環(huán)境脅迫下食竇魏斯氏菌的耐受性評(píng)價(jià)

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(重慶第二師范學(xué)院重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心,功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室,生物與化學(xué)工程學(xué)院,重慶 400067)

食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)是魏斯氏菌屬(Weissella)的一個(gè)種,呈革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性,屬于乳酸菌屬的一個(gè)分支。目前,GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中魏斯氏菌屬已命名的種有19個(gè),其分布極為廣泛,從新鮮蔬菜、泡菜、小麥酸面團(tuán)、胡蘿卜汁肉制品、胃腸道和口腔中均可獲得[1-4]。此外,研究發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌及其代謝產(chǎn)物在食品、醫(yī)藥等諸多行業(yè)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。Li等[5]從泰國(guó)發(fā)酵魚(yú)產(chǎn)品中分離出的Weissellacibaria110產(chǎn)生的weissellicin 110細(xì)菌素,可作為肉制品及乳制品的防腐劑;Lee等[6]以前期從人體糞便中分離出的3株融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)和5株食竇魏斯氏菌為研究對(duì)象,評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)菌株的潛在益生特性,結(jié)果表明融合魏斯氏菌和食竇魏斯氏菌對(duì)pH3.0和0.3%膽鹽具有一定的耐受性,且對(duì)Coca-2細(xì)胞的粘附能力較好,均高于LactobacillusrhamnosusGG對(duì)Coca-2細(xì)胞的粘附能力。在致病性Escherichiacoli誘導(dǎo)的腹瀉小鼠中,Jurnalis等[7]研究表明,灌胃Weisellaparamesenteroides能夠有效減少腹瀉小鼠的腹瀉頻率、降低腹瀉小鼠糞便中TNF-α的水平、增加腹瀉小鼠腸道中的乳酸菌數(shù)量和減少其厭氧細(xì)菌與大腸桿菌的數(shù)量。Lim等[8]研究WeissellacibariaWIKIM28改善2,4-二硝基氯誘導(dǎo)的過(guò)敏性皮炎，結(jié)果表明,灌胃WeissellacibariaWIKIM28不僅可以減少過(guò)敏性皮炎皮膚損傷、表皮增厚和血清免疫球蛋白E水平,還能減少外周淋巴結(jié)細(xì)胞Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5和 IL-13的水平;此外,灌胃WeissellacibariaWIKIM28還能促進(jìn)腸系膜淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和增強(qiáng)IL-10的分泌,對(duì)小鼠過(guò)敏性皮炎具有較好的預(yù)防作用,對(duì)預(yù)防人類(lèi)過(guò)敏性皮炎具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

益生菌是指攝入一定量后對(duì)機(jī)體具有益生作用的一類(lèi)活性微生物,然而,由于益生菌在貯藏、運(yùn)輸、制劑化或工業(yè)化生產(chǎn)中常受到多種環(huán)境因素的影響,使其活性減弱或生理特性受到影響;加之菌體進(jìn)入機(jī)體內(nèi)會(huì)受到胃腸道中的胃酸與膽鹽的影響,因此并不是所有的微生物都可作為益生菌[9]。在益生菌的篩選中通常需要通過(guò)一定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。首先,微生物進(jìn)入機(jī)體內(nèi)會(huì)受到胃腸道低酸和膽鹽的作用,導(dǎo)致其活性受到抑制或殺死,影響其益生作用的發(fā)揮[10-11]。因此,微生物對(duì)低酸環(huán)境和膽鹽的耐受能力常作為篩選益生菌的重要指標(biāo)。其次,在益生菌的功能及其性質(zhì)研究中,菌株在腸道內(nèi)的定植能力、對(duì)致病菌的抑制作用、對(duì)抗生素的耐受性,以及對(duì)溫度和滲透壓的耐受力也常作為篩選的指標(biāo)。Ojekunle等[12]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WeissellacibariaWD2在模擬人工胃液中具有較高的存活率,并對(duì)低酸和膽鹽具有很好的耐受性;Elavarasi等[13]在評(píng)價(jià)乳酸菌的潛在益生特性中發(fā)現(xiàn)，分離自山羊奶的Weissellacibaria(KTSMBNL 28)的抗菌活性較好,能夠有效的抑制腸道致病菌的活性,且對(duì)人工胃液、膽鹽、青霉素、萬(wàn)古霉素和萘啶酸具有一定的耐受性,溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,該菌株具有非溶血性,從而確保其運(yùn)用的安全性。此外,Lee等[16]在研究人體糞便中8株魏斯氏菌的益生特性中發(fā)現(xiàn),7株魏斯氏菌在15和45 ℃下均能很好的生長(zhǎng),所有菌株在含有6.5% NaCl的MRS中也能夠很好生長(zhǎng)。

