益精杞菊地黃顆粒對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響

張兆康 ，倘孟瑩 ，滕月 ，張麗霞

青光眼（glaucoma）是一種眼科常見疾病，其發(fā)病迅速、危害性大且不可逆轉(zhuǎn)，且具有隱匿性、遺傳性等特點，是導(dǎo)致人類失明的三大致盲眼病之一［1］。它是以視神經(jīng)結(jié)構(gòu)、視功能狀態(tài)改變及視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維缺損為特征的視神經(jīng)退行性疾病。根據(jù)世界各地流行病研究［2］，到2020年和2040年全球青光眼人數(shù)將分別達(dá)到7960萬和1.118億。青光眼視神經(jīng)保護(hù)藥物種類不少，新的藥物也不斷推出，但療效都存在一定局限性［3］。本項目通過燒灼鞏膜上靜脈法建立持續(xù)性高眼壓動物模型,評價益精杞菊地黃顆粒對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Retinal ganglion cells，RGCs）凋亡的影響，為該中藥臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠7～8 w齡 60只,體重約180～220g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供?！耙婢骄盏攸S顆?！庇设坭阶优浞筋w粒、菊花配方顆粒、熟地黃配方顆粒、山萸肉配方顆粒、澤瀉配方顆粒、茯苓配方顆粒、黃芪配方顆粒等組成，由中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院藥劑科提供，加適量水溶解，無菌密封后放入4℃冰箱保存。

1.2 分組及模型建立

1.2.1 實驗分組及給藥 將“益精杞菊地黃顆?！迸R床成人劑量（mg/kg）的 5倍、10倍、20倍，分別定為高劑量中藥組、中劑量中藥組、低劑量中藥組，每組大鼠各12只，高、中、低劑量中藥組分別給予不同濃度的顆粒劑灌胃給藥。模型組與對照組給予等量的生理鹽水灌胃。

1.2.2 高眼壓動物模型的建立 根據(jù)燒灼鞏膜上靜脈法制成慢性高眼壓模型［4］。術(shù)前左氧氟沙星眼藥水沖洗眼部（右眼）消毒，于上瞼中點做牽引縫線以拉開眼瞼。在顯微鏡下，沿角膜緣外2 mm處行放射狀的切口剪開外側(cè)及上方球結(jié)膜，仔細(xì)分離筋膜和肌肉，可發(fā)現(xiàn)暴露鼻上、顳上和顳下象限2或3條鞏膜上靜脈，用眼科手術(shù)止血器燒灼這3支鞏膜上靜脈，烙閉成功的標(biāo)志即燒灼處靜脈血流消失，近端靜脈充血怒張。術(shù)后用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，平復(fù)球結(jié)膜，復(fù)方妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。大鼠的平均眼壓在22 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上者則為造模成功。

1.2.3 取材及標(biāo)本制備灌胃給藥4 w后進(jìn)行取材，將大鼠過量麻醉處死，快速摘取右眼眼球，留取部分球后視神經(jīng)組織，4%多聚甲醛（4℃）中固定24 h，石蠟包埋備HE染色、Tunel實驗用。

1.3 檢測方法

1.3.1 眼壓測量 用Tono-pen AVIA筆式眼壓計測量眼壓。測量時予鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉，眼壓計輕觸角膜10次，自動讀取眼壓值（去除變異系數(shù)＞5%的數(shù)值）。每次測量眼壓均在上午10點左右，由同一人進(jìn)行完成，每次每只眼測量3次，取平均值。分別于造模前、造模后即刻及造模后每周測量1次,共1個月。

1.3.2 HE染色 石蠟切片常規(guī)脫臘至水化；采取蘇木素-伊紅染色，經(jīng)75%乙醇1×10 s，85%乙醇Ⅱ1×10 s，95%乙醇Ⅰ1×30 s、乙醇Ⅱ1×30 s，100%乙醇Ⅰ1×3 min、100%乙醇Ⅱ1×3 min、100%乙醇Ⅲ1×3 min，二甲苯Ⅰ1×3 min、二甲苯Ⅱ1×3 min、二甲苯Ⅲ1×3 min進(jìn)行脫水透明。中性樹膠封片，風(fēng)干,光鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)及大鼠RGCs層細(xì)胞數(shù)量。

