不同劑量(+)-2-(1-羥基-4-環(huán)己酮)乙基咖啡酸酯對大鼠關(guān)節(jié)炎模型和全血炎癥模型的藥效學(xué)研究*

楊 文， 劉遠儒， 李洪林， 王 蕊

(上海市新藥設(shè)計重點實驗室， 華東理工大學(xué)藥學(xué)院， 上海 200237)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種與自身免疫相關(guān)的慢性疾病，主要癥狀為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛和僵硬，病理特征為持續(xù)性的滑膜炎癥和軟骨損傷，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形[1]。在RA的相關(guān)研究中，膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型是最常用也是最接近RA病理特征的一種動物模型，其造模原理為：由于Ⅱ型膠原僅在關(guān)節(jié)中表達，因此注射外源性的Ⅱ型膠原會引起機體的免疫排異反應(yīng)，引發(fā)關(guān)節(jié)炎[2-3]。

RA的炎癥反應(yīng)是由一系列的炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的，其中，類花生酸是一類重要的脂類炎癥介質(zhì)，由花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝產(chǎn)生。當(dāng)細胞受到刺激時，磷脂酶(phospholipase，PL)A2催化細胞核膜上的磷脂水解，釋放出游離的AA。AA的代謝途徑主要有4條，分別是環(huán)加氧酶(cyclo-oxygenase，COX)、5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)、15-LOX和12-LOX，其中，COX通路的代謝產(chǎn)物有前列腺素(prostaglandins，PGs)和血栓素(thromboxanes，TXs)；5-LOX通路的代謝產(chǎn)物有白三烯(leukotrienes，LTs)；15-LOX和12-LOX通路分別生成15-羥基廿碳四烯酸(hydroxyeicosatetraenoic acid，HETE)和12-HETE[4]。這些類花生酸通過與特異性受體結(jié)合，激活炎癥相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路，從而產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)[5]。

大花雞肉參是一種藥用植物，紫葳科多年生草本，其根和葉可以入藥，具有抗炎鎮(zhèn)痛、清熱解毒和祛風(fēng)除濕等功效。(+)-2-(1-羥基-4-環(huán)己酮)乙基咖啡酸酯[(+)-2-(1-hydroxyl-4-oxocyclohexyl) ethyl caffeate，HOEC]是從大花雞肉參全草中提取分離出的具有抗炎活性的天然產(chǎn)物[6]。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，HOEC在分子水平上對5-LOX和15-LOX有抑制作用，在大鼠腹腔巨噬細胞和人全血中對5-LOX代謝產(chǎn)物L(fēng)TB4和5-HETE的生成有抑制作用[7]。張衛(wèi)東課題組先后分別證明了HOEC通過靶向PI3K、ERK1/2和p38 MAPK抑制紫外線誘導(dǎo)的皮膚癌發(fā)生和過氧化氫誘導(dǎo)PC12細胞損傷[8-9]。本課題組前期也發(fā)表了HOEC通過調(diào)節(jié)AA代謝網(wǎng)絡(luò)和p38 MAPK信號通路對過氧化氫和脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷有抑制作用的研究[10]。

本研究的目的是對HOEC進行藥效學(xué)評價及機理探究。在整體藥效學(xué)研究中，雖然HOEC對大鼠關(guān)節(jié)炎有治療效果，但并不符合劑量依賴性，即高劑量HOEC對關(guān)節(jié)炎的治療效果反而比中、低劑量HOEC的治療效果弱。針對這種不同尋常的劑量-藥效關(guān)系，我們猜想：由于AA的各代謝通路之間的代謝流量存在著相互關(guān)聯(lián)，因此，HOEC對AA代謝酶表達和代謝產(chǎn)物生成均有直接或間接的藥理作用。對這種針對復(fù)雜代謝通路的藥物的效應(yīng)，不應(yīng)僅僅由它對靶標酶的作用單獨決定，而是應(yīng)該綜合考慮其對各代謝通路的作用。基于上述理論，我們分析了HOEC對大鼠關(guān)節(jié)組織中AA代謝酶表達的作用；并用大鼠全血AA代謝模型模擬體內(nèi)的炎癥環(huán)境，探究HOEC對幾種主要AA代謝產(chǎn)物的作用。希望通過上述實驗結(jié)果的分析，為HOEC在AA代謝通路中的作用及其與藥效的關(guān)系提供線索。