本研究以新鮮竹筍表面分離到的16株食竇魏斯氏菌為對(duì)象,研究低酸環(huán)境、人工胃液、膽鹽、溫度和NaCl脅迫下食竇魏斯氏菌的生長(zhǎng)情況,初步評(píng)價(jià)出具有良好耐受性的食竇魏斯氏菌,為進(jìn)一步研究食竇魏斯氏菌的益生功能及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16株食竇魏斯氏菌(HSG 01～HSG 16) 分離自重慶市萬(wàn)盛區(qū)黑山谷新鮮竹筍的表面,保藏于重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心;MRS肉湯 生化試劑,美國(guó)BD公司;瓊脂、膽鹽、胃蛋白酶 生化試劑,北京索萊寶生物科技有限公司;硫代乙醇酸鈉 生化試劑,山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;氯化鈉、鹽酸 生化試劑,成都市科龍化工試劑廠;D2000 DNA Marker、2×Taq PCR MasterMix、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302) 天根生化科技(北京)有限公司。引物27F(5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCA-3′)、1495R(5′-CTACGGC TACCTTGTTACGA-3′) 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;BY-G20醫(yī)用離心機(jī) 北京北洋醫(yī)療器械有限公司;SY-2230恒溫水浴搖床 美國(guó)精驥有限公司;MSC-100恒溫振蕩器 杭州奧盛儀器有限公司;OLYMPUS-BX43生物顯微鏡 日本奧林巴斯公司;LDZM-80KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安;A200梯度PCR儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;Tanon-2500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng) 上海天能公司;BIOMA TE 35紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化與鏡檢 將保藏于20%甘油中的16株實(shí)驗(yàn)菌株從-20 ℃冰箱中取出,室溫放置解凍后,分別取100 μL接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中,水浴恒溫振蕩器37 ℃、100 r/min培養(yǎng)24 h,如此連續(xù)活化2代后。取菌液1 mL于4000 r/min 離心10 min,用接種環(huán)挑取少量沉淀均勻的涂于載玻片上,經(jīng)革蘭氏染色[14]、鏡檢后,確定菌株是否為純種,備用。

1.2.2 菌株的種屬分析 細(xì)菌基因組DNA(模板)的提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。

PCR反應(yīng)體系為25 μL:模板1 μL,引物27F、1495R各1 μL,2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,加無(wú)菌超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min[15]。反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL PCR產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)合格樣品送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序,測(cè)序所得序列通過(guò)NCBI中的BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

從GeneBank中調(diào)取魏斯氏菌屬的6個(gè)種的序列作為參考序列,用MEGA 5.0軟件中的Alignment程序進(jìn)行多序列匹配比對(duì),并采用Kimura 2-parameter模式計(jì)算遺傳距離,Neighbor-Joining構(gòu)建實(shí)驗(yàn)菌株的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),Bootstrap為1000[16-18]。

1.2.3 菌懸液的制備 實(shí)驗(yàn)菌株37 ℃、100 r/min培養(yǎng)18 h后,取10 mL培養(yǎng)液于4 ℃、4000 r/min離心10 min,收集菌體沉淀,用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次,并調(diào)節(jié)其OD600 nm為1.0,備用[19]。

1.2.4 酸脅迫下生長(zhǎng)效率的測(cè)定 取菌懸液按2%接種量加入pH4.0的MRS肉湯中(1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH)[20],實(shí)驗(yàn)中以2%接種但未調(diào)節(jié)pH的MRS肉湯作對(duì)照,未接種且未調(diào)節(jié)pH的MRS肉湯作空白。37 ℃、100 r/min培養(yǎng)24 h后,測(cè)定培養(yǎng)液的OD600 nm值,按公式(1)計(jì)算實(shí)驗(yàn)菌株酸脅迫下的生長(zhǎng)效率。

生長(zhǎng)效率(%)=(不同pH培養(yǎng)液的OD600 nm-空白OD600 nm)/(對(duì)照OD600 nm-空白OD600 nm)×100

式(1)