1.3.3 TUNEL檢測 石蠟切片常規(guī)脫臘至水化;0.25%Triton X-100檸檬酸鈉溶液（0.1%）4℃反應(yīng)30 min；制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用TdT50 μl+熒光素標(biāo)記的dUTP液450 μl混勻；而陰性對照組僅加50 μl熒光素標(biāo)記的dUTP液；玻片干后，處理組滴加TUNEL反應(yīng)混合液50 μl，陰性對照組滴加dUTP 液 50 μl，置 37℃濕盒中 1 h；滴加 DAPI300 μl于標(biāo)本上，室溫下5 min；玻片干后，用抗熒光衰減封片劑封片，風(fēng)干，熒光顯微鏡下觀察并拍照。觀察各組大鼠RGCs的凋亡情況，計算出大鼠RGCs層的凋亡陽性細(xì)胞率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，定量指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間的比較用完全隨機(jī)設(shè)計的單因素方差分析（One-way ANOVA）。兩組間的多重比較，采用LSD-t檢驗，各組與對照組或模型組的比較，采用Dunnett t(2-sided)。自身的前后對照比較用配對t檢驗（Paired-samples T Test）,當(dāng) P＜0.05，則認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼壓測量結(jié)果

造模前大鼠眼壓平均為 （12.90±1.23）mm Hg，各組大鼠眼壓比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。造模后用藥前，模型組及高、中、低劑量中藥組的大鼠眼壓明顯升高，與造模前比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與空白組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01)，說明造模成功；而模型組與各用藥組大鼠眼壓比較，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明各組間均衡、有可比性。用藥后1個月，模型組及高、中、低劑量中藥組與造模前比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與空白組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01)；模型組及各用藥組與造模后用藥前比較，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但各用藥組眼壓有所下降；模型組眼壓與各用藥組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中藥各用藥組間比較，無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。 見表1

表1 各組大鼠造模及用藥前后的眼壓比較(，n=12)(單位:mm Hg)

表1 各組大鼠造模及用藥前后的眼壓比較(，n=12)(單位:mm Hg)

注：▲與造模前比較，P＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義。*與模型組比較，P＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義。#與空白組比較，P＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義。

組別 造模前 造模后用藥前 用藥后1個月空白組 13.36±1.80 13.27±1.67* 13.00±0.33*模型組 12.91±1.57 34.81±1.99▲# 32.55±1.96▲#高劑量中藥組 12.36±1.56 35.64±1.12▲# 32.91±1.75▲#中劑量中藥組 12.96±1.43 35.54±1.43▲# 33.00±1.34▲#低劑量中藥組 13.55±1.44 34.98±1.53▲# 32.04±1.41▲#

2.2 HE染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜的病理變化

2.2.1 大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu) 空白組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整，各層次分明、排列整齊，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）單層排列，形態(tài)規(guī)則，內(nèi)、外核層排列整齊，無異常。模型組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)不完整，RGCs數(shù)量明顯減少、排列十分紊亂、形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞胞核裂解、變性，內(nèi)、外核層排列疏松。中劑量中藥組大鼠視網(wǎng)膜各層次基本分明，RGCs排列較整齊，形態(tài)較規(guī)則，數(shù)量無明顯減少，內(nèi)外核層排列稍紊亂。高、低劑量中藥組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)破壞，RGCs數(shù)量減少、排列較紊亂，內(nèi)外核層排列較疏松。見圖1

2.2.2 大鼠RGCs層細(xì)胞數(shù)量 模型組RGCs層細(xì)胞數(shù)量較空白組顯著減少（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，高、中劑量中藥組RGCs層細(xì)胞數(shù)量較多（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；低劑量中藥組與模型組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2

2.3 Tunel檢測各組大鼠RGCs凋亡結(jié)果

干預(yù)1個月后，空白組大鼠RGCs層中未見細(xì)胞凋亡，模型組大鼠RGCs層中TUNEL陽性細(xì)胞明顯表達(dá)，內(nèi)、外核層存在細(xì)胞凋亡，中劑量中藥組大鼠RGCs層中TUNEL陽性細(xì)胞少量表達(dá)，低、高劑量中藥組表達(dá)較多。見圖2