材 料 和 方 法

1 試劑和材料

6周齡的SPF級雄性Wistar大鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證編號為2007000575547。動物飼養(yǎng)于溫度為(22±1) ℃、相對濕度為50%～60%的動物房中，12 h明亮/黑暗環(huán)境，水和食物的供應(yīng)無限制。大鼠體重為130 g±10 g時開始造模。所有實驗程序均符合中國實驗動物保健和使用指南。

2 主要試劑

HOEC由華東理工大學(xué)藥學(xué)院李洪林教授實驗室合成，純度> 98%，白色粉末；咖啡酸(caffeic acid, CA)和A23187購自Sigma；牛Ⅱ型膠原(collagen type II, Col II)和不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant,IFA)購自Chondrex；EDTA、無水乙醇和二甲苯購自上海泰坦科技有限公司；HE染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；生物素標記的山羊抗免IgG和鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；DAB購自北京索萊寶科技有限公司；肝素鈉真空采血管購自BD；抗cPLA2抗體(Rabbit Anti-Rat)、抗5-LOX抗體(Rabbit Anti-Rat)和抗COX-2抗體(Rabbit Anti-Rat)購自Affinity Biosciences；LTB4、15(S)-HETE、PGE2、PGD2和TXB2ELISA試劑盒購自Cayman Chemical。

3 主要方法

3.1膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備 將牛Col II溶于0.05 mol/L的冰醋酸中，配制成濃度為2 g/L的Col II冰醋酸溶液，將該溶液與IFA按體積比1∶1混合，在冰水浴中用高速勻漿機將其乳化。于起始時點 (即第0天，day 0, D0) 進行首次免疫，將大鼠固定，用乙醇棉擦拭鼠尾消毒，向尾根部皮下注射Col II-IFA混合物(每只200 μg);正常對照(control)組的大鼠以相同的方式注射等體積的滅菌生理鹽水。D7進行加強免疫，Col II-IFA混合物的劑量與首次免疫相比減半(每只100 μg)。

3.2給藥處理與關(guān)節(jié)炎評價標準 實驗大鼠分組為：正常對照(control)組(8只)、模型(model)組(10只)、HOEC (1 mg/kg)組(10只)、HOEC (3 mg/kg)組(10只)和HOEC (10 mg/kg)組(10只)。給藥方式為：從D1～D36，腹腔注射給藥，每天1次，分別給予HOEC 10 mg/kg、3 mg/kg和1 mg/kg組的大鼠2、0.6和0.2 g/L的HOEC溶液(含1% DMSO)，5 mL/kg；正常對照組和模型組大鼠給予含有1% DMSO的滅菌生理鹽水溶液，體積參照給藥組標準。實驗期間，每隔3 d對大鼠的體重進行測量，每隔2 d對大鼠的足腫脹情況進行評分。評分標準[11]為：0分者無發(fā)紅或腫脹；1分者腳趾關(guān)節(jié)腫脹；2分者腳趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分者踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分者踝關(guān)節(jié)以及足爪腫脹。由于前爪較小不易準確評分且發(fā)病率低于后爪，因此關(guān)節(jié)炎評分的總分為2只后爪評分的總和。

3.3關(guān)節(jié)組織石蠟切片的制備 于D36實驗結(jié)束時，斷頸處死大鼠，取2只后爪，剝離皮膚和皮下組織，置于固定液(10%中性福爾馬林)中，常溫浸泡24 h，取出組織，鋸下厚度約5 mm的踝關(guān)節(jié)骨片，換新固定液浸泡48 h，取出置于脫鈣液(10% EDTA溶液)中，每日更換新脫鈣液，直至組織軟化為止。將脫鈣后的組織置于活水中浸泡過夜，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，依次浸蠟包埋。將樣品切成厚度為3 μm的切片。