1.2.5 溫度脅迫下生長(zhǎng)效率的測(cè)定 取菌懸液按2%接種量(v/v)加入MRS肉湯中(不調(diào)節(jié)pH,約為6.2),分別于4、15、37、45 ℃下,100 r/min培養(yǎng)24 h,并測(cè)定相應(yīng)MRS肉湯的OD600 nm值。實(shí)驗(yàn)中以37 ℃下MRS肉湯作對(duì)照,以未接種的MRS肉湯作空白[21]。按公式(2)計(jì)算實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)溫度脅迫下的生長(zhǎng)效率。

生長(zhǎng)效率(%)=(不同溫度下培養(yǎng)液的OD600 nm-空白OD600 nm)/(37 ℃下培養(yǎng)液的OD600 nm-空白OD600 nm)×100

式(2)

1.2.6 NaCl脅迫下生長(zhǎng)效率的測(cè)定 取菌懸液按2%接種量(v/v)加入含4%、6%和8% NaCl的MRS培養(yǎng)基中,以接種但不含NaCl的MRS培養(yǎng)基作對(duì)照,以未接種且不含NaCl的MRS培養(yǎng)基作空白[21]。37 ℃、100 r/min培養(yǎng)24 h后,測(cè)定培養(yǎng)液的OD600nm值,按公式(3)計(jì)算實(shí)驗(yàn)菌株鹽脅迫下的生長(zhǎng)效率。

生長(zhǎng)效率(%)=(不同NaCl濃度下培養(yǎng)液的OD600 nm-空白OD600 nm)/(不含NaCl培養(yǎng)液的OD600 nm-空白OD600 nm)×100

式(3)

1.2.7 人工胃液脅迫下存活率的測(cè)定 基于酸脅迫實(shí)驗(yàn),同時(shí)參考溫度和滲透壓脅迫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選出具有良好耐受力的菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取菌懸液1 mL與9 mL pH3.0人工胃液混勻,于37 ℃、100 r/min培養(yǎng)3 h,并采用平板計(jì)數(shù)分別記錄處理人工胃液處理0、3 h的活菌數(shù)[22],按公式(4)計(jì)算實(shí)驗(yàn)菌株在pH3.0人工胃液中的存活率。

式(4)

1.2.8 膽鹽脅迫下生長(zhǎng)效率的測(cè)定 基于酸脅迫實(shí)驗(yàn),同時(shí)參考溫度和滲透壓脅迫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選出具有良好耐受力的菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取菌懸液按2%接種量分別加入含0.1%、0.2%和0.3%膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基(指含有0.2%巰基乙酸鈉的MRS肉湯)中,實(shí)驗(yàn)中以2%接種但不含膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基作對(duì)照,以不接種且不含膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基作空白[23]。37 ℃、100 r/min培養(yǎng)24 h后,測(cè)定培養(yǎng)液的OD600nm值,按公式(5)計(jì)算實(shí)驗(yàn)菌株在不同膽鹽濃度脅迫下的生長(zhǎng)效率。

生長(zhǎng)效率(%)=(不同膽鹽濃度下培養(yǎng)液的OD600 nm-空白OD600 nm)/(對(duì)照OD600 nm-空白OD600 nm)×100

式(5)

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 活化菌株鏡檢結(jié)果

實(shí)驗(yàn)菌株活化后在MRS平板上的菌落形態(tài)均一,菌落邊緣整齊,中間凸起,表面光滑,呈黃色不透明狀(圖1a)。經(jīng)革蘭氏染色后,菌株細(xì)胞呈藍(lán)紫色,為革蘭氏陽(yáng)性。此結(jié)果表明菌株仍為純種,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1b)。

圖1 菌株HSG 02菌落形態(tài)(a)及革蘭氏染色結(jié)果(b)(1000×)Fig.1 Colonial morphology(a)and gram staining results(b)of HSG 02(1000×)

2.2 菌株16S rDNA序列分析

圖2為實(shí)驗(yàn)部分菌株16S rDNA序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果,由圖可知,擴(kuò)增條帶的位置介于1000～2000 bp,與預(yù)計(jì)目的條帶位置(1500 bp)相符;此外,PCR 擴(kuò)增后的條帶清晰明亮,無(wú)拖尾,且陰性對(duì)照無(wú)條帶,說(shuō)明 PCR擴(kuò)增成功,擴(kuò)增產(chǎn)物可用于后期測(cè)序。

圖2 部分菌株16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of parts strains 16S rDNA sequences

