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    一菌雙酶法轉(zhuǎn)化富馬酸生成β-丙氨酸

    2018-12-26 02:45:52陳明亮肖延銘李敬亞梁阿朋
    發(fā)酵科技通訊 2018年4期
    關(guān)鍵詞:天冬氨酸富馬酸底物

    陳明亮,祁 瑛,肖延銘,華 超,李敬亞,梁阿朋

    (1.長興制藥股份有限公司 工業(yè)生物催化與轉(zhuǎn)化浙江省工程研究中心,浙江 長興313100;2.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院,河南 鄭州450001)

    L-天冬氨酸(L-Aspartic acid)是一種常見的酸性氨基酸,在醫(yī)藥、食品、美容、化工和材料等方面具有非常廣泛的用途[1-2]。以L-Asp為原料合成的阿斯巴甜和紐甜,適用于兒童、孕婦、哺乳期婦女以及肥胖、心血管病和糖尿病患者在內(nèi)的所有人群[3-4]。L-Asp還參與鳥氨酸循環(huán),可用作氨解毒劑、肝機能促進劑和疲勞恢復(fù)劑等藥品以及食品添加劑[5]。工業(yè)生產(chǎn)L-Asp主要是由天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(L-Aspar-tase,EC4.3.1.1,AspAT)催化富馬酸加氨合成,具有酶活力高、工藝簡潔和設(shè)備投資少等優(yōu)勢,是當(dāng)今生產(chǎn) L-Asp的主流工藝[6-7]。β-Ala是自然界中唯一存在的β-型氨基酸,也是一種非蛋白氨基酸,存在于某些細(xì)菌、真菌和植物中[8]。β-Ala及其衍生物在醫(yī)藥、食品和化工等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)藥方面,β-Ala用于合成泛酸、泛酸鈣、肌肽、帕米膦酸鈉和巴柳氮等[9];在化工方面應(yīng)用于電鍍、鉛中毒解毒劑及合成甜味劑[10]。國內(nèi)外β-Ala的生產(chǎn)主要以化學(xué)合成法為主[11],即以丙烯酸或丙烯腈為底物進行合成,此法生產(chǎn)過程中消耗大量能量,同時對環(huán)境和生物體都有一定的毒害作用。另一種生產(chǎn)方法是生物合成法,利用L-天冬氨酸α-脫羧酶(L-aspartateα-decarboxylase,EC4.1.1.11,PanD)、以 LAsp為底物催化生成β-Ala[12],此法專一性高且環(huán)保,缺點是L-Asp價格偏高。L-天冬氨酸α-脫羧酶催化L-天冬氨酸脫去α位的羧基生成β-Ala,是生物體內(nèi)泛酸合成中重要的酶。酶法制備β-Ala的研究中,江南大學(xué)高宇通過偶聯(lián)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和L-天冬氨酸α脫羧酶直接以富馬酸和氨為底物合成β-Ala,且產(chǎn)量達(dá)到9.8g/L[13]。

    本研究將天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和L-天冬氨酸α脫羧酶構(gòu)建于同一個載體質(zhì)粒上,并導(dǎo)入大腸桿菌宿主進行表達(dá),使得一次發(fā)酵即可得到兩種酶。而后通過細(xì)胞通透處理和固定化細(xì)胞技術(shù)[14],使得發(fā)酵獲得的酶可重復(fù)使用多次。該方法獲得的酶可直接以廉價的富馬酸和氨水為底物合成β-Ala,整個反應(yīng)體系中無中間產(chǎn)物L(fēng)-Asp積累,既簡化了生產(chǎn)方法,又降低了生產(chǎn)成本。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

    大腸桿菌K12MG1655亞菌株(Escherichiacoli K12substrain MG1655),谷氨酸棒桿菌 ATCC 13032(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032),E.coli DH5α,E.coli BL21(DE3)和pRSFDuet-1均由本公司保藏。

    LB/Kana培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 5g/L。調(diào)節(jié)pH 至7.2,121 ℃滅菌20min。待培養(yǎng)基冷卻至40~50℃,添加事先配制并過濾除菌后的卡那霉素(Kana),使其終質(zhì)量濃度為50μg/mL。

    TB/Kana培養(yǎng)基:蛋白胨12g,酵母提取物24g,甘油4mL,各組分溶解于0.9L水中,121℃滅菌20min。待其冷卻到40~50℃,加入100mL滅菌后含有0.17mol/L KH2PO4和0.72mol/L K2HPO4的溶液,并添加事先配制好的過濾除菌后的卡那霉素溶液,使培養(yǎng)基最終質(zhì)量濃度為50μg/mL。