3.4蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色 將石蠟切片置于68 ℃恒溫烘箱中20 min，置于二甲苯溶液中脫蠟2次,每次10 min；將切片梯度乙醇復(fù)水后，首先將切片置于蘇木素溶液中5 min，活水沖洗5 min；然后將切片置于1%鹽酸乙醇中分化30 s，活水沖洗30 s，置于蒸餾水中5 min；最后將切片置于0.5%伊紅溶液中3 min，活水沖洗30 s。將切片梯度乙醇脫水，二甲苯中透明，封片后將切片置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干24 h以上。

3.5免疫組化觀察 采用SP連結(jié)法，按照3.4中方法將石蠟切片脫蠟、復(fù)水后，依次進行抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻封；滴加適量封閉液(10%山羊血清)，室溫下孵育30 min；移除封閉液，用PBST-X按比例(1∶100)稀釋I抗(抗cPLA2、5-LOX和COX-2抗體)，滴加適量，4 ℃孵育過夜。次日移除 I 抗，將切片置于PBST-X中，用脫色搖床清洗3次，每次5 min；用PBST-X按比例(1∶400)稀釋 II 抗(Biotin-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG)，滴加適量，室溫下孵育30 min；移除 II 抗，將切片置于PBST-X中，用脫色搖床清洗3次，每次5 min；用PBS按比例(1∶500)稀釋辣根過氧化物酶標記的SP，滴加適量，室溫下孵育30 min；移除SP稀釋液，將切片置于PBST-X中，用脫色搖床清洗3次，每次5 min；滴加適量顯色液，室溫下避光顯色，反應(yīng)至顯微鏡下可見褐色顆粒為止，蒸餾水終止反應(yīng)，用蒸餾水洗滌2次。最后，按照3.4中方法進行脫水、透明、封片。

3.6全血花生四烯酸代謝模型的建立與藥物處理 采用鈣離子載體A23187刺激大鼠全血AA代謝模型，分別用0.15 μmol/L和15 μmol/L的HOEC和咖啡酸處理該模型，取30 min和60 min 2個時點的全血樣品檢測AA代謝產(chǎn)物的濃度。共分為6組：分別是空白對照組、模型組、HOEC和咖啡酸處理組(每組各2個濃度)。麻醉大鼠，從腹主動脈取全血，分裝到離心管中，每管1 mL，放置到恒溫混勻儀的金屬模塊中，設(shè)置溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為300 r/min；依次向藥物處理組中加入10 μL相應(yīng)濃度的HOEC儲存液(100×)和咖啡酸儲存液(100×)，向空白對照組和模型組中加入等體積的溶劑(DMSO)，充分混勻，繼續(xù)孵育；依次向各管全血中加入10 μL Ca2+、 Mg2+儲存液(100×)，使其終濃度為2 mmol/L，充分混勻，繼續(xù)孵育；20 min后，依次向模型組和給藥組中加入2 μL A23187 儲存液(100×)，使其終濃度為20 μmol/L，充分混勻，此時開始重新計為0 min，繼續(xù)孵育，隨后在各時點從對應(yīng)離心管中吸取樣品，用 3 mL冰乙醇終止反應(yīng)。將樣品保存在-80 ℃中，待處理。

3.7ELISA法測定花生四烯酸代謝產(chǎn)物 將樣品在冰上復(fù)融，用冷凍離心機在4 ℃、 3 000×g離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，氮氣流吹干，1 mL buffer復(fù)溶，分裝后置-80 ℃中保存待測。用廠家提供的ELISA法檢測樣品中的AA代謝產(chǎn)物濃度。

由于每次實驗受全血來源差異的影響，AA代謝產(chǎn)物的定量絕對值相差較大，所以我們對數(shù)據(jù)進行了歸一化處理，即以模型組的定量值為基準，將其他組的定量值與模型組做比值，這樣既保留了原始數(shù)據(jù)的趨勢，又有利于數(shù)據(jù)分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

上述實驗獨立重復(fù)3次。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。數(shù)據(jù)分析用IBM SPSS Statistics 16.0進行計算，多組數(shù)據(jù)之間的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較使用LSD-t檢驗或以模型組作為對照組的Dunnett’s檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HOEC對大鼠關(guān)節(jié)炎模型的藥效學(xué)評價