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序檢測(cè)后,將所得序列基于NCBI中的BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)分析,結(jié)果表明16株菌株均為食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中,各分支下的菌株親緣關(guān)系近,差異小;各分支長(zhǎng)度的差異代表進(jìn)化程度的高低。如圖3可知,實(shí)驗(yàn)菌株均與食竇魏斯氏菌以99%的自舉支持率聚在一起,此結(jié)果與16S rDNA序列分析結(jié)果相一致。此外,與選取的參考菌株相比,食竇魏斯氏菌與融合魏斯氏菌的親緣關(guān)系較近;而其它4種魏斯氏菌則單獨(dú)聚在另一分支,與食竇魏斯氏菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 實(shí)驗(yàn)菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on the selected strains 16S rDNA sequences

2.4 酸脅迫下的生長(zhǎng)效率

益生菌具有一定耐酸能力是其進(jìn)入腸道發(fā)揮益生作用的前提。實(shí)驗(yàn)中基于pH4.0 MRS肉湯初步篩選具有耐受低酸環(huán)境的食竇魏斯氏菌。由圖4可知,各實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)低酸環(huán)境的耐受性明顯不同,其中HSG 04和HSG 07在酸脅迫下的生長(zhǎng)效率較低,分別為15.37%和17.21%,說(shuō)明其對(duì)低酸環(huán)境的耐受性較差;而HSG 08和HSG 09均具有較高的生長(zhǎng)效率,分別為82.77% 和71.68%,說(shuō)明二者對(duì)低酸環(huán)境的耐受性較好。目前,對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株耐受酸性環(huán)境的機(jī)制尚不明確,主要的可能機(jī)制包括質(zhì)子泵機(jī)制、大分子保護(hù)和修復(fù)、堿生成、細(xì)胞密度及生物膜等[24]。如Lorca等[25]研究表明，L.acidophilusCRL639酸脅迫耐受的主要機(jī)制是膜F0F1-ATPase的作用,并不依賴(lài)于合成新的蛋白質(zhì)(F0F1-ATPase,又稱(chēng)H+-ATP酶或質(zhì)子移位膜ATP酶,是一種多亞基酶);而De等[26]在研究L.sanfranciscensisCB1的酸脅迫反應(yīng)中發(fā)現(xiàn),相對(duì)于未進(jìn)行酸脅迫處理的菌株,酸耐受菌株中有15種蛋白質(zhì)合成增加。此外,相關(guān)研究結(jié)果也表明,精氨酸脫亞氨基酶途徑在很多乳酸菌的酸耐受性中發(fā)揮重要作用,其原因在于精氨酸通過(guò)一系列反應(yīng)后被分解為NH3,從而降低環(huán)境中的pH,從而起到保護(hù)菌體的作用,如菌株LactococcuslactisMG1363[27]。

圖4 酸脅迫下菌株的生長(zhǎng)效率Fig.4 Growth efficiency of the selected strains under acid stress

2.5 溫度脅迫下的生長(zhǎng)效率

微生物的生長(zhǎng)與其環(huán)境溫度密切相關(guān),通常乳酸菌在37 ℃時(shí),生長(zhǎng)狀況較好,但是高于或低于此溫度均對(duì)其生長(zhǎng)不利。尤其在運(yùn)輸、儲(chǔ)藏或制劑化的過(guò)程中受到的溫度脅迫嚴(yán)重影響了菌體的結(jié)構(gòu)、活性及其產(chǎn)量,使益生菌的應(yīng)用受到限制[28-29]。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)定不同溫度來(lái)研究食竇魏斯氏菌在不同溫度脅迫下的生長(zhǎng)狀況。由圖5可知,與培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)的生長(zhǎng)效率相比,4 ℃時(shí)各菌株的生長(zhǎng)效率均較低,說(shuō)明各菌株在4 ℃時(shí),其生長(zhǎng)效率均能得到很好的抑制;當(dāng)培養(yǎng)溫度升至15 ℃時(shí),各菌株生長(zhǎng)效率較4 ℃時(shí)的生長(zhǎng)效率出現(xiàn)不同程度的升高,但HSG 01、HSG 02、HSG 08、HSG 09、HSG 10、HSG 11、HSG 13和HSG 16的生長(zhǎng)效率明顯低于自身菌株37 ℃時(shí)的生長(zhǎng)效率;當(dāng)培養(yǎng)溫度升至45 ℃時(shí),部分菌株的生長(zhǎng)效率較37 ℃時(shí)的生長(zhǎng)效率低,而HSG 02、HSG 06、HSG 08、HSG 09、HSG 10、HSG 11、HSG 13和HSG 16的生長(zhǎng)效率均高于37 ℃時(shí)的生長(zhǎng)效率,說(shuō)明這些菌株對(duì)高溫具有一定程度的耐受力。綜上所述,菌體對(duì)不同溫度脅迫時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)存在明顯差異,受到溫度脅迫時(shí),菌體適應(yīng)環(huán)境溫度變化的能力也各不相同。研究發(fā)現(xiàn),菌株對(duì)高溫脅迫或冷脅迫耐受力的不同與菌體自身分子伴侶的活性、細(xì)胞膜的流動(dòng)性及核糖體和RNA的穩(wěn)定性密切相關(guān)。高溫脅迫下產(chǎn)生的相關(guān)伴侶蛋白或蛋白酶可作用于損傷的蛋白質(zhì),從而提高菌體自身耐受高溫的能力,而在冷脅迫中產(chǎn)生的相關(guān)蛋白(冷誘導(dǎo)蛋白)則可改變菌體自身細(xì)胞膜的流動(dòng)性,DNA的超螺旋、轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而影響菌體的耐受力,改變程度的差異則導(dǎo)致最終耐受力的不同。因此,通過(guò)對(duì)菌株不同溫度脅迫下生長(zhǎng)效率的評(píng)價(jià)，可為后期生產(chǎn)中篩選具有耐受冷熱環(huán)境變化的菌株提供理論依據(jù)[30-31]。