    1.1.2 生化試劑

    富馬酸、氨水、NaH2PO4和Na2HPO4購自國藥化學(xué)試劑有限公司,L-天冬氨酸和β-丙氨酸購自阿拉丁,蛋白胨和酵母粉購自O(shè)xoid,其余均為市售分析純。

    1.2 方 法

    1.2.1 菌種構(gòu)建

    根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中大腸桿菌K12MG1655亞菌株的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因序列和谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的L-天冬氨酸α-脫羧酶PanD 基因序列分別設(shè)計引物,正向引物 AspAT-F-BamHI:5’-CGCGGATCCATGTTTGAGAACATTACCGC-3’,PanD-F-NdeI: 5’-GGAATTCCATATGCTGCGCACCATCCTCGGAAG-3’;反 向引物 AspAT-RNotI: 5’-ATAAGAATGCGGCCGCCAGCACTGCCACAATCGCTTC-3’, PanD-R-XhoI: 5’-CCGCTCGAGCTAAATGCTTCTCGACGTCA-3’(下劃線部分為限制性酶切位點)。分別挑取Escherichiacoli K12MG1655 和 Corynebacterium glutamicumATCC 13032單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14h后,收集菌體提取基因組,以此基因組為模板分別進行PCR,得到AspAT和PanD基因序列,擴增程序如下:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,60℃退火30s,72 ℃延伸(AspAT1.5min,PanD1min),30個循環(huán)后72℃延伸10min。AspATPCR產(chǎn)物純化后與質(zhì)粒pRSFDuet-1分別用BamHI和NotI進行雙酶切,所得酶切產(chǎn)物純化后按一定比例在16℃進行過夜連接,隨后轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中,利用卡那霉素抗性篩選得到克隆菌株,提取質(zhì)粒進行酶切驗證和測序,獲得正確的重組子pRSFDuet-1-AspAT。PanDPCR 產(chǎn)物純化后與重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-AspAT 分別用NdeI和XhoI進行雙酶切,所得酶切產(chǎn)物純化后按上述方法進行過夜連接,隨后轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中,利用卡那霉素抗性篩選得到重組表達(dá)菌株,提取質(zhì)粒后經(jīng)雙酶切和測序檢測,獲得重組表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-AspAT-PanD。

    1.2.2 重組菌發(fā)酵

    將重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-AspAT-PanD 接種于4mL卡那霉素質(zhì)量濃度為50μg/mL的LB液體培養(yǎng)基,37℃,200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。將上述過夜培養(yǎng)物按1%的接種量接種于卡那霉素質(zhì)量濃度為50μg/mL的TB液體培養(yǎng)基,37℃,200r/min振蕩培養(yǎng)菌液至OD600為0.6~0.8,加入IPTG 至終濃度為0.3mmol/L,25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16~20h,培養(yǎng)液于5 000r/min離心15min,收 集 菌 體 細(xì) 胞,用 0.1mol/L 的NaH2PO4/Na2HPO4(pH 7.5)緩沖液清洗菌體一次,通過SDS-PAGE分析鑒定重組蛋白表達(dá)水平。

    1.2.3 檢測方法

    β-Ala測定:反應(yīng)液用苯基異硫酸酯(PITC)衍生。具體步驟為:取500μL反應(yīng)液于1.5mL離心管中,加入250μL 0.1mol/L PITC乙腈溶液和250μL 1mol/L三乙胺乙腈溶液,充分混勻,避光室溫放置0.5h,加入700μL正己烷溶液,渦旋振蕩器振蕩1min,靜置30~60min,吸取下層溶液,經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾,進樣量為10μL。

    β-丙氨酸衍生產(chǎn)物用HPLC測定。色譜柱為LaChrom C18(5μm,4.6mm×250mm);流動相 A溶液為體積分?jǐn)?shù)為80%的已腈水溶液,B溶液為V(乙酸鈉)∶V (乙腈)=97∶3,pH 6.5的0.1mol/L乙酸鈉-乙腈溶液;采用梯度洗脫,0~20min,B溶液的流速由95%下降到65%;20~30min,B溶液流速由65%上升到95%;30~35min,B溶液梯度不變。檢測波長為254nm,柱溫為40℃。

    1.2.4 通透處理

    由于表達(dá)的AspAT和PanD都是胞內(nèi)酶,細(xì)胞被膜(細(xì)胞壁和細(xì)胞膜)的屏障作用限制了底物及產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)外的交換,因此菌體的表觀催化活力較差。細(xì)胞透性化技術(shù)可以在不破壞細(xì)胞整體有機體系的情況下改變細(xì)胞被膜的通透性,使得小分子和一些較大分子物質(zhì)能夠自由進出細(xì)胞,使胞內(nèi)酶在相對穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中發(fā)揮作用,從而提高菌體催化效率[15]。