模型組的大鼠從D16開始發(fā)病，與對照組相比，關(guān)節(jié)炎評分從D16～D20急劇上升，D20～D24平緩上升，D26～D36平緩下降;HOEC給藥組的大鼠與模型組相比均提前2 d開始發(fā)病，低劑量組(1 mg/kg)和中劑量組(3 mg/kg)與模型組的關(guān)節(jié)炎評分變化前期一致，不同的是低、中劑量組D32之后基本穩(wěn)定，高劑量組(10 mg/kg)的關(guān)節(jié)炎評分D24開始緩慢下降，D32之后基本穩(wěn)定，見圖1A。3個劑量的HOEC對大鼠關(guān)節(jié)炎均有治療效果，其中1 mg/kg和3 mg/kg組的關(guān)節(jié)炎評分變化曲線非常相近，然而，10 mg/kg組的治療效果卻弱于1 mg/kg和3 mg/kg組，該藥效結(jié)果并不符合通常情況的劑量依賴性。

和多數(shù)報道類似，本研究中模型組的發(fā)病率為41.67%；然而，給藥組的發(fā)病率與模型組相比卻均有明顯的上升：1 mg/kg組和3 mg/kg組的發(fā)病率非常相近，分別為71.43%和66.67%；10 mg/kg組的發(fā)病率為84.62%，提示HOEC有可能增加關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率，見圖1B。在體重變化方面，各組的大鼠體重均呈現(xiàn)上升趨勢，其中，正常對照組的大鼠體重呈勻速上升趨勢，模型組和給藥組的大鼠的體重從D0至D18呈勻速上升趨勢，但體重上升速率低于正常對照組，從D18開始，模型組和給藥組的大鼠體重維持不變甚至略有下降，直到D24，大鼠體重又恢復(fù)上升趨勢，見圖1C。

2 關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)變化

正常對照組的大鼠關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)完整清晰；模型組的大鼠關(guān)節(jié)組織有多處軟骨損傷、關(guān)節(jié)翳，關(guān)節(jié)組織受損非常嚴重；HOEC給藥組的大鼠關(guān)節(jié)組織中，1 mg/kg和3 mg/kg組各有一定程度的軟骨損傷和關(guān)節(jié)翳的生成，組織受損情況較輕；10 mg/kg組不僅出現(xiàn)關(guān)節(jié)翳及軟骨損傷，且組織受損情況較嚴重，見圖1D。綜上所述，各組大鼠關(guān)節(jié)組織的損傷情況與該組的關(guān)節(jié)炎評分基本符合。

Figure 1.Pharmacodynamic evaluation of HOEC on rat CIA model. A: the effect of HOEC on arthritis scores of CIA rats; B: incidence of arthritis in each group; C: weight change curve of each group; D: histological changes of the ankle joints from hind paws of rats. The scale bar=500 μm. c: cartilage; m: meniscus; bm: bone marrow; p: pannus; arrow: cartilage destruction. Mean±SEM. n=10. #P<0.05, ## P<0.01 vs control group (LSD-t test).

3 HOEC對關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)組織花生四烯酸代謝網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵酶表達水平的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組cPLA2的表達水平明顯升高；給藥后，1 mg/kg組的cPLA2表達水平顯著下降，然而，隨著HOEC劑量的增加，這種下降趨勢逐漸消失。HOEC的給藥劑量越高，cPLA2的表達水平越高，關(guān)節(jié)炎評分也相應(yīng)升高。與正常對照組相比，模型組中5-LOX的表達水平有升高趨勢，HOEC能夠劑量依賴性地抑制5-LOX的表達。同樣，COX-2在模型組中的表達水平與正常對照組相比也顯著升高(P<0.05)，給藥后，COX-2的表達水平受到抑制，其中1 mg/kg組和3 mg/kg組的抑制作用較強，而10 mg/kg組的抑制效果稍弱,見圖2。