圖5 溫度脅迫下菌株的生長(zhǎng)效率Fig.5 Growth efficiency of the selected strains under temperature stress

2.6 NaCl脅迫下的生長(zhǎng)效率

益生菌在工業(yè)應(yīng)用中的滲透壓脅迫主要以鹽脅迫為主,然而食品中添加適量的鹽雖然可以降低食品的水分活度,起到預(yù)防食品腐敗變質(zhì),延長(zhǎng)其保質(zhì)期的目的,同時(shí)也會(huì)造成滲透壓的改變,而滲透壓的改變能夠?qū)е戮w細(xì)胞體積變化和胞內(nèi)代謝發(fā)生紊亂,嚴(yán)重則導(dǎo)致細(xì)胞死亡[32]。因此,篩選具有耐受高滲環(huán)境的菌株對(duì)其后期功能性質(zhì)的發(fā)揮具有重要意義。由圖6可知,在不同濃度NaCl下,實(shí)驗(yàn)菌株間的生長(zhǎng)效率明顯不同;隨著鹽濃度的增加,菌株的生長(zhǎng)效率均呈下降趨勢(shì)。其中,HSG10對(duì)鹽的耐受性最佳,在8%鹽濃度下仍能保持較高的生長(zhǎng)效率(87.18%);而HSG03、HSG06和HSG07在4% NaCl脅迫時(shí),其生長(zhǎng)效率相對(duì)較低,分別為61.20%、57.00%和59.46%,表明其對(duì)鹽脅迫的耐受性差。研究表明,各菌株對(duì)NaCl脅迫表現(xiàn)出不同的耐受力，與誘導(dǎo)抗?jié)B透蛋白的表達(dá)和積累可混溶溶質(zhì)(K+、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸和甜菜堿)等物質(zhì)有關(guān)。這些物質(zhì)可以防止由于外部高滲透壓而引起的細(xì)胞內(nèi)水分的損失,確保細(xì)胞內(nèi)外的溶脹平衡,且不會(huì)干擾細(xì)胞的生理過(guò)程[33]。因此,篩選具有耐受一定濃度NaCl脅迫的菌株，為后期具有良好益生特性菌株的研究與應(yīng)用具有重要意義。

圖6 鹽脅迫下菌株的生長(zhǎng)效率Fig.6 Growth efficiency of the selected strains under salt stress

2.7 人工胃液中的存活率

人體胃液的pH約為3,當(dāng)機(jī)體空腹或攝入酸性食物時(shí),其pH會(huì)有所下降;而當(dāng)攝入堿性食物時(shí),pH會(huì)有所上升;此外,食物在胃中的消化時(shí)間通常為1～3 h[34]。因此,在益生菌篩選實(shí)驗(yàn)中,通常用pH3.0人工胃液處理菌株3 h來(lái)模擬體內(nèi)胃液消化情況,從而篩選出具有良好耐受胃酸消化能力的菌株。本實(shí)驗(yàn)基于酸脅迫、滲透壓脅迫和溫度脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取生長(zhǎng)效率相對(duì)較高的5株食竇魏斯氏菌(HSG 08、HSG 09、HSG 10、HSG 11、HSG 15)進(jìn)行人工胃液實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7。 由圖可知,5株食竇魏斯氏菌經(jīng)人工胃液處理后,其存活率均不同,存活率由高到低依次為HSG 08>HSG 09>HSG 11>HSG 15>HSG 10,HSG 08的存活率最高為70.55%,而HSG 10的存活率最低為18.80%。人工胃液處理即模擬人體胃腸道低酸環(huán)境篩選菌株,人工胃液中存活率的不同與菌體自身耐受低酸環(huán)境能力的差異密切相關(guān),其主要的可能機(jī)制也包括質(zhì)子泵機(jī)制、大分子保護(hù)和修復(fù)、堿生成、細(xì)胞密度及生物膜等[24]。