各組大鼠RGCs中凋亡率分別為空白組（4.32±4.05）%、 模型組 （31.49±2.27）%、 高劑量中藥組（26.64±2.51）%、中劑量中藥組（12.91±1.44）%、低劑量中藥組（27.43±22.51）%?？瞻捉M與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；中劑量中藥組較模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；高、低劑量中藥組較空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，較模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2

表2 各組大鼠RGCs層細(xì)胞計數(shù)及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率比較（，n=12）

表2 各組大鼠RGCs層細(xì)胞計數(shù)及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率比較（，n=12）

注：* 與模型組比較，P＜0.01；# 與空白組比較，P＜0.01

組別 RGCs層細(xì)胞計數(shù) 凋亡率（%）空白組 17.33±1.79* 4.32±4.05*模型組 9.37±1.71 31.49±2.27#高劑量中藥組 13.30±1.41* 26.64±2.51#中劑量中藥組 15.32±1.46* 12.91±1.44*#低劑量中藥組 10.52±1.31 27.43±22.51#F 122.52 120.98 P＜0.001 ＜0.001

圖1 光學(xué)顯微鏡下各組大鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)（400× HE）1A 空白組；1B 模型組；1C高劑量組；1D中劑量組；1E低劑量組

圖2 熒光顯微鏡下各組大鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的凋亡 （200×TUNEL）2A 空白組；2B 模型組；2C高劑量中藥組；2D中劑量中藥組；2E低劑量中藥組。白箭頭指凋亡細(xì)胞

3 討論

3.1 動物模型的制備與思考

青光眼的動物模型大多是通過升高眼壓而達(dá)到實驗?zāi)M青光眼視神經(jīng)損害的目的。青光眼造模方法很多，且在不同時期曾廣泛應(yīng)用，但各有利弊。目前常用的慢性高眼壓模型建立方法主要有前房注射法、激光光凝鞏膜上靜脈法、高滲鹽水注射鞏膜上靜脈法、鞏膜上靜脈燒灼法等[5-7]。

本實驗選擇燒灼大鼠鞏膜上靜脈法造模，烙閉SD大鼠的右眼鼻上、顳上和顳下象限3條鞏膜上靜脈，使房水外流阻力增加。近幾年，這種方法被廣泛用于動物實驗研究中。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后即刻眼壓明顯升高，在造模后1個月眼壓穩(wěn)定，保持在高眼壓水平，同時病理及細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，隨著高眼壓損傷時間持續(xù)，RGCs結(jié)構(gòu)呈進(jìn)行性損害，RGCs層細(xì)胞數(shù)量不斷遞減，RGCs層凋亡率顯著增加，與國內(nèi)外研究一致[4,8]。因此，該實驗慢性高眼壓模型建立是成功的。綜合國內(nèi)外文獻(xiàn)，該模型方法較成熟，優(yōu)勢在于簡單、易于操作、重復(fù)性強(qiáng)、成本較低，眼壓升高維持時間較長且穩(wěn)定，并能造成視神經(jīng)損害，類似于人類青光眼發(fā)病過程，有利于青光眼的視神經(jīng)保護(hù)的進(jìn)一步研究。

3.2 益精杞菊地黃顆粒對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

本實驗通過病理學(xué)及細(xì)胞凋亡檢測表明益精杞菊地黃顆粒對慢性高眼壓大鼠RGCs有保護(hù)作用。從組織病理學(xué)可以看出模型組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)不完整，RGCs排列十分紊亂、形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞胞核被破壞，內(nèi)、外核層排列疏松，RGCs層的細(xì)胞數(shù)量較空白組顯著減少（P＜0.01）。中藥中劑量組經(jīng)治療后，視網(wǎng)膜各層次基本分明，RGCs形態(tài)較規(guī)則，排列較整齊，內(nèi)、外核層排列稍紊亂，RGCs層的細(xì)胞數(shù)量比模型組多（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。中藥高、低劑量組類似于模組型的病理變化。從Tunel檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠RGCs層中TUNEL陽性細(xì)胞明顯表達(dá)，內(nèi)、外核層存在細(xì)胞凋亡。中藥中劑量組TUNEL陽性細(xì)胞少量表達(dá)，較模型組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。以上研究結(jié)果說明中劑量的益精杞菊地黃顆粒在一定程度上可減少RGCs凋亡，對青光眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有保護(hù)作用。