    將1.2.2中獲得的菌體按50g/L的質(zhì)量濃度重懸于0.1mol/L的 NaH2PO4/Na2HPO4(pH 7.5)緩沖液中,按5mL/L菌懸液體積分?jǐn)?shù)加入甲苯,于37℃,100r/min轉(zhuǎn)速下振蕩處理1h,離心收集菌體,用0.1mol/L的 NaH2PO4/Na2HPO4(pH 7.5)緩沖液清洗兩次后置于4℃環(huán)境中備用。

    1.2.5 酶活檢測

    稱取10g富馬酸,加入 適量0.1mol/L 的NaH2PO4/Na2HPO4(pH 7.5)緩沖液攪拌均勻,緩慢加入濃氨水,調(diào)節(jié)pH到7.5后用緩沖液定容至100mL,然后在該體系中加入1.2.4中通透處理過的菌體1g,37℃,200r/min下進行酶促反應(yīng)15min,終止反應(yīng)時取適量反應(yīng)液于100℃煮沸10min,12 000r/min離心10min,取上清,用0.22μm微孔有機濾膜過濾,利用HPLC檢測β-Ala濃度。

    酶活定義:在pH 7.5,溫度37℃的條件下,每小時轉(zhuǎn)化生成1μmo/Lβ-Ala的酶量,定義為一個酶活力單位μmol/(g·h),簡稱 U/g。

    1.2.6 固定化細(xì)胞制備

    向90mL純化水中加入10g經(jīng)通透處理過的菌體和0.6g硅藻土,振蕩均勻,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的聚乙烯亞胺溶液3mL,于28℃,100r/min振蕩交聯(lián)1h,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛溶液1mL繼續(xù)振蕩交聯(lián)1h,結(jié)束后抽濾收集固定化細(xì)胞,清水淋洗3次,置于4℃環(huán)境溫度下備用。

    1.2.7 固定化細(xì)胞最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

    按照1.2.5中酶活測定方法,分別在30,35,40,45,50,55,60,65,70 ℃測定酶活以確定最適反應(yīng)溫度。

    將固定化細(xì)胞分別在以上溫度下放置12h,然后在37℃條件下測酶活,比較不同溫度下固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性。

    1.2.8 固定化細(xì)胞最適pH以及pH穩(wěn)定性

    配制0.1mol/L,pH 為 5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5和10的檸檬酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液和Tris-HCl緩沖液,分別用以上不同pH的緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)測定酶活以確定最適pH。

    將固定化細(xì)胞分別用以上緩沖液在10℃下保存12h,然后在pH 7.5條件下測酶活,以確定不同pH條件下固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性。

    1.2.9 固定化細(xì)胞加酶量及底物質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

    設(shè)定富馬酸質(zhì)量濃度100g/L不變,改變固定化細(xì)胞的量,使得富馬酸完全轉(zhuǎn)化為β-Ala,以確定最適的固定化細(xì)胞投加量。

    用固定化細(xì)胞分別催化質(zhì)量濃度為100,150,200,250,300,350,400,450g/L的富馬酸轉(zhuǎn)化為β-Ala,HPLC檢測β-Ala含量,以確定最高底物質(zhì)量濃度。

    1.2.10 固定化細(xì)胞重復(fù)使用次數(shù)

    按照1.2.7~1.2.9中優(yōu)化好的條件,重復(fù)使用固定化細(xì)胞催化富馬酸轉(zhuǎn)化成β-Ala,跟蹤檢測其每次轉(zhuǎn)化最終β-Ala的濃度。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 酶活檢測

    在100mL質(zhì)量濃度為100g/L的富馬酸溶液中加入1g通透細(xì)胞,37℃,200r/min下酶促反應(yīng)15min,生成質(zhì)量濃度為19g/L的L-Ala,酶活為85.4U/g。

    2.2 固定化細(xì)胞

    10g通透細(xì)胞重懸于90mL純水后菌懸液酶活為8.5U/mL,固定化完成后,得固定化細(xì)胞13.4g,酶活為40.9U/g,酶活回收率約64.2%。