4 HOEC和咖啡酸對大鼠全血花生四烯酸代謝模型中代謝產(chǎn)物的影響

30 min時，HOEC 2個濃度(0.15和15 μmol/L)均能抑制LTB4和15-HETE的升高，而對COX通路的3個代謝產(chǎn)物均無明顯影響；CA低濃度時(0.15 μmol/L)可明顯抑制PGD2的升高；高濃度CA(15μmol/L)作用于細胞后，TXB2的升高受到明顯抑制，見圖3。上述結(jié)果與HOEC在30 min對AA代謝產(chǎn)物的作用情況及分子水平檢測到對5-LOX和15-LOX的抑制作用相符。同樣作為5-LOX和15-LOX抑制劑的CA[12-13]在30 min時對AA經(jīng)5-LOX和15-LOX的代謝產(chǎn)物(LTB4和15-HETE)的生成無抑制作用。

Figure 2.The effect of HOEC on the expression of arachidonic acid metabolic enzymes (cPLA2, 5-LOX and COX-2) in the CIA rat ankle joint tissues. A: representative sections of immunochemical staining (scale bar=100 μm) and the average signal intensity (IA/area) calculated using Image-Pro Plus 6.0 software; B: arthritis scores of the rats at D36. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs control group (Dunnett’s test).

藥物處理細胞60 min時，15 μmol/L HOEC 能抑制所有檢測的AA代謝產(chǎn)物，并且抑制活性要強于0.15 μmol/L；CA同樣表現(xiàn)出了對各被測AA代謝產(chǎn)物不同程度的抑制作用，但 0.15 μmol/L CA對PGD2和TXB2均無抑制，且2個劑量的CA對PGE2、 LTB4和15-HETE的抑制作用量效關(guān)系不明顯，高濃度抑制作用反而低于低濃度,見圖4。

討 論

為了探究不同劑量HOEC對AA代謝通路的不同作用及其與CIA非劑量依賴性的治療效果的關(guān)系，本文首先檢測了各組大鼠關(guān)節(jié)組織中AA代謝通路的關(guān)鍵酶的表達水平。AA的生成主要是通過PLA2的cPLA2亞型催化細胞核膜上的磷脂分子而釋放[14]。與野生型小鼠相比，cPLA2基因敲除的小鼠具有更低的CIA發(fā)病率，同時，關(guān)節(jié)炎的嚴重程度也較弱[15]。在另一項研究中，cPLA2在CIA大鼠體內(nèi)表達升高，并與足部厚度的增加呈正相關(guān)[16]。在本文中，各組cPLA2的表達水平與關(guān)節(jié)炎評分呈正相關(guān)，這與前述實驗結(jié)果中cPLA2的表達與CIA關(guān)節(jié)炎的嚴重程度具有相關(guān)性這一結(jié)論一致。COX有COX-1和COX-2 2種亞型，COX-2的表達水平在RA動物模型的關(guān)節(jié)組織中明顯升高，表現(xiàn)為隨著疾病的發(fā)展不斷上升而后趨于穩(wěn)定，COX-1的表達水平則與正常對照組相差不多[17-18]。本文中CIA模型組的大鼠關(guān)節(jié)組織中COX-2的表達與正常對照組相比增加，HOEC給藥處理之后大鼠關(guān)節(jié)組織中的COX-2與模型組相比表達水平下調(diào)，這不僅說明HOEC對COX-2的表達有抑制作用，也說明HOEC對CIA的治療作用涉及對COX-2的抑制作用。5-LOX在RA患者的滑膜組織中高水平表達，使用關(guān)節(jié)內(nèi)糖皮質(zhì)激素后，5-LOX的表達水平大幅下降[19]，該結(jié)果暗示下調(diào)5-LOX的表達水平可對RA起到治療作用，與本文實驗結(jié)果相符。

Figure 3.The effects of HOEC and caffeic acid (CA) on AA metabolites in rat whole blood AA metabolic model at 30 min. Mean±SEM. n=3. * P<0.05, ** P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs model group (Dunnett’s test).

Figure 4.The effects of HOEC and caffeic acid (CA) on AA metabolites in rat whole blood AA metabolic model at 60 min. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs normal group; #P<0.05, ##P<0.01 vs model group (Dunnett’s test).