圖7 人工胃液中菌株的存活率Fig.7 Survival rates of the selected stains in simulated gastric fluid

2.8 膽鹽脅迫下的生長(zhǎng)效率

人體腸道中的膽鹽濃度介于0.03%～0.3%之間動(dòng)態(tài)波動(dòng),研究表明,腸道中的膽鹽對(duì)益生菌的生長(zhǎng)具有抑制或殺死作用[24]。因此,評(píng)價(jià)菌株對(duì)膽鹽的耐受能力也是篩選益生菌的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)基于酸脅迫、滲透壓脅迫和溫度脅迫實(shí)驗(yàn)選取的5株食竇魏斯氏菌(HSG 08、HSG 09、HSG 10、HSG 11、HSG 15)進(jìn)行膽鹽脅迫實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。5株食竇魏斯氏菌經(jīng)不同濃度膽鹽處理后,其生長(zhǎng)效率各不相同。在0.1%膽鹽脅迫下,5株食竇魏斯氏菌的生長(zhǎng)效率均較高,其生長(zhǎng)效率由高到低依次為HSG 08>HSG 09>HSG 11>HSG 15>HSG 10,其中HSG 08的生長(zhǎng)效率最高為72.06%,隨著膽鹽濃度的增加,5株食竇魏斯氏菌的生長(zhǎng)效率均明顯下降。研究表明,高濃度膽鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致菌株細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變、膜內(nèi)蛋白發(fā)生解離,從而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[35]。

圖8 膽鹽中菌株的生長(zhǎng)效率Fig.8 Growth efficiency of the selected strains in bile salt

3 結(jié)論

食竇魏斯氏菌由于其對(duì)機(jī)體健康的多種益生作用及其在發(fā)酵食品的風(fēng)味形成及發(fā)酵進(jìn)程中的重要作用而受到廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酸、溫度和NaCl脅迫實(shí)驗(yàn)研究16株食竇魏斯氏菌在不同脅迫下的生長(zhǎng)效率,結(jié)果表明HSG 08、HSG 09、HSG 10、HSG 11和HSG 15在酸脅迫下的生長(zhǎng)效率均高于45%,其中HSG 10的生長(zhǎng)效率最低為47.61%,HSG 08的生長(zhǎng)效率最高為82.77%。在45 ℃溫度脅迫下,HSG 02、HSG 06、HSG 08、HSG 09、HSG 10、HSG 11、HSG 13和HSG 16的生長(zhǎng)效率均高于37 ℃下的生長(zhǎng)效率,說(shuō)明這8菌株均具有一定耐受高溫的能力,而在15 ℃下,HSG 01、HSG 02、HSG 08、HSG 09、HSG 10、HSG 11、HSG 13和HSG 16的生長(zhǎng)效率明顯降低,說(shuō)明這8株菌在15 ℃下其活性在一定程度上得到有效的抑制。NaCl脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著其濃度的增加,各菌株的耐受性均逐漸減弱;在4% NaCl脅迫下,HSG 06的生長(zhǎng)效率最低為57.00%,而HSG 01、HSG 02、HSG 08、HSG 10、HSG 12、HSG 13、HSG 14、HSG 15和HSG 16的生長(zhǎng)效率均高于80%,其中HSG 15的生長(zhǎng)效率最高達(dá)93.91%。人工胃液和膽鹽耐受力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HSG 08經(jīng)人工胃液處理后,其存活率最高為70.55%,而HSG 10的存活率最低為18.80%;而膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著膽鹽濃度的增加,實(shí)驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)效率明顯降低,在0.1%膽鹽下,HSG 08的生長(zhǎng)效率最高為72.06%,HSG 10的生長(zhǎng)效率最小為56.57%。綜上所述,HSG 08對(duì)不同環(huán)境脅迫均表現(xiàn)出很好的耐受力,因此可用于下一步益生特性菌株的研究。