    2.3 固定化細(xì)胞最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

    固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)溫度實驗結(jié)果如圖1(a)所示。隨著反應(yīng)溫度的升高,固定化細(xì)胞的酶活呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,在50℃條件下酶活最高,45℃條件下與50℃時相差不大。固定化細(xì)胞的熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果如圖1(b)所示,酶的熱穩(wěn)定性在較低的溫度范圍內(nèi)較好,在45℃以下酶活基本無損失,在較高的溫度下酶活損失非常快,55℃下酶活便迅速下降,為30℃酶活的66%。由以上實驗結(jié)果得出:固定化細(xì)胞反應(yīng)最適溫度為50℃,但酶的穩(wěn)定性在45℃以下時保持穩(wěn)定。因此,固定化細(xì)胞在催化富馬酸轉(zhuǎn)化為β-Ala時選擇45℃比較合適,能夠在保證較高酶活的同時保持較高穩(wěn)定性。

    圖1 固定化細(xì)胞最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性Fig.1 Optimum reaction temperature and thermal stability of immobilized cells

    2.4 固定化細(xì)胞最適pH及pH穩(wěn)定性

    固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)pH實驗結(jié)果如圖2(a)所示,隨著pH的上升,固定化細(xì)胞的酶活呈現(xiàn)先升后降的趨勢,最適pH為7.5。固定化細(xì)胞在不同pH條件下的穩(wěn)定性如圖2(b)所示,在pH 6.5~8.5的范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。因此,固定化細(xì)胞在催化富馬酸轉(zhuǎn)化為β-Ala時選擇pH 7.5比較合適,能夠在保證較高酶活的同時保持較高穩(wěn)定性。

    圖2 固定化細(xì)胞最適pH以及pH穩(wěn)定性Fig.2 Optimum pH and pH stability of immobilized cells

    2.5 固定化細(xì)胞投加量及底物質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

    在100mL質(zhì)量濃度為100g/L的富馬酸溶液中加入不同量的固定化細(xì)胞,45℃,200r/min下進行酶促反應(yīng),固定化細(xì)胞的投加量與β-Ala的產(chǎn)率如圖3(a)所示。隨著投酶量的加大,β-Ala的產(chǎn)率也隨之上升,當(dāng)固定化酶加到3g時,β-Ala的產(chǎn)率達(dá)到最大,繼續(xù)增加投酶量,β-Ala的產(chǎn)率不變。因此固定化細(xì)胞的貢獻(xiàn)率為3.3,即1g固定化細(xì)胞可催化3.3g底物。

    固定化細(xì)胞催化過程中底物質(zhì)量濃度與β-Ala的產(chǎn)率如圖3(b)所示。底物在質(zhì)量濃度達(dá)到300g/L(包括300g/L)前均可被完全轉(zhuǎn)化成β-Ala,超過300g/L后β-Ala的產(chǎn)率開始下降。隨著底物富馬酸質(zhì)量濃度的增加,產(chǎn)物β-Ala的質(zhì)量濃度也在不斷地增加,當(dāng)β-Ala達(dá)到一定質(zhì)量濃度后會抑制反應(yīng)的進行,使得β-Ala的產(chǎn)率下降,故該固定化細(xì)胞可催化的最高底物質(zhì)量濃度為300g/L。

    圖3 固定化細(xì)胞投加量及底物質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of immobilized cell dosage and substrate concentration on transformation reaction

    2.6 固定化細(xì)胞重復(fù)使用次數(shù)

    根據(jù)2.3~2.5得出的試驗結(jié)果,在pH 7.5,溫度45℃,200r/min條件下用固定化酶催化質(zhì)量濃度為300g/L的富馬酸轉(zhuǎn)化成β-Ala,每次轉(zhuǎn)化結(jié)束后將固定化細(xì)胞回收洗凈再繼續(xù)轉(zhuǎn)化下一批,測得β-Ala的產(chǎn)率與固定化細(xì)胞使用次數(shù)的關(guān)系如圖4,固定化細(xì)胞可連續(xù)使用12次。

    圖4 β-Ala的產(chǎn)率與固定化細(xì)胞得使用次數(shù)的關(guān)系Fig.4 The relationship between the yield ofβ-Ala and the number of times of immobilized cells

    3 結(jié) 論

    將AspAT和PanD酶構(gòu)建入同一大腸桿菌表達(dá)載體并成功表達(dá)了兩個酶,將菌體做通透處理并固定化,固定化酶活回收率為64.2%,固定化細(xì)胞貢獻(xiàn)率為3.3,在pH 7.5,溫度45℃時最高可將質(zhì)量濃度為300g/L的富馬酸完全轉(zhuǎn)化成β-Ala,固定化細(xì)胞可連續(xù)使用12次。該方法獲得的酶以廉價的富馬酸和氨水為底物,整個反應(yīng)體系中無中間產(chǎn)物L(fēng)-Asp的積累,簡化了生產(chǎn)方法,有效降低了生產(chǎn)成本。

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