為了進一步探究HOEC對AA代謝產(chǎn)物的作用與其對CIA非劑量依賴性治療效果的關(guān)系，本文接下來對HOEC和其在體內(nèi)的主要代謝物咖啡酸對大鼠全血的AA代謝模型中代謝產(chǎn)物的作用進行了研究。COX通路的代謝產(chǎn)物PGE2在RA患者的滑膜液和尿液中均有升高[20]，同時它也是產(chǎn)生疼痛和腫脹的主要炎癥介質(zhì)[21]；LOX通路的代謝產(chǎn)物L(fēng)TB4在RA患者的血清、滑膜液和滑膜組織中均有升高[22]；TXA2通過其受體TXA2R既可控制COX-2的表達，又可介導(dǎo)COX-2的細胞增殖效應(yīng)[23]，本文中TXB2在HOEC和CA處理后均受到抑制作用，該現(xiàn)象可能與上述2種藥物的抗炎作用有關(guān)。此外，COX通路的代謝產(chǎn)物PGD2在RA中具有抗炎作用[24]，而關(guān)于15-HETE與12-HETE在RA中的作用尚不明確。

HOEC對AA代謝通路的作用如下：(1)30 min時，由于細胞受到A23187的刺激，AA代謝通路中的代謝酶被激活，活性酶的數(shù)量不斷增加，AA和代謝產(chǎn)物的生成速率隨之升高，由于HOEC對5-LOX和15-LOX的抑制活性較高，所以表現(xiàn)出了對LTB4和15-HETE生成的抑制作用；(2)60 min時，由于A23187的持續(xù)刺激，AA代謝通路中被激活的代謝酶數(shù)量趨于飽和，各代謝產(chǎn)物的生成速率小于代謝速率，表現(xiàn)為各代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的降低，推測60 min時HOEC對COX通路代謝產(chǎn)物的抑制作用可能與全血中細胞-細胞之間的相互作用有關(guān)。

咖啡酸是一種具有5-LOX和15-LOX抑制作用的抗炎活性物質(zhì)，而它的一些脂類或酰胺類衍生物較其具有更高的抗炎和抗氧化活性，如咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)等。有文獻報到，當(dāng)咖啡酸的濃度為10 μmol/L時，尚不能對毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的多形核白細胞中5-LOX的激活產(chǎn)生抑制效果[25]；當(dāng)咖啡酸的濃度大于50 μmol/L時，才對氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)的肝和結(jié)腸肌黏膜中5-LOX的激活表現(xiàn)出抑制作用[26]，上述結(jié)果提示，咖啡酸的最低有效濃度較高。此外，咖啡酸有抑制PGE2生成的作用，但沒有明顯的劑量依賴性[27]；而在同一研究中，CAPE對LTB4、LTC4和PGE2均有劑量依賴性的抑制。我們推測咖啡酸pKa(酸解離常數(shù))較小，脂溶性較差，而咖啡酸的衍生物由于其結(jié)構(gòu)的修飾導(dǎo)致脂溶性增加從而具有更好的成藥性，相應(yīng)地，抗炎活性也有所提高。HOEC作為一種咖啡酸酯，在30 min時也表現(xiàn)出了較咖啡酸更強的抑5-LOX和15-LOX活性。

本文從組織中酶的表達水平和全血中炎癥介質(zhì)的變化2個方面探究了HOEC可能的藥物作用機理。HOEC是一種具有抗炎活性的多靶點天然產(chǎn)物，在抗炎藥物的開發(fā)中，由于炎癥介質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和關(guān)聯(lián)性，多靶標藥物的開發(fā)已經(jīng)成為一種主流的抗炎藥物研發(fā)方向。因此，研究HOEC的藥物作用機制有助于理解多靶標抗炎藥物對炎癥網(wǎng)絡(luò)的作用。目前，對于HOEC的研究主要存在2個未解決的問題：(1)沒有掌握全部藥物作用靶點的信息，不能清楚地解釋其對COX表達水平和COX通路代謝產(chǎn)物的抑制作用機制；(2)HOEC在體內(nèi)極易水解代謝，無法通過體外的研究結(jié)果還原體內(nèi)的作用機制?？偟膩碚f，對HOEC體內(nèi)藥效評價和作用機制的研究為以后多靶標抗炎藥物的研究提供了實踐經(jīng)驗和思考。