)現(xiàn)象，正常神經(jīng)元數(shù)量顯著減少〔(10.00±1.31)個，t=20.78，P=0.00〕；與模型組相比較，低、高劑量組正常神經(jīng)元顯著增加〔(24.62±3.20)個，t=-13.46，P=0.00；(32.62±2.39)個，t=-17.83，P=0.00〕，噬神經(jīng)現(xiàn)象明顯減少。 見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)(HE，×400)

3 討 論

腦出血發(fā)生后，以腦水腫為代表的繼發(fā)性腦損害是影響腦出血患者康復的重要因素，但目前并沒有特效的治療方案〔7〕。在腦出血的急性期，多以痰熱互結為主要病機，運用化痰通腑的中藥，取其“急則治其標，損其偏盛”的原理，具有恢復氣機、通痹達絡、引火下行、急下存陰、以防發(fā)生劫陰內陷等變證的作用。同時傳統(tǒng)的中醫(yī)理論認為“離經(jīng)之血便是瘀血”，清代醫(yī)家唐容川在《血證論》中也說“既是離經(jīng)之血，雖清血鮮血，亦是瘀血”，在治療上提出“瘀血不去，則出血不止，新血不生……故凡血證總以去瘀為要”，是以活血化瘀亦是腦出血的治療大法之一，而腦水腫的病機為“瘀”和“水”，故治療上應配伍活血化瘀，行氣利水之中藥。此次研究中用到的星蔞承氣湯加味由膽南星、瓜蔞、大黃、芒硝、水蛭、花蕊石、三七粉、郁金、桃仁、川牛膝、澤瀉、生白術、車前子、茯苓、益母草、甘草組成，方中大黃配伍芒硝為君藥，具有瀉下攻積、清熱消腫的功效，使“水”由大便而出；膽南星、全瓜蔞可化痰開竅、清火醒神，花蕊石、三七、郁金、桃仁、川牛膝、益母草活血化瘀，共為臣藥；同時佐以生白術、車前子、茯苓行氣利水，甘草調和藥性為使藥，諸藥合用共奏開竅醒神，活血化瘀通腑，行氣利水之功效?，F(xiàn)代藥理研究亦為中藥治療腦出血后腦水腫提供了理論依據(jù)：星蔞承氣湯(膽南星、瓜蔞、大黃、芒硝)可以降低顱內壓，增加有效的循環(huán)灌注，改善腦缺血區(qū)的微循環(huán)〔8〕。姜黃素(中藥郁金提取物)可通過抑制腦出血后的核因子(NF)-κB 通路，減少部分炎癥因子的表達和T 淋巴細胞滲入大腦，從而有效減輕腦出血后腦水腫的發(fā)生〔9，10〕。水蛭素(中藥水蛭提取物)具有抗凝血酶活性、改善血腦屏障(BBB)通透性 、減輕腦水腫 、促進神經(jīng)元功能恢復等作用〔11〕。三七總皂苷可促進腦出血后血腫吸收、減輕炎癥反應、改善微循環(huán)、減輕腦水腫，促進腦出血后神經(jīng)元的損傷修復〔12〕。

腦出血后的炎癥反應是導致腦水腫發(fā)生的主要機制之一，腦出血發(fā)生后，局部及全身的炎癥反應被激活，由以小膠質細胞最先被激活，釋放包括IL-1β、IL-6、TNF-α在內的一系列炎癥因子〔13〕。實驗表明，在腦出血急性期，血液中IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α等與腦內炎癥反應最相關的炎癥因子水平顯著增加〔13，14〕。其中，IL-1β主要來源于M1型小膠質細胞〔13〕，IL-6 來源于M1型小膠質細胞和其他免疫細胞(如中性粒細胞)〔14〕，IL-17A主要來源于γ δ T 細胞，IL-1β、IL-6、IL-17A均可通過多種機制促進炎癥的發(fā)展(如促進其他炎癥因子的表達和直接參與炎癥反應過程)，加重神經(jīng)炎癥和腦出血后繼發(fā)性損傷〔12～15〕，抑制IL-17A的分泌，可顯著降低腦組織水含量和改善腦出血小鼠的神經(jīng)功能〔16〕。TNF-α可刺激TNF受體，誘導其下游蛋白質的生物學活性，導致炎癥的發(fā)生及細胞的凋亡〔3〕。腦出血后血液中的巨噬細胞和中性粒細胞在血腫周圍地區(qū)高度激活，對IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α、凝血酶、血紅素等炎癥因子做出反應，這些炎癥信號與細胞表面的Toll樣受體(TLR)4結合，導致NF-κB信號通路的激活和其他炎性細胞因子、活性氧和活性氮的產(chǎn)生，從而加重腦組織損傷，TLR4缺陷的小鼠，體內TNF-α、IL-1β、IL-6的表達明顯降低，其腦出血后行為能力可得到明顯的改善〔16〕，表明抑制腦出血后炎癥因子的表達可有效預防及減輕腦出血后腦水腫的發(fā)生及神經(jīng)功能的損傷。

在西醫(yī)治療的基礎上，加用活血化瘀，化痰通腑等中藥對于腦出血患者的治療效果更加顯著。本研究提示星蔞承氣湯加味可有效起到通腑之效，以實現(xiàn)“水”由大便而出的目的；星蔞承氣湯加味可改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能；星蔞承氣湯加味可降低IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α等炎癥因子的表達，抑制腦出血誘發(fā)的炎癥反應；星蔞承氣湯加味可有效降低腦出血大鼠腦組織的含水量，減輕腦出血后腦組織水腫；星蔞承氣湯加味可有效減輕腦出血灶周圍腦組織的損害，保護腦的神經(jīng)功能，提高腦出血患者日常生活能力。