高健生研究員在長期的臨床基礎(chǔ)上總結(jié)出 “益精升陰斂聚法”[9]，并創(chuàng)立了青光眼視神經(jīng)保護(hù)的有效經(jīng)驗方“益精杞菊地黃顆?！盵10]。他認(rèn)為青光眼是因玄府閉塞，氣血津液不行而引發(fā)的目系眼病?！靶]塞、精血不足、髓海失養(yǎng)”應(yīng)是青光眼視神經(jīng)損害的主要病機(jī)，故以“疏通玄府、補(bǔ)益肝腎”作為青光眼視神經(jīng)保護(hù)的首要治則。

益精杞菊地黃顆粒劑是根據(jù)以上思想，在經(jīng)典方杞菊地黃丸基礎(chǔ)上化裁而成，去山藥，加葛根、生黃芪等。方中六味地黃丸可滋補(bǔ)肝腎精血，熟地黃，甘微溫，歸肝腎經(jīng)，補(bǔ)血養(yǎng)陰、填精益髓；菊花，苦辛微寒，清熱解毒，清疏上焦頭目風(fēng)熱，有助于升發(fā)陰精；枸杞子，甘平，歸肝腎經(jīng)，滋補(bǔ)肝腎、益精明目。二者入肝經(jīng)，具有滋陰、養(yǎng)肝、明目之效。既往諸醫(yī)家，其治多注重補(bǔ)益肝腎，而未考慮到神光即視功能的保護(hù)，不只依賴陰精，還要重視氣與陽的作用，所以在補(bǔ)陰藥基礎(chǔ)上輔以補(bǔ)陽藥物。生黃芪，味甘，微溫，可補(bǔ)氣健脾、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿消腫、托毒生肌。氣為血之帥，生黃芪大補(bǔ)元氣，能助血運(yùn)行，升舉清揚(yáng)之氣達(dá)目竅，并且取其“陽中求陰”之意，使陰精泉源不竭，上養(yǎng)目竅。補(bǔ)益肝腎之品多質(zhì)重滋膩，入下焦，但目竅精微，其位高，所以常加入升運(yùn)精血之升陰藥物。葛根，甘、辛，涼，能解肌透疹、生津止渴、升陽止瀉，本方取其升發(fā)之意，有升發(fā)陰精之效。全方合用，共奏滋補(bǔ)肝腎、益精養(yǎng)血明目之功，保護(hù)青光眼患者的視功能?，F(xiàn)代藥理研究，葛根素[11]能擴(kuò)血管，改善高眼壓視神經(jīng)軸漿流及視盤微循環(huán)，防治視網(wǎng)膜損傷。茯苓、澤瀉可緩解房水的瘀閉狀態(tài)，降低眼壓。以上諸藥相配充分發(fā)揮滋補(bǔ)肝腎、益精養(yǎng)血明目的作用，以保護(hù)青光眼患者的視功能。

3.3 展望

中藥在青光眼視神經(jīng)保護(hù)方面有具有廣闊前景和潛力，高健生研究員創(chuàng)立的 “益精杞菊地黃顆粒劑”雖主治目疾，但是從整體觀念角度調(diào)節(jié)全身的臟腑經(jīng)絡(luò)、氣血津液，體現(xiàn)了中醫(yī)的“治病求本”治療原則[12]。本課題從病理學(xué)、細(xì)胞凋亡等方面觀察了益精杞菊地黃顆粒對慢性高眼壓大鼠RGCs的影響,發(fā)現(xiàn)其抑制、延緩RGCs凋亡的作用。

臨床上治療青光眼經(jīng)驗是在 “益精杞菊地黃顆粒劑”基礎(chǔ)上聯(lián)合降眼壓藥物，所以后續(xù)動物實驗我們可加入益精杞菊地黃顆粒劑和降眼壓藥治療組，進(jìn)行更深層的觀察研究，為臨床治療方案的研究提供理論基礎(chǔ)。還可進(jìn)行拆方處理，探討方中起主要作用的藥物。